肿瘤的转移

c***u

贡献于2012-02-12

字数:7699

肿瘤转移
摘：TGFβ明显促进高级恶性肿瘤转移已知蛋白质编码基参程TGFβ诱导细胞迁移侵袭程中miRNA作相关信息然限通杂交515miRNA基寡核苷酸微阵列库发现28miRNATGFβ治疗正常鼠乳腺（NMuMG）皮细胞明显解调整Smad4针NMuMG细胞作调miRNA中miR155明显提高miRNATGFβ通Smad4诱导miR155表达启动子活性miR155减少会抑制TGFβ诱导皮间质转换（EMT）紧密连接解会抑制细胞迁移侵袭miR155异位表达会减少RhoA蛋白破坏紧密连接形成次引入3′端非编码区RhoA cDNA会程度转变miR155TGFβ诱导表型外侵润性乳腺癌组织中常检测miR155水提高数显示TGFβ诱导EMT细胞迁移侵袭方面miR155通靶RhoA方式起重作暗示miR155乳腺癌干预潜治疗靶点
前言
肿瘤转移已造成肿瘤患者死亡原解原发性肿瘤转移细胞分子机制具重意义程中EMT着重意义EMT重例子细胞塑性方面包括紧密连接裂解粘连连接调节细胞结构重建皮细胞粘连细胞骨架部分缺失间质细胞协作引起转移起始步骤
EMT作重调节子TGFβ晚期肿瘤中促进肿瘤侵袭转移已公认TGFβ复杂跨膜丝氨酸苏氨酸激酶结合TβRⅠTβRⅡ配体结合TβRⅡTβRⅠ配体受体组成复合物TβRⅡ反作激活TβRⅠ活化TβRⅠ促进Smad2Smad3磷酸化两者磷酸化Smad4结合作异常复合物转移细胞核直接连接Smad成分连接转录子协子拮抗子结合进诱导转录抑制序列基研究表明肿瘤生长转移众相关基通途径直接调节作机制包括诱导COX2\Slug\Snail\TwisT抑制Id2 Id3报导 miR200家族调EMT程中重意义miRNA调TGFβ诱导EMT作未知miRNA组高度保守非编码RNA22核苷酸组成基表达中起负性调节作象般蛋白编码RNA样miRNA转录RNA聚合酶Ⅱ调控子完成初级转录RNA 帽状修饰腺苷酸修饰核糖核酸酶处理辅助子DGCR8产生前体miRNA含茎环结构60－70核苷酸miRNA通exportin5
RanGTP赖方式迅速运细胞浆细胞浆中核糖核酸酶进步修饰形成含约22核苷酸成熟miRNA成熟miRNA进入诱导RNA沉默复合物复合物引靶MRNA非编码区程触发非退化翻译抑制引起miRNA靶MRNA间互补程度决定根已知算法预测miRNA数百数千靶MRNA通分析miRNA种类恶性肿瘤中调晚期肿瘤肿瘤预相关miRNA原发性肿瘤转移起关键作
天学中通TGFβ\Smad途径分析正常乳腺皮细胞中EMT miRNA标志物发现miR－155TGFβ\Smad途径中直接转录靶子间接TGFβ诱导EMT异位表达miR－155细胞间紧密连接断裂促进细胞间移动入侵相反减少miR－155降低TGFβ诱导EMT减少细胞移动侵袭进步发现miR－155降低RhoA表达没miR－155诱导产生表型表达修复RhoA作靶点乳腺皮细胞起重作
材料方法
细胞株处理肿瘤标
NMuMG皮细胞美国购买
细胞保持加10％牛血清培养基中TGFβ处理数次细胞转染脂体2000完成冰冻乳房肿瘤组织正常乳房组织肿瘤中心病提供肿瘤组织标切片显微镜包含70％肿瘤细胞
结果
miRNA表达分TGFβ诱导EMTSmad4缺失NMuMG细胞分析
TGFβ\Smad途径原发性肿瘤侵袭中起重作目前已发现众编码蛋白基通TGFβ\Smad调控间接显示TGFβ功NMuMG细胞中TGFβ诱导EMT作细胞水模型广泛应肿瘤转移中分子机制研究miRNA表达信号特征未完全阐明通miRNA微阵分析mRNA表达中变化解miRNATGFβ诱导EMT细胞转移侵袭间相关性相关已表明包括NMuMG细胞细胞株里缺失Smad4情况未进行EMT(TGFβ处理)利Smad4短链发夹RNA稳定转染NMuMG细胞中Smad4水降达80％相反Smad4缺失NMuMG细胞TGF
β处理进行EMT2组细胞均TGFβ处理分02436时取miRNA标记物包含515miRNAs显示28种调节miRNA亲代细胞Smad4缺失NMuMG细胞（TGFβ处理02436时时候检测P<005）28种显示miRNA中TGFβ处理24时36时时候9种表达调19种表达调芯片显示miRNA家簇中let7mi－30始终保持调调节常时发生先前研究致发现miR200cmiR205间质细胞表型中明显调miR155 miR214 miR21 miR322实验中明显调利Northern blotQrtPCR挑选5种明显受调节miRNA测定芯片数准确性
接分析TGFβ调节miRNA启动子中否Smad4结合位点含6－KB DNA区域（5－kb 游1－kb 游区位置前miRNA完成时致）片断（作miRNA启动子）分析MATCHTRANSFAC完成受TGFβ制约miRNA启动子中鼠中包含着Smad4结合位点更加提示miRNA通TGFβ\Smad途径调节TGFβ诱导EMT中产生重作
miR155TGFβ\Smad途径中直接靶点
miR155TGFβ处理NMuMG细胞中表达明显升转移中起作尚明确研究miR155否直接TGFβ\Smad途径调节前miR155转录起动点基克隆1－kb游区鼠起动子序列分析显示2Smad区域分位转录起始点bp542454miR155启动子保守区显示miR155启动子亲代NMuMG细胞中通TGFβ启动Smad4缺乏NMuMG细胞未发现活化缺失定位法发现第Smad4结合位点负责TGFβ诱导miR155启动子活化解Smad4否体直接启动子中Smad结合位点结合利Chip测定分TGFβTGFβ处理NMuMG细胞2时Smad4抗体进行免疫组化Smad4TGFβ处理结合启动子发现表明miR155TGFβ\Smad途径中直接转录靶点
miR155促进TGFβ诱导EMT紧密连接断裂细胞迁移侵袭
接评估miR155否TGFβ诱导EMT中起作首先NMuMG细胞分ASO against miR155进行转染分TGFβTGFβ处理TGFβ处理miR155 ASO效减少miR155诱导产生相应开始24时没TGFβ处理细胞缺失miR155情况改变明显减少免疫荧光染色法24时时候检测E钙粘蛋白ZO1显示TGFβ处理control ASO NMuMG细胞中紧密连接已断裂缺乏miR155细胞紧密连接完整保留者缺乏miR155情况TGFβ调E钙粘蛋白作消失单独异位表达miR155充分诱导EMT破坏细胞极性紧密连接断裂进步发现度表达miR155细胞12时历次完整TGFβ诱导EMT24时36时相正常亲代组细胞TGFβ产生反应总E钙粘蛋白水miR155转染细胞中明显低TGFβ处理12带菌细胞水
者测定miR155细胞迁移侵袭程中起作三次连续实验证明稳定表达miR155双倍促进细胞迁移时度稳定表达miR155加强细胞侵袭相miR155缺失明显减少细胞迁移侵袭总言miR155TGFβ诱导EMT细胞迁移侵袭起着重作

miR155PhoA调
GFβ处理miR155NMuMG细胞中表达明显升间接作EMT细胞迁移侵袭利RNA22 MiRNA 靶测定MiRBase资料库继续测定EMT中存靶点已调查研究中发现PhoA基 3－UTR(细胞连接构造稳定性中起重作)包含3高度保守区域利RNA22运算作miR155结合位点
进步确定PhoA基否miR155作靶点免疫印迹RTPCR分析显示miR155转染细胞中PhoA蛋白明显调PhoA mRNA预测致TGFβ处理减少PhoANMuMG细胞中表达水缺乏miR155情况TGFβ抑制PhoA蛋白表达作明显减弱miR155通降低PhoA促进EMT进行相反异常表达PhoA阻止EMT进行确实pcDNA3RhoA引入miR155转染TGF
β处理24时NMuMG细胞时EMT进行阻止异常表达PhoA减少miR155诱导细胞紧密连接断裂结果显示PhoAmiR155作靶点通间接影响miR155达控制细胞塑性
先前研究已表明通泛素－蛋白激酶途径TGFβ调PhoA蛋白表达进步解蛋白降解miR155通TGFβ调PhoA重意义图示MG132单独缺乏miR155完全抑制TGFβPhoA调相反MG132miR155AOS联合阻止TGFβPhoA调作
进步确定miR155调PhoA3高度保守区域进行荧光标记检测miR155结合位点培育36时荧光法测定显示位点荧光活性异常表达miR155消减中结合位点12更明显位点改变miR155荧光标记物产生抑制接检测完整PhoA基3－UTR否TGFβ通miR155调节结果显示完整reporterTGFβ产生反应种反应miR155 ASO 引入细胞时明显减弱缺失Smad4NMuMG细胞进行相实验显示完整reporterTGFβ产生反应相反PhoA基3－UTRmiR155TGFβ反应
miR155浸润性乳腺癌中表达
前述miR155间接作TGFβ诱导EMT细胞迁移侵袭miR155类浸润性乳腺癌否关系呢？62份乳腺肿瘤标（17份非侵袭性45份侵袭性）5份正常乳腺样中检测miR155miRNA核酸原位杂交RTPCR分析显示45例侵袭性肿瘤中41份标miR155明显升高17份非侵袭性肿瘤中2份miR155升高正常乳腺组织中miR155表达微弱结果提示着miR155EMT细胞侵袭着莫关系乳腺肿瘤侵袭转移起着重作
讨
众研究已表明TGFβ途径乳腺肿瘤侵袭中起重作TGFβ信号乳腺癌侵袭控制中TGFβSmad 调节基已显示出相关性天学中报导NMuMG皮细胞里TGFβ诱导进行EMT程中miRNA表达特征亲代NMuMG细胞中28miRNATGF
β发现受约束缺乏Smad4NMuMG细胞未现象miR155明显调miRNATGFβ诱导EMT细胞迁移侵袭起着重作miR155调PhoA度表达miR155细胞保恢复PhoA减少TGFβ miR155诱导细胞紧密连接断裂者高度表达miR155侵袭性乳腺肿瘤密切关系发现非常意义原1显示乳腺皮细胞里TGFβSmad途径中miRNA重表现特征次EMT程中TGFβSmadmiR155建立直接关系首次发现PhoA基miR155直接作靶点
miR155BIC基产物众类恶性肿瘤B细胞淋巴瘤乳腺癌肺癌卵巢癌结肠癌等高度表达Eummu miR155转基鼠制定B细胞恶性肿瘤模型中miR155缺乏鼠免疫功受损转录子Pu1直广泛认miR155介导免疫程中直接作靶点外miR155抑制肿瘤蛋白53诱导核蛋白1认导致胰腺癌发生发展者NFkBAP1转录子调控miR155表达miR155细胞迁移侵袭程中功未阐明研究首次证实TGFβSmad途径miR155明显调间接影响TGFβ诱导EMT细胞侵袭
miRNA靶位点间匹配序列方面已众研究miRNA通碱基配负性调节靶mRNA导致mRNA降解翻译抑制作决定miRNA序列mRNA 3UTR匹配程度例种子序列完美3UTR匹配时miRNA便诱导mRNA降解种子序列3UTR部分匹配时会抑制翻译外结合位点信进行UN碱基配时消耗量程miRNA靶位点更容易结合事实认mRNA二级结构促进靶位点识Kertes2等发现seeding区域位点易接触性碱基配样重miRNA功需核苷酸靶位点结合形成成达稳定学方式通RNA22系统发现miR155种子序列PhoA基3UTR里区域结合性众位点中选出符合述条件高度保守三位点PhoA基3UTR探针发现miR155三位点荧光素活性均明显减少更接体条件环境克隆完整PhoA基3UTRTGFβ代异常表达miR155结果意料中完整PhoA基3UTRTGFβ产生反应miR155缺失亲代NMuMG细胞抑制缺失Smad4细胞中抑制PhoA原Rho GTPase家族中1名家族许细胞进程细胞粘连运动极性中起着调节作
PhoA细胞构成稳定重调节基研究表明TGFβ通泛素降解PhoA诱导紧密连接细胞极性破坏促进EMT研究发现TGFβ通调miR155调PhoA蛋白表达TGFβ调节PhoA提供新分子机制miRNA调节细胞阻碍蛋白翻译提供条途径迅速抑制蛋白翻译机制研究早期研究TGFβ泛素PhoA降解紧密连接次研究显示miR155诱导作阻止PhoA翻译泛素降解PhoA蛋白根电脑程序计算种miRNA百编码蛋白mRNA起负性调节作发现PhoA源病毒负性调节作强180mRNA中包括编码细胞迁移侵袭相关蛋白mRNAGSK3PCSK5 Rho GTPase 活化蛋白21PhoAmiR155作细胞极性EMT细胞侵袭靶点唯作靶点
外项研究描述角质细胞TGFβ处理miRNA表达4miRNA明显调4miRNA明显调8种调节miRNA中miRNAmiR－21研究相关差应细胞株样TGFβ处理维持时间样关期研究显示着miR200家族调TGFβ诱导EMT中起着重作研究相似研究显示miR200家族成员研究中未检测导致结果原miRNA分析细胞株先前研究细胞株样外发现miR155侵袭性乳腺肿瘤组织中表达明显升高相似项研究发现miR155转移性乳腺肿瘤细胞株中表达升高非转移性乳腺肿瘤细胞株没现象解miR155缺失抑制TGFβ调E钙粘蛋白作相反异位表达miR155增强TGFβE钙粘蛋白调节作序列分析显示miR155种子序列E钙粘蛋白3UTR基匹配miR155调E钙粘蛋白机制等进步研究
总证明乳腺皮细胞TGFβSmad诱导EMT程中miRNA表达特征28miRNA启动子少含Smad4连接结合位点miR155通作靶点PhoA实现TGFβSmad途径诱导EMT细胞迁移侵袭中起作外miR155侵袭性乳腺肿瘤密切相关miR155乳腺肿瘤潜预子介入治疗作靶点

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