核酸检测基知识
1什核酸检测
核酸定义：核酸核苷酸脱氧核苷酸通3′5′磷酸二酯键连接成类生物分子
核酸具非常重生物功贮存遗传信息传递遗传信息
2核酸分类
核酸分子分两类：脱氧核糖核酸（DNA）核糖核酸（RNA）
3核酸组成
DNARNA核苷酸(nucleotide)头尾相连形成CHONP5种元素组成DNA绝数生物遗传物质RNA少数含DNA病毒（HIV病毒流感病毒SARS病毒等）遗传物质RNA均长度约2000核苷酸DNA长约3X10^9核苷酸
4核酸功
蛋白质复制合成中起着储存传递遗传信息作核酸仅基遗传物质蛋白质生物合成占重位置生长遗传变异等系列重生命现象中起决定性作
DNARNA核酸化学组成什区：
DNARNA较
DNA
RNA
存部位
细胞核
细胞质
基组成单位
脱氧核苷酸
核糖核苷酸
碱基种类
AGCT
AGCU
五碳糖种类
脱氧核糖
核糖
核苷酸链
两条脱氧核苷酸链
条核糖核苷酸链
5检测方法
核酸检测方法通时进行靶核酸扩增检测信号生成检测样品中靶核酸应床微生
物学血液筛选遗传病诊断预防法医学等领域核酸检测
目前方法种：
a核酸序列赖性扩增法
NASBA引物介导连续均体外特异性核苷酸序列等温扩增RNA新技术反应42℃进行2hRNA模板扩增约109倍NASBA原理提取病毒RNA加入AMV逆转录酶RNA酶HT7RNA聚合酶引物进行扩增整反应分非循环相循环相非循环相中引物I模板RNA退火AMV逆转录酶作合成cDNA形成RNADNA杂合体RNaseH降解RNA引物ⅡcDNA退火反转录酶作合成第2条DNA互补链双链DNAT7RNA聚合酶作启动子序列起动转录RNARNA反转录酶作反转录成DNA进入循环相模板进行量扩增
b转录介导扩增技术
TMA技术原理NASBA基致略处TMA利MMLV逆转录酶T7RNA聚合酶两种酶MMLV逆转录酶逆转录酶活性具RNA酶H活性反应415℃进行1hRNA模板扩增约109倍
c连接酶酶促链式反应(LCR)
LCR基靶分子赖寡核苷酸探针相互连接种
探针扩增技术继PCR新发展种较前景体外扩增技术原理2段寡核苷酸单链DNA探针目标序列杂交该2段DNA探针没发生突变模板褪火果2探针紧邻中间没核苷酸间隔连接酶作连接起连接新链作模板引导周期连接产生新子链连接区段发生核苷酸碱基突变连接反应发生扩增反应终止
d聚酶链反应检测法(PCR)
PCR技术基原理类似DNA天然复制程特异性赖靶序列两端互补寡核苷酸引物PCR变性—退火—延伸三基反应步骤构成
①模板DNA变性：模板DNA加热93℃左右定时间模板DNA双链PCR扩增形成双链DNA解离成单链便引物结合轮反应作准备
②模板DNA引物退火(复性)：模板DNA加热变性成单链温度降55℃左右引物模板DNA单链互补序列配结合
③引物延伸：DNA模板—引物结合物TaqDNA聚合酶作dNTP反应原料靶序列模板碱基配半保留复制原理合成1条新模板DNA链互补半保留复制链重复循环变性—退火—延伸三程获更半保留复制链种新链成次
循环模板完成1循环需2～4min2～3h扩目基扩增放百万倍检测HIVRNA需先利逆转录反应RNA转录cDNA继cDNA模板进行PCR扩增样反应称RTPCR
e实时荧光定量PCR技术
实时荧光定量PCR技术指PCR反应体系中加入荧光基团利荧光信号实时监测整PCR进程通标准曲线未知模板进行定量分析方法
技术原理荧光基团标记探针5′端标记荧光基团R3′端标记淬灭基团Q没PCR扩增时荧光基团淬灭基团空间距离荧光基团淬灭发荧光PCR扩增时引物荧光标记特异性探针时结合模板荧光标记探针模板结合位置位游引物间利Taq酶5′3′外切酶活性荧光探针水解荧光基团释放出空间淬灭基团分开发出荧光发出荧光荧光探头检测边扩增边检测样实现实时检测该技术仅实现PCR半定量定量飞跃常规PCR相具特异性强动化程度高效解决PCR污染问题等特点
f支链DNA检测法——bDNA
bDNA定量检测血浆中HIV1型RNA种方法bDNA指工合成带侧链DNA片段侧链
标记激发标记物HIVRNA通离心病毒颗粒中释放出然捕获探针1捕获微孔中捕获探针2病毒RNA部分特异结合预放探针结合者放探针bDNA探针杂交两套靶探针分病毒RNApol基区域特异结合微孔中形成HIVRNA寡核苷酸复合物加入1种化学发光底物孵育放化学发光信号通发光强度定量发光强度样品中HIVRNA含量成例bDNA存扩增物交叉污染较PCR进步bDNA数十覆盖整基组探针方便检测HIV某变异株灵敏度PCR提高bDNA灵敏度难点
检测步骤
HIV核酸定性检测技术检测程分核酸提取逆转录合成cDNAPCR扩增反应扩增产物定性分结果判定完成报告单
6实验室检测具体步骤：
a核酸提取
硅胶柱离心磁性硅胶颗粒分离方法动化仪器等商品化试剂设备说明书操作提取RNA时应注意防止RNA降解DNA应置20℃保存RNA需长期保存DNA应置80℃保存
b逆转录合成cDNA
逆转录cDNA合成反应需逆转录引物dNTPs逆转录酶RNA酶抑制剂DTT缓液适量RNADNA酶超纯水RNA模板扩增仪水浴箱中规定温度时间进行逆转录反应建议商品化RTPCR步法试剂进行第轮扩增反应逆转录cDNA合成反应需逆转录引物dNTPs逆转录酶RNA酶抑制剂DTT缓液适量RNADNA酶超纯水RNA模板扩增仪水浴箱中规定温度时间进行逆转录反应商品化RTPCR步法试剂进行第轮扩增反应
cPCR扩增反应（二次扩增套式PCR扩增方法）
PCR反应需引物dNTPsDNA聚合酶（Taq酶等）缓液适量RNADNA酶超纯水模板（DNAcDNA）扩增仪中设定程序进行扩增二次扩增套式PCR扩增方法
e扩增产物定性分析
扩增产物常分析方法琼脂糖凝胶电泳法分子量标准较判断扩增片段否预期分子量范围扩增产物分析方法限制性切酶酶切分析特异性探针杂交分析DNA序列分析等动化核酸扩增仪酶联色分析荧光探针杂交等原理测定
f结果判定完成报告单
（1）实验成立条件：次检测需时做两阳性
两阴性阳性扩增出预期片段阴性没扩增出片段双份行样品结果致情况实验成立作出核酸阳性阴性反应结果判定
（2）HIV核酸检测阳性：发现核酸阳性反应应该重复采集样品进行复测复测结果呈核酸阳性反应判定核酸阳性复测结果核酸阴性反应判确定结果需进步访检测
（3）HIV核酸检测阴性：报告次实验结果阴性
（4）应完成检测5工作日发出检测报告
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1什核酸检测
核酸定义：核酸核苷酸脱氧核苷酸通3′5′磷酸二酯键连接成类生物分子
核酸具非常重生物功贮存遗传信息传递遗传信息
2核酸分类
核酸分子分两类：脱氧核糖核酸（DNA）核糖核酸（RNA）
3核酸组成
DNARNA核苷酸(nucleotide)头尾相连形成CHONP5种元素组成DNA绝数生物遗传物质RNA少数含DNA病毒（HIV病毒流感病毒SARS病毒等）遗传物质RNA均长度约2000核苷酸DNA长约3X10^9核苷酸
4核酸功
蛋白质复制合成中起着储存传递遗传信息作核酸仅基遗传物质蛋白质生物合成占重位置生长遗传变异等系列重生命现象中起决定性作
DNARNA核酸化学组成什区：
DNARNA较
DNA
RNA
存部位
细胞核
细胞质
基组成单位
脱氧核苷酸
核糖核苷酸
碱基种类
AGCT
AGCU
五碳糖种类
脱氧核糖
核糖
核苷酸链
两条脱氧核苷酸链
条核糖核苷酸链
5检测方法
核酸检测方法通时进行靶核酸扩增检测信号生成检测样品中靶核酸应床微生
物学血液筛选遗传病诊断预防法医学等领域核酸检测
目前方法种：
a核酸序列赖性扩增法
NASBA引物介导连续均体外特异性核苷酸序列等温扩增RNA新技术反应42℃进行2hRNA模板扩增约109倍NASBA原理提取病毒RNA加入AMV逆转录酶RNA酶HT7RNA聚合酶引物进行扩增整反应分非循环相循环相非循环相中引物I模板RNA退火AMV逆转录酶作合成cDNA形成RNADNA杂合体RNaseH降解RNA引物ⅡcDNA退火反转录酶作合成第2条DNA互补链双链DNAT7RNA聚合酶作启动子序列起动转录RNARNA反转录酶作反转录成DNA进入循环相模板进行量扩增
b转录介导扩增技术
TMA技术原理NASBA基致略处TMA利MMLV逆转录酶T7RNA聚合酶两种酶MMLV逆转录酶逆转录酶活性具RNA酶H活性反应415℃进行1hRNA模板扩增约109倍
c连接酶酶促链式反应(LCR)
LCR基靶分子赖寡核苷酸探针相互连接种
探针扩增技术继PCR新发展种较前景体外扩增技术原理2段寡核苷酸单链DNA探针目标序列杂交该2段DNA探针没发生突变模板褪火果2探针紧邻中间没核苷酸间隔连接酶作连接起连接新链作模板引导周期连接产生新子链连接区段发生核苷酸碱基突变连接反应发生扩增反应终止
d聚酶链反应检测法(PCR)
PCR技术基原理类似DNA天然复制程特异性赖靶序列两端互补寡核苷酸引物PCR变性—退火—延伸三基反应步骤构成
①模板DNA变性：模板DNA加热93℃左右定时间模板DNA双链PCR扩增形成双链DNA解离成单链便引物结合轮反应作准备
②模板DNA引物退火(复性)：模板DNA加热变性成单链温度降55℃左右引物模板DNA单链互补序列配结合
③引物延伸：DNA模板—引物结合物TaqDNA聚合酶作dNTP反应原料靶序列模板碱基配半保留复制原理合成1条新模板DNA链互补半保留复制链重复循环变性—退火—延伸三程获更半保留复制链种新链成次
循环模板完成1循环需2～4min2～3h扩目基扩增放百万倍检测HIVRNA需先利逆转录反应RNA转录cDNA继cDNA模板进行PCR扩增样反应称RTPCR
e实时荧光定量PCR技术
实时荧光定量PCR技术指PCR反应体系中加入荧光基团利荧光信号实时监测整PCR进程通标准曲线未知模板进行定量分析方法
技术原理荧光基团标记探针5′端标记荧光基团R3′端标记淬灭基团Q没PCR扩增时荧光基团淬灭基团空间距离荧光基团淬灭发荧光PCR扩增时引物荧光标记特异性探针时结合模板荧光标记探针模板结合位置位游引物间利Taq酶5′3′外切酶活性荧光探针水解荧光基团释放出空间淬灭基团分开发出荧光发出荧光荧光探头检测边扩增边检测样实现实时检测该技术仅实现PCR半定量定量飞跃常规PCR相具特异性强动化程度高效解决PCR污染问题等特点
f支链DNA检测法——bDNA
bDNA定量检测血浆中HIV1型RNA种方法bDNA指工合成带侧链DNA片段侧链
标记激发标记物HIVRNA通离心病毒颗粒中释放出然捕获探针1捕获微孔中捕获探针2病毒RNA部分特异结合预放探针结合者放探针bDNA探针杂交两套靶探针分病毒RNApol基区域特异结合微孔中形成HIVRNA寡核苷酸复合物加入1种化学发光底物孵育放化学发光信号通发光强度定量发光强度样品中HIVRNA含量成例bDNA存扩增物交叉污染较PCR进步bDNA数十覆盖整基组探针方便检测HIV某变异株灵敏度PCR提高bDNA灵敏度难点
检测步骤
HIV核酸定性检测技术检测程分核酸提取逆转录合成cDNAPCR扩增反应扩增产物定性分结果判定完成报告单
6实验室检测具体步骤：
a核酸提取
硅胶柱离心磁性硅胶颗粒分离方法动化仪器等商品化试剂设备说明书操作提取RNA时应注意防止RNA降解DNA应置20℃保存RNA需长期保存DNA应置80℃保存
b逆转录合成cDNA
逆转录cDNA合成反应需逆转录引物dNTPs逆转录酶RNA酶抑制剂DTT缓液适量RNADNA酶超纯水RNA模板扩增仪水浴箱中规定温度时间进行逆转录反应建议商品化RTPCR步法试剂进行第轮扩增反应逆转录cDNA合成反应需逆转录引物dNTPs逆转录酶RNA酶抑制剂DTT缓液适量RNADNA酶超纯水RNA模板扩增仪水浴箱中规定温度时间进行逆转录反应商品化RTPCR步法试剂进行第轮扩增反应
cPCR扩增反应（二次扩增套式PCR扩增方法）
PCR反应需引物dNTPsDNA聚合酶（Taq酶等）缓液适量RNADNA酶超纯水模板（DNAcDNA）扩增仪中设定程序进行扩增二次扩增套式PCR扩增方法
e扩增产物定性分析
扩增产物常分析方法琼脂糖凝胶电泳法分子量标准较判断扩增片段否预期分子量范围扩增产物分析方法限制性切酶酶切分析特异性探针杂交分析DNA序列分析等动化核酸扩增仪酶联色分析荧光探针杂交等原理测定
f结果判定完成报告单
（1）实验成立条件：次检测需时做两阳性
两阴性阳性扩增出预期片段阴性没扩增出片段双份行样品结果致情况实验成立作出核酸阳性阴性反应结果判定
（2）HIV核酸检测阳性：发现核酸阳性反应应该重复采集样品进行复测复测结果呈核酸阳性反应判定核酸阳性复测结果核酸阴性反应判确定结果需进步访检测
（3）HIV核酸检测阴性：报告次实验结果阴性
（4）应完成检测5工作日发出检测报告
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