毕业文引言
1 引言
核苷酸衍生物食品医学农业化妆品生化试剂等领域具十分广泛途尤国核苷酸需求量进口方面缺口[1]目前核苷酸生产工艺完善利酶解法生产核苷酸酶解工艺条件研究国报道少国吴莉莉等利双酶法降解核酸生产呈味核苷酸i+g[2]杨斌等利酶解法生产呈味核苷酸生产进行述未酶解核酸工艺条件进行优化摸索工作
目前核苷酸三种生产方法相较言酶解法成低时生产四种产品明显优两种生产方法酶解法利原料rna啤酒废酵母中提取解决啤酒厂废酵母出路做资源生利提取rna废酵母考虑综合利产生更济效益社会效益然酶解法生产四种核苷酸优越性该方法中存着问题1原料质量差目前国rna纯度80左右溶解存量杂蛋白降低酶解率杂蛋白存增加分离难度2生产菌株水低：利桔青霉作生产核酸酶p1菌株生产酶活仅国外菌株60rna酶解率仅7085国外酶解率达85953离交分离收率低：方面酶解彻底存许杂质寡聚核苷酸等增加分离难度方面分离材料选择性差5’核苷酸吸附容量高效分离四种核苷酸4结晶技术关
通rna水解实验研究rna水解条件进步优化出水解rna佳工艺单核苷酸应领域
11 核糖核酸酶
111 概述
20世纪60年代核糖核酸酶作种模型蛋白普遍分子生物学研究核糖核酸酶（rnase）全名聚核苷α寡核苷酸转移酶类广泛存动植物体水解核酸链中磷酸二酯键酶酶核酸作水解核苷酸残基间磷酸二酯键生成寡聚核苷酸单核苷酸rnase生理功控制细胞rna种类数量分布参核糖核酸转录剪切修饰降解等程外某植物交亲性器官发生宿防御机制控制肿瘤血生成杀灭肿瘤细胞抑制病毒复制等关[3]
112 核糖核酸酶分类
根酶作核酸分子部位分3’磷酸二酯酶5’磷酸二酯酶根反应适ph分酸性核糖核酸酶碱性核糖核酸酶酸性核糖核酸酶存细胞溶酶体中水解吞噬异物中rna碱性核糖核酸酶存胞液中水解胞液中rna根降解rna底物般分3类：rnase〖饶艽呋rna 水解催化dna水解产生5’单核低聚核糖核苷酸5’单核低聚脱氧核糖核苷酸rnase⒔鍪rna释放2’3’环状嘌呤核糖核苷酸3’嘌呤核糖核苷酸rnaseＶ凰解rna释放2’3’环状嘌呤嘧啶核糖核苷酸3’嘌呤嘧啶核糖核苷酸根酶作专性[2]分核酸外切酶①蛇毒磷酸二酯酶：毒蛇毒液中提取核酸单链3’oh端开始水解生成5’单核苷酸该酶适ph9ca2+mg2+激活剂原剂螯合剂抑制酶活力②脾磷酸二酯酶：牛脾中提取水解产物3’单核苷酸核酸切酶：核酸酶s1米曲霉菌中提取出单链专性切酶产生5’单核苷酸适ph4550
需zn2+co2+刺激酶活力mg2+ca2+cu2+效该酶热较稳定底物存时65℃保温失活切兼外切酶：核酸酶p1桔青霉制称桔青5’磷酸二酯酶纯化p1酶单链专适温度70℃适ph5zn2+激活剂8moll尿素5moll盐酸胍抑制酶活性核酸酶p1酶具3’磷酸单酯酶活性水解3’单核苷酸核苷二磷酸3’二核苷酸3’磷酸键核酸酶p1酶常常制备5’单核苷酸
113 核糖核酸酶结构性质
核糖核酸酶二级结构含两独立折叠结构域结构域部环区两侧螺旋区组成a环b环含高度保守核苷酸序列底物切割位点a环4螺旋区核苷酸序列变化中a结构域两螺旋区h1h2底物特异性结合部位ab两折叠结构域通三级结构相互作形成功复合体二价金属离子够促进功域相互作发现惰性渡元素钴三价金属离子络合物co (nh3)63+价金属离子起二价镁离子作价金属离子镁离子效镁离子拮抗作co(nh3)63+协作ph值发夹状核糖核酸酶反应速率影响金属离子结合oh2起般碱催化作外切割位点硫代磷酸修饰抑制酶活性提示发夹状核糖核酸酶催化机制核糖核酸酶核糖核酸酶种类水解rna水解量水解机理相表现出种性质性质纳：①酶热稳定性：55℃酶活力基稳定65℃约50活力损失该酶锌酶酶液中补充锌离子提高酶热稳定性②zn2+浓度酶热稳定性影响：酶液中加入浓度zn2+70℃热处理20min激活强化5’磷酸二酯酶活性③温度酶活性影响：70℃左右时酶活力高温度升高降低酶活力降④酶ph稳定性：酶液稳定范围ph50ph80
间⑤ph酶活性影响：反应分醋酸缓液种ph条件进行外均测酶活方法进行ph值5060时酶活力高[3]
114 核糖核酸酶应
规模生产5’核苷酸核糖核酸酶途5’核苷酸动植物性食物味道基成分尤中鸟苷磷酸(gmp)肌苷磷酸(imp)等域值时呈现种身独特美味域值时增加食品鲜味作食品鲜味添加剂5’核苷酸酵母浸出液部分水解物种途径生产5’核苷酸产量较低(6)核糖核酸酶酵母浸出液生产5’核苷酸产量提高20左右年桔青霉等微生物生产核酸酶p1毒理研究逐步深入gaburdock等核酸酶p1导致毒性突变性研究揭示核酸酶白鼠没毒性致突变性预测快直接微生物发酵生产核酸酶p1作食品添加剂
12 核糖核酸酶制备
工业水解核酸核糖核酸酶麦芽根中提取核糖核酸酶桔青霉发酵核酸酶p1两种制酶方法制酶酶活说发酵液酶活较麦芽根中提取高发酵法生产酶成麦芽根中提取酶成高
121 麦芽根中提取核酸酶
麦芽根麦芽生产啤酒程中副产物目前般作饲料年着研究深入发现麦芽根中蛋白含量高氨基酸组成合理麦芽根占麦总投量3国啤酒生产规模较麦芽根数量相观麦芽根中提取5’磷酸二酯酶方法简单易行含量丰富常麦芽根中制核酸酶水解核酸
wf iers等研究发现采干磨法粉碎麦芽根ph285范围水进行提取ph酶提取率影响极提高离子强度显著提高率率提高数倍麦芽根组成中蛋白含量约2535蛋白质提取率足30蛋白质提取率酶提取尚潜力事实充分酶提取出成利麦芽根核酸酶首问题麦芽根利济性重前提
通常采定离子强度水麦芽根中提取核酸酶利麦芽根中酶溶出溶出酶种酶杂酶液核酸酶zn2+存条件热稳定性高杂酶液中加入zn2+70℃恒温水浴20min灭杂酶较纯核酸酶液通紫外分光光度法测酶活
流程：
麦芽根→粉碎→筛→加水→调ph→加离子→恒温水浴→加znso4→灭杂酶→酶液
122 桔青霉发酵核酸酶p1
核酸酶p1生产方法3种：固体发酵法深层液态发酵法固定化液体发酵法固体发酵( solid2statefermentationssf)操作简单成低利麸皮等农作物原料够较高酶活粗酶液农产品成分非常复杂想获纯核酸酶p1较困难繁琐
深层液态发酵法利现代发酵技术通装发酵罐中种感应器较控制发酵程原料配较明确通常液体发酵工艺条件：合成液体培养基通
风1∶04发酵温度30℃培养时间50～70 h生产厂家工艺条件身菌种设备调整总体说液态发酵菌丝体发酵液较易分离核苷酸发酵中
年固定化液体发酵法国外快速发展菌丝体固定谷梗惰性材料重复提高细胞利率生物反应速率便产物分离特利某惰性材料作载体保持酶活时简化发酵液成分便核酸酶提取纯化yang zhu等研究聚亚安酯惰性载体液体发酵生产核酸酶p1惰性载体发酵条件进行优化结果表明酶产率深层发酵提高4～20倍
液体培养流程：斜面培养→种子培养→发酵罐→酶液
固体培养流程：斜面培养→种子培养→曲盘培养→浸取酶液
13 核糖核酸酶水解rna
核糖核酸酶水解核酸生成核苷酸核酸降解产物少核糖核酸酶反应条件密切相关水解反应核糖核酸酶适条件处反应水解核酸核苷酸量较高酶核糖核酸酶适反应条件般讲发酵酶液适条件(1)适反应温度：般70℃左右(2) 适反应时间：2时左右(3)适反应ph值：50~55(4)适底物浓度：rna浓度2左右(5)适酶活：克rna需4000u麦芽根提酶适作条件(1)适反应温度：般67℃左右(2) 适反应时间：2时左右(3)适反应ph值：55~60(4)适底物浓度：rna浓度2左右(5)适酶活：克rna需3000u根适反应条件设计实验已知核酸酶反应适条件核酸酶核酸酶水解核酸时条件相已知核糖核酸
酶体反应条件情况条件附设计水正交实验方案根素水选正交实验表应正交实验表素组合进行实验出数作出素曲线图确定该素适水继续作未出结果素正交实验直出适条件水解产物加沉淀剂沉淀离心取清液紫外分光光度计法测260nm处紫外吸收值时发酵酶液进行正交实验设计方法提取酶液水解方法相
14 核苷酸结构性质检测
141 核苷酸结构性质
核苷酸核酸组成单位三部分组成分磷酸戊糖碱基核苷酸戊糖种类分核糖核苷酸脱氧核糖核苷酸两种中核糖核苷酸rna组成单位脱氧核糖核苷酸dna组成单位组成rna核糖核苷酸核苷酸分子碱基核苷酸分成四种5’腺嘌呤核苷酸（amp）5’鸟嘌呤核苷酸(gmp)5’胞嘧啶核苷酸(cmp)5’尿嘧啶核苷酸(ump)
5’腺嘌呤核苷酸（5’amp）分子量34722丙酮水溶液中含两分子水结品溶热水pk38(碱性基团)<16264(磷酸根)
5’鸟嘌呤核苷酸（5’gmp）分子量36323含12分子水结品pk24(碱性基团)94(酸性基团)<161(磷酸根)熔点190200℃(分解)
5’尿嘧啶核苷酸（5’ump）分子量32418pk95(碱基酸性基团) <164(磷酸根)
5’胞嘧啶核苷酸（5’cmp)分子量32321熔点233℃(分解)pk45(碱性基团)<163(磷酸根)
四种核苷酸结构式图示：
实际中四种核苷酸钠盐形式存形态均色色结晶白色结晶性粉末保藏应中核苷酸二钠盐
142 核苷酸检测
核酸水解产物核苷酸核苷碱基分析方法光谱法（紫外光吸收法）质谱法色谱法（高效液相色谱法离子色谱反相高效液相色谱（rphplc）薄层色谱）电泳法（毛细电泳）等中毛细电泳高效液相色谱法分离力强细胞分离方面广泛途尤高效液相色谱法（hlpc）应紫外光吸收法应方便准确率高离子交换液相色谱法具较高分离效率需分离柱进行生分析时间较长反相液相色谱法具快速操作方便特点现离子反相常规反相色谱洗脱方法采等度洗脱采梯度洗脱目前许关核苷酸检测方面报道：张志国贾云虹等hplc紫外检测方法乳粉中四种核苷酸cmpumpampgmp含量进行检测采c18柱报道结果完全符合求吉琼梅等005mollkh2po4流动相高效液相色谱法测定棉宝中5’amp5’cmp5’gmp5’ump分解率黄晓兰李科德陈云华报道采反相高效液相色谱分离15种核酸水解产物介绍该方法酵母抽提物中应霍敏屠春燕等反规液相色谱梯度洗脱模式酵母rna降解4中核苷酸进行分离检测郑理朱怀恩等紫外光吸收法保健品中核酸含量进行测定[7]邹耀洪曹学增等hplc（高效液相色谱）lcms(质谱)复合定性蘑菇柄中5’
核苷酸进行报道韩凤梅杨新等四种单核苷酸毛细区带电泳分离分析进行报道
15 核苷酸生产应
151 核苷酸生产方法概况
目前已种方法生产核苷酸衍生物纳起三种：化学合成法微生物发酵法提取法三种方法生产工艺产品均差
1511 化学合成法
利核苷进行磷酸酯化反应核苷5’位导入磷酸基目核苷酸常磷酸化试剂磷酸者焦磷酸活性衍生物工业三氯氧化磷目前化学法合成核苷酸收率85左右化学法合成法反应条件细分：ott法ludwig法方法化学合成核苷酸方法试剂较贵毒性生产成较高仅特殊途5’核苷酸衍生物合成目前仅实验室规模
1512 微生物发酵法生产5’核苷酸
微生物发酵法生产5’核苷酸目前已生产规模5’核苷酸微生物发酵法生产目前种核苷酸行
肌苷生产工业流程斜面→种子→种子罐培养→发酵→发酵液调ph→阳性树脂吸附→水洗→活性碳吸附→碱洗脱→次浓缩→滤→二次浓缩→冷冻结晶→抽滤→干燥→精制→肌苷成品
鸟苷酸(gmp)生产原理：鸟苷酸腺苷酸嘌呤核苷酸生物合成终产物鸟苷酸菌体浓度超定限度会引起反馈调节抑制鸟苷酸身合成时鸟苷溶解度低发酵时容易析出结晶减弱反馈调节作积累鸟苷
1513 提取法
菌体rna含量变化受培养基组成影响通常细菌中含rna5～25酵母中含27～15霉菌含07～28面包酵母含rna41～72中酵母体rnadna含量高培养酵母菌体收率高生产存量废酵母目前酵母菌体提取核苷酸
152 核苷酸应
1521 核苷酸功
核苷酸生物体具种生物学功维持细胞量调节等方面着重作体作核酸基组成单位核苷酸少直接影响细胞rnadna合成水影响机体种生理功核苷酸具免疫调节功核苷酸机体肝脏肠等器官组织明显影响肝部疾病讲补充核苷酸力实验证实象肠胃道样增生较快组织提高体核苷酸水利组织正常发育成熟修补生物体核苷酸存细胞中作机体量源作激活糖原糖蛋白合成重中介物磷脂合成重中介物作甲基硫酸盐供体种代谢途径起关键作辅酶重组成成分作变构效应子控制体许重代谢途径调节步骤机体生命活动基础
1522 核苷酸途
核酸类物质已种医疗方面作重医药中间体核糖核酸降解核苷酸核苷碱基途广泛药物衍生物抗肿瘤抗病毒方面应更显著腺苷肌苷尿苷核苷酸脱氧核苷酸胞二磷胆碱核苷三磷酸等核酸关组分衍生物天然代谢激活剂助改善机体物质代谢量代谢加速受损组织修复促病态细胞缺氧组织恢复正常生理功腺苷酸体量传递物质腺三磷稳定具显著扩张血降压作适肝病瘙痒静脉曲张性溃疡发症天然黄嘌呤类似物兴奋中枢神系统作作部位脑5’氟尿嘧啶尿嘧啶抗代谢物体转变成5’氟2’脱氧尿嘧啶核苷酸抑止胸腺嘧啶脱氧核苷酸合成酶阻断脱氧尿嘧啶核苷酸转变成胸腺嘧啶脱氧核苷酸影响dna生物合成抑制肿瘤细胞生长增殖[5]
5’gmp5’imp味精调合具显著鲜味相效应风味更佳特殊工艺加工动物蛋白植物蛋白种氨基酸混合调配种风味特鲜味精等调味品利微生物发酵法生产核苷核苷酸应领域食品工业中作风味强化剂欧洲已发表关添加nt奶粉指导方针欧洲美国日韩国等市场已销售添加核酸nt奶粉母乳含较核酸原普通奶粉数含核酸婴饮奶粉常常会先天敏症抗感染力较弱原奶粉中缺少核酸牛奶基础代乳品更加接乳核苷酸添加牛奶基础代乳品中婴幼胃肠道发育胃肠道健康维持血浆脂蛋白组成利影响[6]核苷酸通改善细胞活力提高机体系统身功调节力达佳综合状态生理衡具广泛稳定营养保健作核苷酸添加保健品中促进童生长发育增强智力提高成年抗病抗衰老力手术病身体康复均显著作特老年效果更佳
16 文研究目容
综述中核苷酸作基础性原料应领域广尤医药行业身作药物外合成许新型抗病毒抗肿瘤抗癌药物原料新核苷酸相关衍生物断涌现药物成解决目前疑难杂症新型药物彻底解决核苷酸规模生产问题解决基础性原料短缺显尤重
161 文研究目
然酶解法生产四种核苷酸优越性该方法中存着原料质量差酶活底酶解彻底等问题针述问题文研究目rna中水解更核苷酸麦芽根中提取更酶：1研究麦芽根中提取核酸酶佳提取条件更麦芽根中提取核酸酶2研究水解rna佳水解条件提高水解核苷酸量
162 文容
1621 麦芽根中核酸酶提取
① 研究加水ph值温度时间等条件酶活力
② 酶活测定采紫外分光光度计法
1622 水解rna条件研究
① 麦芽根中提取核酸酶水解rna研究底物浓度加酶量ph值温度时间等条件水解率高低
② 发酵酶液水解rna研究素水水解率高低
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1 引言
核苷酸衍生物食品医学农业化妆品生化试剂等领域具十分广泛途尤国核苷酸需求量进口方面缺口[1]目前核苷酸生产工艺完善利酶解法生产核苷酸酶解工艺条件研究国报道少国吴莉莉等利双酶法降解核酸生产呈味核苷酸i+g[2]杨斌等利酶解法生产呈味核苷酸生产进行述未酶解核酸工艺条件进行优化摸索工作
目前核苷酸三种生产方法相较言酶解法成低时生产四种产品明显优两种生产方法酶解法利原料rna啤酒废酵母中提取解决啤酒厂废酵母出路做资源生利提取rna废酵母考虑综合利产生更济效益社会效益然酶解法生产四种核苷酸优越性该方法中存着问题1原料质量差目前国rna纯度80左右溶解存量杂蛋白降低酶解率杂蛋白存增加分离难度2生产菌株水低：利桔青霉作生产核酸酶p1菌株生产酶活仅国外菌株60rna酶解率仅7085国外酶解率达85953离交分离收率低：方面酶解彻底存许杂质寡聚核苷酸等增加分离难度方面分离材料选择性差5’核苷酸吸附容量高效分离四种核苷酸4结晶技术关
通rna水解实验研究rna水解条件进步优化出水解rna佳工艺单核苷酸应领域
11 核糖核酸酶
111 概述
20世纪60年代核糖核酸酶作种模型蛋白普遍分子生物学研究核糖核酸酶（rnase）全名聚核苷α寡核苷酸转移酶类广泛存动植物体水解核酸链中磷酸二酯键酶酶核酸作水解核苷酸残基间磷酸二酯键生成寡聚核苷酸单核苷酸rnase生理功控制细胞rna种类数量分布参核糖核酸转录剪切修饰降解等程外某植物交亲性器官发生宿防御机制控制肿瘤血生成杀灭肿瘤细胞抑制病毒复制等关[3]
112 核糖核酸酶分类
根酶作核酸分子部位分3’磷酸二酯酶5’磷酸二酯酶根反应适ph分酸性核糖核酸酶碱性核糖核酸酶酸性核糖核酸酶存细胞溶酶体中水解吞噬异物中rna碱性核糖核酸酶存胞液中水解胞液中rna根降解rna底物般分3类：rnase〖饶艽呋rna 水解催化dna水解产生5’单核低聚核糖核苷酸5’单核低聚脱氧核糖核苷酸rnase⒔鍪rna释放2’3’环状嘌呤核糖核苷酸3’嘌呤核糖核苷酸rnaseＶ凰解rna释放2’3’环状嘌呤嘧啶核糖核苷酸3’嘌呤嘧啶核糖核苷酸根酶作专性[2]分核酸外切酶①蛇毒磷酸二酯酶：毒蛇毒液中提取核酸单链3’oh端开始水解生成5’单核苷酸该酶适ph9ca2+mg2+激活剂原剂螯合剂抑制酶活力②脾磷酸二酯酶：牛脾中提取水解产物3’单核苷酸核酸切酶：核酸酶s1米曲霉菌中提取出单链专性切酶产生5’单核苷酸适ph4550
需zn2+co2+刺激酶活力mg2+ca2+cu2+效该酶热较稳定底物存时65℃保温失活切兼外切酶：核酸酶p1桔青霉制称桔青5’磷酸二酯酶纯化p1酶单链专适温度70℃适ph5zn2+激活剂8moll尿素5moll盐酸胍抑制酶活性核酸酶p1酶具3’磷酸单酯酶活性水解3’单核苷酸核苷二磷酸3’二核苷酸3’磷酸键核酸酶p1酶常常制备5’单核苷酸
113 核糖核酸酶结构性质
核糖核酸酶二级结构含两独立折叠结构域结构域部环区两侧螺旋区组成a环b环含高度保守核苷酸序列底物切割位点a环4螺旋区核苷酸序列变化中a结构域两螺旋区h1h2底物特异性结合部位ab两折叠结构域通三级结构相互作形成功复合体二价金属离子够促进功域相互作发现惰性渡元素钴三价金属离子络合物co (nh3)63+价金属离子起二价镁离子作价金属离子镁离子效镁离子拮抗作co(nh3)63+协作ph值发夹状核糖核酸酶反应速率影响金属离子结合oh2起般碱催化作外切割位点硫代磷酸修饰抑制酶活性提示发夹状核糖核酸酶催化机制核糖核酸酶核糖核酸酶种类水解rna水解量水解机理相表现出种性质性质纳：①酶热稳定性：55℃酶活力基稳定65℃约50活力损失该酶锌酶酶液中补充锌离子提高酶热稳定性②zn2+浓度酶热稳定性影响：酶液中加入浓度zn2+70℃热处理20min激活强化5’磷酸二酯酶活性③温度酶活性影响：70℃左右时酶活力高温度升高降低酶活力降④酶ph稳定性：酶液稳定范围ph50ph80
间⑤ph酶活性影响：反应分醋酸缓液种ph条件进行外均测酶活方法进行ph值5060时酶活力高[3]
114 核糖核酸酶应
规模生产5’核苷酸核糖核酸酶途5’核苷酸动植物性食物味道基成分尤中鸟苷磷酸(gmp)肌苷磷酸(imp)等域值时呈现种身独特美味域值时增加食品鲜味作食品鲜味添加剂5’核苷酸酵母浸出液部分水解物种途径生产5’核苷酸产量较低(6)核糖核酸酶酵母浸出液生产5’核苷酸产量提高20左右年桔青霉等微生物生产核酸酶p1毒理研究逐步深入gaburdock等核酸酶p1导致毒性突变性研究揭示核酸酶白鼠没毒性致突变性预测快直接微生物发酵生产核酸酶p1作食品添加剂
12 核糖核酸酶制备
工业水解核酸核糖核酸酶麦芽根中提取核糖核酸酶桔青霉发酵核酸酶p1两种制酶方法制酶酶活说发酵液酶活较麦芽根中提取高发酵法生产酶成麦芽根中提取酶成高
121 麦芽根中提取核酸酶
麦芽根麦芽生产啤酒程中副产物目前般作饲料年着研究深入发现麦芽根中蛋白含量高氨基酸组成合理麦芽根占麦总投量3国啤酒生产规模较麦芽根数量相观麦芽根中提取5’磷酸二酯酶方法简单易行含量丰富常麦芽根中制核酸酶水解核酸
wf iers等研究发现采干磨法粉碎麦芽根ph285范围水进行提取ph酶提取率影响极提高离子强度显著提高率率提高数倍麦芽根组成中蛋白含量约2535蛋白质提取率足30蛋白质提取率酶提取尚潜力事实充分酶提取出成利麦芽根核酸酶首问题麦芽根利济性重前提
通常采定离子强度水麦芽根中提取核酸酶利麦芽根中酶溶出溶出酶种酶杂酶液核酸酶zn2+存条件热稳定性高杂酶液中加入zn2+70℃恒温水浴20min灭杂酶较纯核酸酶液通紫外分光光度法测酶活
流程：
麦芽根→粉碎→筛→加水→调ph→加离子→恒温水浴→加znso4→灭杂酶→酶液
122 桔青霉发酵核酸酶p1
核酸酶p1生产方法3种：固体发酵法深层液态发酵法固定化液体发酵法固体发酵( solid2statefermentationssf)操作简单成低利麸皮等农作物原料够较高酶活粗酶液农产品成分非常复杂想获纯核酸酶p1较困难繁琐
深层液态发酵法利现代发酵技术通装发酵罐中种感应器较控制发酵程原料配较明确通常液体发酵工艺条件：合成液体培养基通
风1∶04发酵温度30℃培养时间50～70 h生产厂家工艺条件身菌种设备调整总体说液态发酵菌丝体发酵液较易分离核苷酸发酵中
年固定化液体发酵法国外快速发展菌丝体固定谷梗惰性材料重复提高细胞利率生物反应速率便产物分离特利某惰性材料作载体保持酶活时简化发酵液成分便核酸酶提取纯化yang zhu等研究聚亚安酯惰性载体液体发酵生产核酸酶p1惰性载体发酵条件进行优化结果表明酶产率深层发酵提高4～20倍
液体培养流程：斜面培养→种子培养→发酵罐→酶液
固体培养流程：斜面培养→种子培养→曲盘培养→浸取酶液
13 核糖核酸酶水解rna
核糖核酸酶水解核酸生成核苷酸核酸降解产物少核糖核酸酶反应条件密切相关水解反应核糖核酸酶适条件处反应水解核酸核苷酸量较高酶核糖核酸酶适反应条件般讲发酵酶液适条件(1)适反应温度：般70℃左右(2) 适反应时间：2时左右(3)适反应ph值：50~55(4)适底物浓度：rna浓度2左右(5)适酶活：克rna需4000u麦芽根提酶适作条件(1)适反应温度：般67℃左右(2) 适反应时间：2时左右(3)适反应ph值：55~60(4)适底物浓度：rna浓度2左右(5)适酶活：克rna需3000u根适反应条件设计实验已知核酸酶反应适条件核酸酶核酸酶水解核酸时条件相已知核糖核酸
酶体反应条件情况条件附设计水正交实验方案根素水选正交实验表应正交实验表素组合进行实验出数作出素曲线图确定该素适水继续作未出结果素正交实验直出适条件水解产物加沉淀剂沉淀离心取清液紫外分光光度计法测260nm处紫外吸收值时发酵酶液进行正交实验设计方法提取酶液水解方法相
14 核苷酸结构性质检测
141 核苷酸结构性质
核苷酸核酸组成单位三部分组成分磷酸戊糖碱基核苷酸戊糖种类分核糖核苷酸脱氧核糖核苷酸两种中核糖核苷酸rna组成单位脱氧核糖核苷酸dna组成单位组成rna核糖核苷酸核苷酸分子碱基核苷酸分成四种5’腺嘌呤核苷酸（amp）5’鸟嘌呤核苷酸(gmp)5’胞嘧啶核苷酸(cmp)5’尿嘧啶核苷酸(ump)
5’腺嘌呤核苷酸（5’amp）分子量34722丙酮水溶液中含两分子水结品溶热水pk38(碱性基团)<16264(磷酸根)
5’鸟嘌呤核苷酸（5’gmp）分子量36323含12分子水结品pk24(碱性基团)94(酸性基团)<161(磷酸根)熔点190200℃(分解)
5’尿嘧啶核苷酸（5’ump）分子量32418pk95(碱基酸性基团) <164(磷酸根)
5’胞嘧啶核苷酸（5’cmp)分子量32321熔点233℃(分解)pk45(碱性基团)<163(磷酸根)
四种核苷酸结构式图示：
实际中四种核苷酸钠盐形式存形态均色色结晶白色结晶性粉末保藏应中核苷酸二钠盐
142 核苷酸检测
核酸水解产物核苷酸核苷碱基分析方法光谱法（紫外光吸收法）质谱法色谱法（高效液相色谱法离子色谱反相高效液相色谱（rphplc）薄层色谱）电泳法（毛细电泳）等中毛细电泳高效液相色谱法分离力强细胞分离方面广泛途尤高效液相色谱法（hlpc）应紫外光吸收法应方便准确率高离子交换液相色谱法具较高分离效率需分离柱进行生分析时间较长反相液相色谱法具快速操作方便特点现离子反相常规反相色谱洗脱方法采等度洗脱采梯度洗脱目前许关核苷酸检测方面报道：张志国贾云虹等hplc紫外检测方法乳粉中四种核苷酸cmpumpampgmp含量进行检测采c18柱报道结果完全符合求吉琼梅等005mollkh2po4流动相高效液相色谱法测定棉宝中5’amp5’cmp5’gmp5’ump分解率黄晓兰李科德陈云华报道采反相高效液相色谱分离15种核酸水解产物介绍该方法酵母抽提物中应霍敏屠春燕等反规液相色谱梯度洗脱模式酵母rna降解4中核苷酸进行分离检测郑理朱怀恩等紫外光吸收法保健品中核酸含量进行测定[7]邹耀洪曹学增等hplc（高效液相色谱）lcms(质谱)复合定性蘑菇柄中5’
核苷酸进行报道韩凤梅杨新等四种单核苷酸毛细区带电泳分离分析进行报道
15 核苷酸生产应
151 核苷酸生产方法概况
目前已种方法生产核苷酸衍生物纳起三种：化学合成法微生物发酵法提取法三种方法生产工艺产品均差
1511 化学合成法
利核苷进行磷酸酯化反应核苷5’位导入磷酸基目核苷酸常磷酸化试剂磷酸者焦磷酸活性衍生物工业三氯氧化磷目前化学法合成核苷酸收率85左右化学法合成法反应条件细分：ott法ludwig法方法化学合成核苷酸方法试剂较贵毒性生产成较高仅特殊途5’核苷酸衍生物合成目前仅实验室规模
1512 微生物发酵法生产5’核苷酸
微生物发酵法生产5’核苷酸目前已生产规模5’核苷酸微生物发酵法生产目前种核苷酸行
肌苷生产工业流程斜面→种子→种子罐培养→发酵→发酵液调ph→阳性树脂吸附→水洗→活性碳吸附→碱洗脱→次浓缩→滤→二次浓缩→冷冻结晶→抽滤→干燥→精制→肌苷成品
鸟苷酸(gmp)生产原理：鸟苷酸腺苷酸嘌呤核苷酸生物合成终产物鸟苷酸菌体浓度超定限度会引起反馈调节抑制鸟苷酸身合成时鸟苷溶解度低发酵时容易析出结晶减弱反馈调节作积累鸟苷
1513 提取法
菌体rna含量变化受培养基组成影响通常细菌中含rna5～25酵母中含27～15霉菌含07～28面包酵母含rna41～72中酵母体rnadna含量高培养酵母菌体收率高生产存量废酵母目前酵母菌体提取核苷酸
152 核苷酸应
1521 核苷酸功
核苷酸生物体具种生物学功维持细胞量调节等方面着重作体作核酸基组成单位核苷酸少直接影响细胞rnadna合成水影响机体种生理功核苷酸具免疫调节功核苷酸机体肝脏肠等器官组织明显影响肝部疾病讲补充核苷酸力实验证实象肠胃道样增生较快组织提高体核苷酸水利组织正常发育成熟修补生物体核苷酸存细胞中作机体量源作激活糖原糖蛋白合成重中介物磷脂合成重中介物作甲基硫酸盐供体种代谢途径起关键作辅酶重组成成分作变构效应子控制体许重代谢途径调节步骤机体生命活动基础
1522 核苷酸途
核酸类物质已种医疗方面作重医药中间体核糖核酸降解核苷酸核苷碱基途广泛药物衍生物抗肿瘤抗病毒方面应更显著腺苷肌苷尿苷核苷酸脱氧核苷酸胞二磷胆碱核苷三磷酸等核酸关组分衍生物天然代谢激活剂助改善机体物质代谢量代谢加速受损组织修复促病态细胞缺氧组织恢复正常生理功腺苷酸体量传递物质腺三磷稳定具显著扩张血降压作适肝病瘙痒静脉曲张性溃疡发症天然黄嘌呤类似物兴奋中枢神系统作作部位脑5’氟尿嘧啶尿嘧啶抗代谢物体转变成5’氟2’脱氧尿嘧啶核苷酸抑止胸腺嘧啶脱氧核苷酸合成酶阻断脱氧尿嘧啶核苷酸转变成胸腺嘧啶脱氧核苷酸影响dna生物合成抑制肿瘤细胞生长增殖[5]
5’gmp5’imp味精调合具显著鲜味相效应风味更佳特殊工艺加工动物蛋白植物蛋白种氨基酸混合调配种风味特鲜味精等调味品利微生物发酵法生产核苷核苷酸应领域食品工业中作风味强化剂欧洲已发表关添加nt奶粉指导方针欧洲美国日韩国等市场已销售添加核酸nt奶粉母乳含较核酸原普通奶粉数含核酸婴饮奶粉常常会先天敏症抗感染力较弱原奶粉中缺少核酸牛奶基础代乳品更加接乳核苷酸添加牛奶基础代乳品中婴幼胃肠道发育胃肠道健康维持血浆脂蛋白组成利影响[6]核苷酸通改善细胞活力提高机体系统身功调节力达佳综合状态生理衡具广泛稳定营养保健作核苷酸添加保健品中促进童生长发育增强智力提高成年抗病抗衰老力手术病身体康复均显著作特老年效果更佳
16 文研究目容
综述中核苷酸作基础性原料应领域广尤医药行业身作药物外合成许新型抗病毒抗肿瘤抗癌药物原料新核苷酸相关衍生物断涌现药物成解决目前疑难杂症新型药物彻底解决核苷酸规模生产问题解决基础性原料短缺显尤重
161 文研究目
然酶解法生产四种核苷酸优越性该方法中存着原料质量差酶活底酶解彻底等问题针述问题文研究目rna中水解更核苷酸麦芽根中提取更酶：1研究麦芽根中提取核酸酶佳提取条件更麦芽根中提取核酸酶2研究水解rna佳水解条件提高水解核苷酸量
162 文容
1621 麦芽根中核酸酶提取
① 研究加水ph值温度时间等条件酶活力
② 酶活测定采紫外分光光度计法
1622 水解rna条件研究
① 麦芽根中提取核酸酶水解rna研究底物浓度加酶量ph值温度时间等条件水解率高低
② 发酵酶液水解rna研究素水水解率高低
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