题目：硬叶兜兰居群水ITS基扩增信息分析
摘 优化兜兰ITSPCR反应体系硬叶兜兰试材改良2×CTAB提取总DNA10×PCR buffer1ulMg2+125uldNTP12ul引物025ulTaq酶03ulddH2O345ul基础模板DNA2ul (50ngul)通实验摸索PCR佳退火温度优化反应体系硬叶兜兰进行核基ITS间隔子扩增通08％琼脂糖凝胶电泳BioRad凝胶成系统筛选行反应产物反应产物测序分析目基片段793809bp 通NBCI网线分析证实硬叶兜兰ITS基该基属植物源性9099
关键词：硬叶兜兰ITS间隔子扩增反应体系
目录
1 前言 2
11 兜兰属植物概况 2
12 兜兰属植物研究进展 4
121 兜兰属植物繁殖方法 4
122 ITS技术兰科植物中运 6
13 研究目意义 7
2材料方法 9
21 材料收集处理 9
22 DNA提取 9
23 ITSPCR反应体系建立确定引物退火温度 10
231 ITSPCR反应体系建立 10
232确定引物退火温度 11
24 产物检测数分析 11
25 试剂仪器 11
3 结果分析 12
31 DNA质量检测结果 12
32 ITSPCR反应体系 13
33退火温度确定 13
34 目基生物学信息 13
35 四居群DNA序列变异情况 16
结讨 21
参考文献 22
指导老师简介 24
致谢 25
1 前言
11 兜兰属植物概况
兜兰称女士拖鞋兰仙履兰兰科（Orchidaceae）兜兰属(Paphiopedilum)植物统称拉丁语中兜兰属名Paphiopedilum爱神Paphos鞋Pedilon组成世界约66种兜兰属植物年已发现10新物种总数超80种[1]兜兰属亚热带植物分布东南亚喜马拉雅低中国西南部仅少数物种分布新亚罗门群岛中国兜兰属植物产区18种生长西南省区华南区分布少[2]数种类分布范围窄具定区域特征例杏黄兜兰（Paphiopedilum armeniacum）硬叶兜兰（P micranthum）麻栗坡兜兰（P malipoense）仅分布热带渡区石灰岩山中紫色兜兰具更广泛分布区域陈心启等认已知品种原始代表品种麻栗坡兜兰杓兰属兜兰属演化中间类型渡类型国省分布情况：（1）云南14种占全国778％占世界215％中：紫纹兜兰（P purpuratum）色兜兰（P concolor）带叶兜兰（P hirsutissimum）云南全境分布 享利兜兰（P henryanum）巨瓣兜兰（P bellatulum）紫毛兜兰（P villosum）分布云南东南部飘带兜兰（P parishii）长瓣兜兰（P dianthum）硬叶兜兰（P micranthum）分布云南南部 杏黄兜兰（P armeniacum）虎斑兜兰（P markianum）分布云南西部彩云兜兰（P wardii）波瓣兜兰（P insigne）分分布云南西南部西北部（2）贵州7种占全国38．9％叶兜兰（P barbigerum）带叶兜兰白花兜兰（P emersonii）色兜兰麻栗坡兜兰硬叶兜兰（3）广西9种占全国50％紫纹兜兰卷萼兜兰白花兜兰紫毛兜兰硬叶兜兰带叶兜兰色兜兰叶兜兰（4）西藏广东海南1种分秀丽兜兰（P venustum）卷萼兜兰紫纹兜兰[3]外国兜兰种类德氏兜兰(P delenatii)菲律宾兜兰(P philippinense) 苏氏兜兰(P sukhakulii)韩氏兜兰(P hangianum)等数十种兜兰属植物分布马西亚印度尼西亚泰国越南等国家石灰岩山石隙林腐殖土中中韩氏兜兰德氏兜兰未花卉育种具潜力[4]
兜兰属花形状非常奇特唇瓣呈兜状类似位欧洲少女拖鞋 花萼背特发达具艳丽花纹图案兜兰兰花间区两育雄蕊着生蕊柱两侧 背侧花萼扁圆形倒心形显着瓣中 独特魅力许优美特征受世界花卉爱者喜爱杏黄兜兰白花兜兰传入欧美获百关美国兰展奖项追捧未衰硬叶兜兰更勇夺世界兰展全场总冠军惊艳兰坛杏黄兜兰硬叶兜兰誉金童玉女兰花中瑰宝备受世喜爱[5]
硬叶兜兰生半附生植物具细长横走根状茎根状茎直径23mm 具少数稍肉质毛纤维根叶基生45枚叶片长圆形舌状革质坚硬长515cm 宽152cm 先端钝面深绿色网状背面具密生紫色斑点龙骨状突起基部收狭成叶柄状相互重叠花葶直立长1026cm 紫红色具深色斑点长柔毛顶端具1花花苞卵形宽卵形绿色具紫色斑点长114cm 背面疏长柔毛花梗子房长3545cm 长柔毛花艳丽中萼片花瓣通常白色黄色晕淡紫红色粗脉纹唇瓣白色浅粉红色退化雄蕊黄色具淡紫色斑点短纹中萼片卵形宽卵形长23cm 宽1825cm 先端锐尖背面长柔毛具龙骨状突起合萼片卵形宽卵形长228cm 宽1828cm 先端钝尖背面长柔毛具2条稍钝龙骨状突起花瓣宽卵形宽椭圆形圆形长2832cm 宽2635 cm钝浑圆形先端白色长柔毛表面基部背面少短柔毛唇瓣深囊状卵状椭圆形球形长4565cm 宽4555cm 基部具短爪囊口圆形整边缘折囊底白色长柔毛退化雄蕊椭圆形长115cm 宽78mm先端急尖两侧边缘尤中部边缘直立少弯中央貌似具槽2枚育雄蕊退化雄蕊边缘卷清晰辨甚美观花期35月[6]
兜兰属兰科植物群体中非常具特色兰花奇特观赏兰花具金童玉女称杏黄兜兰硬叶兜兰享玉兜美称麻栗坡兜兰非常珍贵种类[5]外原产国色兜兰亨利兜兰带叶兜兰彩云兜兰长瓣兜兰……极具观赏性兜兰属植物身观赏价值高受国兰花爱者青睐[7]种植中心消费市场分布欧美该品种已100年栽培历史注册品种数万计国丰富野生兜兰种质资源国兜兰属植物栽培历史较短目前止没进入真正意义品种繁育阶段[8]满足市场消费需求世界现代兜兰杂交品种层出穷根花色分红花系斑点花系黄花系白花系绿花系中具代表性优良品种斑点花系品种富凯(PAndy YamamotoFuki＇)红色花系品种苏瓦达(P KeyeshillSuwada＇)绿色花系品种白花兜兰(PGowerianumAlbum＇)白色花系品种苏栅花边(PSusanTucker＇)黄色花系品种石灰光(PGreen MoonLime Light＇)等根花朵数量华系单花系划分品种种更实方法单花系品种阴森峡谷(PColoradeDeep Dark Canyon＇)白胡椒(PSkip BartlettWhite Pepper＇)闪光(PMaudiaeBank House＇)花系品种珍宝(PSaintSwithinJumbo Jamboree＇)苏栅棚屋(P SusanBooth＇)米奇(PMike RoccaforteMike＇)等[9]然备受青时兰属植物减少年生态环境破坏度挖掘兜兰现已成世界濒危植物许物种濒灭绝兜兰属植物保护越越受重视野生兜兰属物种列入濒危野生动植物种国际贸易公约禁止贸易年许学者角度兜兰属植物保育学进行研究中兜兰育种生物学目前研究热点[1011]鉴兰科植物通播种菌播种植物繁殖分子育种组织培养等技术进行繁殖[12]
12 兜兰属植物研究进展
121 兜兰属植物繁殖方法
数兜兰属植物分布热带区根部生长石隙积聚腐殖质土中溪旁树皮潮湿石头苔藓蕨类植物起生长[7]缺乏许兰科植物具储藏养料水分假鳞茎气候适应性差兜兰栽培理较特殊土壤施肥浇水等方面均热带兰种类[13]外兰科植物种子非常具备胚乳茹果中通常含数万粒萌发时需某真菌生野外然萌发率极低开始运种方法兜兰属植物进行繁殖
组织培养 组织培养技术兜兰属植物规模繁殖中应濒危野生种兜兰具重意义然兜兰属植物组织培养技术难度领域成功报道少组织培养技术法实现兜兰属植物规模化生产目前兜兰组织培养研究集中外植体类型阶段培养基优化激素选择等方面目前兜兰组织培养般茎尖叶片幼虫根等外植体茎尖常外植体部位成功率较高兜兰属植物茎非常短取材较困难易受细菌污染目前少数种杏黄兜兰硬叶兜兰等侧芽根状茎样伸长便茎段培养[14]杨燕[15]等亨利兜兰侧芽外植体研究基培养基类型激素浓度继代增殖影响结果表明：茎尖诱导培养基Heller培养基＋6BA 20mgL＋NAA 02mgL＋活性炭05gL佳继代培养中培养基12MS＋6BA02mgL＋NAA20mgL＋椰汁100mlL＋活性炭20gL丛生芽增殖效果增殖倍数达350壮苗生根12MS＋NAA10mgL＋土豆汁100mlL＋活性碳20ｇＬ培养基优
菌播种 兜兰种子没胚乳然条件需真菌生获营养萌发兜兰杂交种子般需含生真菌兜兰原生土壤播种兜兰母株基质中萌发萌发率低[12]目前方面研究处起步阶段研究重点集中兜兰种生真菌分离兜兰生长影响李明等采根组织切片法杏黄兜兰根分离13株真菌镰刀菌组丝核菌优势菌组丝核菌JF74JF75JF80制成菌剂施入杏黄兜兰根部杏黄兜兰产生定促进生长效果朱鑫敏[12]等硬叶兜兰杏黄兜兰根中分分离瘤菌根菌属真菌PM１美孢胶膜菌PA１观察培养基２种真菌硬叶兜兰杏黄兜兰生长影响结果表明基养分水显著影响生真菌杏黄兜兰生关系营养相贫瘠 ＤＥ培养基利两者生营养丰富 Ｈarvais培养基利生现已分离许兜兰生真菌研究表明真菌兜兰生长明显促进作生真菌促进兜兰种子萌发相关研究较少
分株繁殖 兜兰属植物生长状态良条件年基部发出新萌糵般情况23年便母株分开进行繁殖通分株换盆相结合早春花皆进行分株繁殖前停水3天基质水分排干进行分株时整盆植株花盆中带基质起取出然基质轻轻清理干净兜兰属植物根系较少基质时做根系造成损伤烂根萎缩老根剪刀酒精浸泡烂根然植株轻轻分开新植株尚未老株完全脱离根系较发达刀片中间分开伤口涂抹硫磺粉防止细菌侵加快伤口愈合般23株新苗起进行盆[16]
122 ITS技术兰科植物中运
转录间隔区（ITS）位18S58S26S区三部分组成：ITS1ITS2间高度保守58S rDNA外显子区子植物中该区域总长度500〜750bp间种子植物中较长达1500〜3500bp间隔区会组装成成熟核糖体ITS1ITS2转录物rRNA加工程中会切掉两部分核rRNA成熟中起重作现肯定ITS2核糖体源理中构建rRNA亚基必需间隔区正确高阶结构找指端核苷酸合适切割位点重然ITS2序列长度生物体中变化Hadjiolova等证实哺乳动物酿酒酵母具结构源域编码区域相间隔区进化更快例部转录间隔区（ITS）研究属种间更紧密家族间属间关系时表现出较高趋异率已水系统重建中广泛[17]
缘种亲缘关系中应 Cox[17])等应核rDNA ITS序列研究兜兰属 (Paphiopedilum)美洲兜兰属(Phragmipedium)杓兰属 (Cypripedium)墨西哥兰属(Mexipedium)碗兰属(Selenipedium) 150～170种间亲缘关系证明兜兰属划分传统分类基致丁余[18]等分束花石斛(Dendrobium chrysanthum ) 曲茎石斛 (D flexicaule )属相似种进行rDNA ITS区域序列较研究挑选出157碱基位点作鉴束花石斛缘种曲茎石斛 似种DNA证
系统进化中应 Tsai[17]根ITS序列差异确定台湾12种石斛属植物亲缘关系12种石斛属植物2种非石斛属植物ITS序列进行全面分析发现684特征测定遗传距离建立系统发育树Gravendeel等通利独蒜兰属(Pleione)质体DNArDNA ITS 序列结合形态学方法特点分析独蒜兰属野生种起源进化趋势
分子系统理学中应 分子系统理学起源20世纪70年代中期线粒体DNA研究 研究物种物种现分布格局历史原演变 植物分子系统理学通常利植物叶绿体DNA估计植物物种遗传变异空间分布格局确定植物冰期避难冰期迁移路线估测缘种间歧化时间确定植物物种保护单元[18] 年分子系统理学已应兰科植物研究Tsai等基核糖体DNA质体DNA(包括trnLtrnLFatpBrbcL间隔区)苏门答腊岛马西亚半岛明威群岛蝴蝶兰(Phalaenopsis violacea)进行研究利核r DNA ITS 质体DNAtrnL含子atpBrbc L间隔区蝴蝶兰属系统进化生物理学分布进行深入探讨[17]
13 研究目意义
传统植物系统学建立形态解剖学孢粉学生理学生物化学等性状表型基础然分子遗传学角度表型差异基型差异引起直接分析植物DNA序列进行分析基组水植物系统学提供力直接分子水解物种分化原物质基础[19]着现代生物技术飞速发展分子标记技术兰科植物种质资源遗传样性系统进化研究中广泛应子植物中rDNA ITS核苷酸序列具高度变异性长度保守性表明间隔区序列容易缘类群间排序丰富变异较低分类阶元解决植物系统发育问题解决植物系统发育问题方法广泛应系统发育亲缘关系研究中[20]ITS诸优点成种重分子标记广泛应植物源分类物种鉴定物种进化物种起源分子系统理学等方面目前利核rDNA ITS标记兰科植物进行研究尚属空白兰科植物中遗传变异等原rDNN中区域差异法效区分需传统细胞遗传学形态学鉴定分子标记方法进行补充着现代分子生物学迅速发展植物基组测序断深入ITS更全面更深入认识探索出更方法兰科植物种质资源鉴定系统学研究特国药兰科植物珍稀濒危兰科植物分类鉴定种质资源保护等方面发挥重作[17]
2材料方法
21 材料收集处理
通机抽样体间距离1m选择植株生长状况良病害少少虫害等四居群剪刀剪叶记编号贴标签带回实验室采集放入70℃保存液氮磨细装入离心保存70℃
表1 四种硬叶兜兰源
四种硬叶兜兰源
居群编号
物种
点
1
山车硬叶兜兰
马关县坡脚
2
砚山梅子菁硬叶兜兰
砚山县梅子菁
3
奢硬叶兜兰
文山县柳井
4
东山硬叶兜兰
麻栗坡八里河
22 DNA提取
采改良CTAB法提取基组DNA步骤：
（1） 提前水浴锅加热65℃时预热2×CTAB异丙醇放入70℃（2）取03g 液氮中研磨硬叶兜兰叶片装入15ml离心中离心中加入3PVP2β巯基乙醇混合液500ul静置10min中间摇晃两次然离心机中12000rmin离心5min倒掉清液（3）加入650ul预热2×CTAB摇匀65℃水浴锅中放1h第次摇晃间隔5min剩55min间隔10min摇次时间取出冷常温（4）冷加入等体积（2×CTAB体积650ul）24：1（三氯甲烷：异丙醇）混匀静置15min然离心机中12000rmin离心10min取出清液15ml离心中次加入等体积24：1静置10min然离心机中12000rmin离心10min取出清液（5）取出清液中加入23体积70℃异丙醇放入70℃中30min融化12000rmin离心10min倒出清液（6）加入75乙醇洗涤12000rmin离心5min倒出乙醇（8）DNA置37℃烘箱中烘干加入30μlRNase酶水轻轻弹均匀20℃冰箱备
23 ITSPCR反应体系建立确定引物退火温度
231 ITSPCR反应体系建立
硬叶兜兰基组DNA模板初步筛选ITS1ITS4次试验固定引物10×PCR buffer 1ul Mg2+ 浓度25molL dNTP浓度03mmolL 引物浓度05umolLTaq DNA酶浓度06U10ulddH2O 345ul反应物质10×PCR buffer 1ulMg2+125uldNTP 12ul引物 025ulTaq酶03ulddH2O 345ul单位量通改变反应物质量模板DNA2ul (纯度50ngul)量变硬叶兜兰进行核基ITS间隔子扩增进行较研究8组DNA 3次重复模板DNA2ul (浓度50ngul)成分表2计算加样述提引物Taq酶dNTP均生工生物技术限公司提供
表2 兜兰ITS—PCR反应体系素
实验表
素
浓度
单位量
Tap DNA聚合酶
06U10ul
03ul
Mg2+
25molL
125ul
引物
05umolL
025ul
dNTP
03mmolL
12ul
10×PCR buffer
1ul
ddH2O
345ul
组合
1
2
3
4
5
6
7
8
量倍数
8
14
20
26
32
40
46
60
PCR扩增BioRad梯度PCR扩增仪进行反应程序：预变性：94℃4min变性：94℃1min退火：根引物选择合适退火温度525℃1min延伸：72℃90s循环：2435循环72℃延伸10min 4℃放置备
232确定引物退火温度
确定佳反应体系BioRad梯度PCR扩增仪次试验引物退火温度进行优化筛选设定退火温度500～580℃扩增仪动生成8梯度500502508516525535545555564572578580℃通PCR扩增产物08％琼脂糖凝胶电泳检测
24 产物检测数分析
基组DNA检测取3ul溴酚蓝核酸染色剂3uL样品缓液混匀08％琼脂糖凝胶220V电压电泳20min左右BioRad凝胶成系统检测拍存PCR扩增产物检测取3ul溴酚蓝核酸染色剂3ul样品缓液混匀通琼脂糖凝胶电泳220V电压电泳15min左右BioRad凝胶成系统筛选行反应体系
25 试剂仪器
药品：液氮CTAB异丙醇（前放20℃冰箱夜）75酒精1molLTrisC05molLEDTA9999β巯基乙醇10mgmlRNase酶贮藏液氯仿异戊醇溴酚蓝NaOH琼脂糖溴化乙锭DNAmaker浓盐酸氢氧化钠氯化钠TaqDNA聚合酶引物dNTPs
器材：离心15ml电子天研钵移液枪量筒类枪头恒温水浴锅4℃冰箱20℃冰箱台式高速离心机DYY8B型稳压稳流电泳仪（北京六仪器厂）DYY33A34A电泳槽Gen Genius凝胶成系统Nano Vue超微量分光光度计微波炉Gene Amp PCR system 9700（Applied Biosystems）
3 结果分析
31 DNA质量检测结果
4居群提取DNA进行08％琼脂糖凝胶电泳抽样检测图1提取DNA条带清晰拖尾现象DNA保存较完没发生降解符合续实验质量求
图1 基组DNA检测
作PCR扩增模板DNA进行核酸质量测量测量浓度OD值（DNA模板质量求：DNA纯度>200ngul 18
表3 DNA纯度OD值测定
居群1
居群2
居群3
居群4
样编号
浓度（ngul）
OD值
样编号
浓度（ngul）
OD值
样编号
浓度（ngul）
OD值
样编号
浓度（ngul）
OD值
11
4131
181
22
1924
188
33
1966
186
42
2235
186
12
3692
192
23
10782
180
34
2237
191
44
11018
181
14
5233
187
24
2968
191
35
1928
191
49
3508
187
15
3254
190
25
10961
183
36
1816
186
410
1874
181
16
7445
181
26
4760
187
37
4307
182
411
3421
186
18
5096
183
27
1967
188
38
2879
190
412
3435
186
19
3546
182
213
5637
183
39
8945
196
423
5347
184
110
8581
189
214
5241
186
311
3768
184
424
4224
187
111
4160
189
215
1999
188
312
4565
185
426
6348
183
113
5227
183
218
4448
182
314
1847
183
427
5468
191
注：1山车居群2梅子菁居群3奢居群4东山居群
32 ITSPCR反应体系
PCR扩增BioRad梯度PCR仪扩增凝胶电泳图2知8处理组合中条单明亮条带丰度高没拖尾现象组3次重复实验稳定性较目基片段约800bp PCR反应产物基片段高达PCR反应产物测序求建立PCR扩增体系够满足硬叶兜兰植物ITS扩增求
图2 硬叶兜兰ITSPCR扩增结果
33退火温度确定
硬叶兜兰PCR扩增中物种引物佳退火温度退火温度低会发生非特异性扩增高会影响引物模板DNA结合降低扩增效率次实验操作摸索避免非特异扩增试验结果造成影响试验终确定引物适退火温度525℃
34 目基生物学信息
次试验材料4居群84样37样扩增序列成功表4中知目基片段793809bp间居群1中6扩增成功目基805809bp间目基17809bp1215805bp居群2中11扩增成功目基802809bp间目基214809bp23目基802bp居群38扩增成功目基800808bp间目基33808bp39目基800bp居群4中12扩增成功目基793808bp间目基423808bp目基44427目基793bp
表4 居群ITS基
居群1
居群2
居群3
居群4
样编号
基（bp）
样编号
基（bp）
样编号
基（bp）
样编号
基（bp）
12
805
21
805
33
808
42
800
15
805
22
807
35
805
44
793
16
808
23
802
36
802
49
801
17
809
24
806
38
807
410
796
18
807
27
805
39
800
412
807
19
807
213
805
311
807
421
806
214
809
312
802
423
805
215
805
314
806
424
805
218
808
426
808
219
806
427
793
220
807
430
806
434
806
注：居群1山车居群居群2梅子菁居群居群3奢居群居群4东山居群
选择居群1中153样扩增基通NBCI数库进行网线blast 图3图4目基硬叶兜兰 ITS 基该基兜兰属植物源率源物种表5核苷酸序列源性高99硬叶兜兰源性稍低杏黄兜兰源性982种源物种源性96马面兜兰绿叶兜兰源性93越南兜兰假白旗兜兰源性低紫毛兜兰白旗兜兰海伦兜兰紫纹兜兰带叶兜兰亨利兜兰瘤瓣兜兰苏式兜兰源性90
表5 居群1中153 ITS基核苷酸序列兰属植物源率源物种
源率
99
98
96
95
94
93
92
91
90
源物种
硬叶兜兰
杏黄兜兰
马面兜兰
德式兜兰
菲律宾兜兰
越南兜兰
麻栗坡兜兰
波瓣兜兰
紫毛兜兰
绿叶兜兰
硬叶兜兰
卓林兜兰
假白旗兜兰
色兜兰
白旗兜兰
国王兜兰
流放兜兰
巨瓣兜兰
海伦兜兰
麻栗坡兜兰
岩兜兰
紫纹兜兰
百花兜兰
黄花囊兰
带叶兜兰
桑德兜兰
叶兜兰
亨利兜兰
格力兜兰
瘤瓣兜兰
苏式兜兰
图3 153ITS核苷酸序列
图4 目基核苷酸序列兰属植物源性较
35 四居群DNA序列变异情况
通ITSPCR扩增反应获目基片段793806bp 间采DNAstar分析四居群37样ITS序列组成进行结果见图5431碱基发生变异均样12位点变异变异碱基占总位点例1：67分碱基 ACGT位点发生变异
Megalign 系统分析图
图51
图52
图5 样ITS核苷酸序列分析
4居群37样中53变异位点图6样均1变异位点表6知硬叶兜兰种群植物基发生变异碱基TCCG CTAGAT间相互转变 碱基位点增添GA
表6 居群基突变位点情况统计
项目
居群1
居群2
居群3
居群4
原碱基→变异碱基
C→T
T→C
C→G
A→G
G→T
C→A
A→T
T→C
—→G
C→T
T→C
G→A
C→G
C→A
G→T
_→A
T→A
A→C
G→C
T→C
C→T
G→C
C→A
G→T
G→A
T→A
A→C
T→C
C→T
C→G
G→C
C→T
C→A
G→T
A→C
A→T
A→G
碱基变异数目
64
46
112
209
居群碱基变异情况图6示居群1中含27变异位点6样样均5变异位点居群2中含30变异位点11样样均3变异位点居群3中含31变异位点8样样均4变异位点居群4中含44变异位点12样样均4变异位点
图61
图62
图6 居群4 样ITS核苷酸序列分析
ITS属保守序列变异位点少四居群中37样ITS序列变异位点定相似性变异位点集中前端118位点间末端788816位点间49位点发生变异时居群1居群2居群3位点501715116854位点变异样间位点变异样表7居群1中变异1918位点变异变异位点少186变异位点居群2中变异2819位点变异变异位点少2132145变异位点居群3中变异3624位点变异变异位点少338变异位点居群4中变异444930位点变异变异位点少4346变异位点突变位点占074—378
表7 样间位点变异数
居群1
居群2
居群3
居群4
样编号
基（bp）
位点变异数目（）
样编号
基（bp）
位点变异数目（）
样编号
基（bp）
位点变异数目（）
样编号
基（bp）
位点变异数目（）
12
805
8
21
805
8
33
808
8
42
800
19
15
805
10
22
807
10
35
805
22
44
793
30
16
808
10
23
802
7
36
802
24
49
801
30
17
809
11
24
806
10
38
807
9
410
796
27
18
807
6
27
805
6
39
800
25
412
807
15
19
807
18
213
805
5
311
807
17
421
806
15
214
809
5
312
802
15
423
805
11
215
805
9
314
806
13
424
805
7
218
808
19
426
808
11
219
806
14
427
793
22
220
807
8
430
806
11
434
806
6
结讨
1） 试验通ITS—PCR扩增研究硬叶兜兰进行核基ITS间隔子扩增10×PCR buffer1ulMg2+125uldNTP12ul引物025ulTaq酶03ulddH2O345ul基础模板DNA2ul (浓度50ngul)变通实验摸索确定PCR适退火温度度525℃PCR扩增BioRad梯度PCR扩增仪进行反应程序：预变性：94℃4min变性：94℃1min退火：根引物选择合适退火温度525℃1min延伸：72℃90s循环：2435循环72℃延伸10min 4℃放置备Baldwin B G统计子植物核rDNAITS区包括58S rDNA总长度600700bp中ITS1ITS2长度较保守次实验均获条带清晰单拖尾目基片段700800bp间利反应体系预期ITS基片段
2） rDNA ITS ITS158S ITS2 组成58S编码序列进化程中受压力较发生变异较少序列长度碱基组成相保守 ITS1 ITS2 非编码区进化程中受选择压力较碱基变异较存着丰富态性植物鉴定中广泛应利原理鉴种质源硬叶兜兰通NBCI网线分析证实硬叶兜兰ITS基该基属植物源性高99源物种硬叶兜兰杏黄兜兰98源马面兜兰绿叶兜兰96源德式兜兰硬叶兜兰国王兜兰麻栗坡兜兰等95源紫毛兜兰瘤瓣兜兰紫纹兜兰等90源
3） ITS序列(包括58S)相基序列言体群体甚整植物界相保守变异位点较少实验ITS序列位点突变率074—378间变异位点碱基CGAT发生置换缺失碱基位点发生增添53变异位点中C碱基位点占283G碱基位点占113A碱基位点占151T碱基位点占302碱基位点发生增添占151
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题目：硬叶兜兰居群水ITS基扩增信息分析
摘 优化兜兰ITSPCR反应体系硬叶兜兰试材改良2×CTAB提取总DNA10×PCR buffer1ulMg2+125uldNTP12ul引物025ulTaq酶03ulddH2O345ul基础模板DNA2ul (50ngul)通实验摸索PCR佳退火温度优化反应体系硬叶兜兰进行核基ITS间隔子扩增通08％琼脂糖凝胶电泳BioRad凝胶成系统筛选行反应产物反应产物测序分析目基片段793809bp 通NBCI网线分析证实硬叶兜兰ITS基该基属植物源性9099
关键词：硬叶兜兰ITS间隔子扩增反应体系
目录
1 前言 2
11 兜兰属植物概况 2
12 兜兰属植物研究进展 4
121 兜兰属植物繁殖方法 4
122 ITS技术兰科植物中运 6
13 研究目意义 7
2材料方法 9
21 材料收集处理 9
22 DNA提取 9
23 ITSPCR反应体系建立确定引物退火温度 10
231 ITSPCR反应体系建立 10
232确定引物退火温度 11
24 产物检测数分析 11
25 试剂仪器 11
3 结果分析 12
31 DNA质量检测结果 12
32 ITSPCR反应体系 13
33退火温度确定 13
34 目基生物学信息 13
35 四居群DNA序列变异情况 16
结讨 21
参考文献 22
指导老师简介 24
致谢 25
1 前言
11 兜兰属植物概况
兜兰称女士拖鞋兰仙履兰兰科（Orchidaceae）兜兰属(Paphiopedilum)植物统称拉丁语中兜兰属名Paphiopedilum爱神Paphos鞋Pedilon组成世界约66种兜兰属植物年已发现10新物种总数超80种[1]兜兰属亚热带植物分布东南亚喜马拉雅低中国西南部仅少数物种分布新亚罗门群岛中国兜兰属植物产区18种生长西南省区华南区分布少[2]数种类分布范围窄具定区域特征例杏黄兜兰（Paphiopedilum armeniacum）硬叶兜兰（P micranthum）麻栗坡兜兰（P malipoense）仅分布热带渡区石灰岩山中紫色兜兰具更广泛分布区域陈心启等认已知品种原始代表品种麻栗坡兜兰杓兰属兜兰属演化中间类型渡类型国省分布情况：（1）云南14种占全国778％占世界215％中：紫纹兜兰（P purpuratum）色兜兰（P concolor）带叶兜兰（P hirsutissimum）云南全境分布 享利兜兰（P henryanum）巨瓣兜兰（P bellatulum）紫毛兜兰（P villosum）分布云南东南部飘带兜兰（P parishii）长瓣兜兰（P dianthum）硬叶兜兰（P micranthum）分布云南南部 杏黄兜兰（P armeniacum）虎斑兜兰（P markianum）分布云南西部彩云兜兰（P wardii）波瓣兜兰（P insigne）分分布云南西南部西北部（2）贵州7种占全国38．9％叶兜兰（P barbigerum）带叶兜兰白花兜兰（P emersonii）色兜兰麻栗坡兜兰硬叶兜兰（3）广西9种占全国50％紫纹兜兰卷萼兜兰白花兜兰紫毛兜兰硬叶兜兰带叶兜兰色兜兰叶兜兰（4）西藏广东海南1种分秀丽兜兰（P venustum）卷萼兜兰紫纹兜兰[3]外国兜兰种类德氏兜兰(P delenatii)菲律宾兜兰(P philippinense) 苏氏兜兰(P sukhakulii)韩氏兜兰(P hangianum)等数十种兜兰属植物分布马西亚印度尼西亚泰国越南等国家石灰岩山石隙林腐殖土中中韩氏兜兰德氏兜兰未花卉育种具潜力[4]
兜兰属花形状非常奇特唇瓣呈兜状类似位欧洲少女拖鞋 花萼背特发达具艳丽花纹图案兜兰兰花间区两育雄蕊着生蕊柱两侧 背侧花萼扁圆形倒心形显着瓣中 独特魅力许优美特征受世界花卉爱者喜爱杏黄兜兰白花兜兰传入欧美获百关美国兰展奖项追捧未衰硬叶兜兰更勇夺世界兰展全场总冠军惊艳兰坛杏黄兜兰硬叶兜兰誉金童玉女兰花中瑰宝备受世喜爱[5]
硬叶兜兰生半附生植物具细长横走根状茎根状茎直径23mm 具少数稍肉质毛纤维根叶基生45枚叶片长圆形舌状革质坚硬长515cm 宽152cm 先端钝面深绿色网状背面具密生紫色斑点龙骨状突起基部收狭成叶柄状相互重叠花葶直立长1026cm 紫红色具深色斑点长柔毛顶端具1花花苞卵形宽卵形绿色具紫色斑点长114cm 背面疏长柔毛花梗子房长3545cm 长柔毛花艳丽中萼片花瓣通常白色黄色晕淡紫红色粗脉纹唇瓣白色浅粉红色退化雄蕊黄色具淡紫色斑点短纹中萼片卵形宽卵形长23cm 宽1825cm 先端锐尖背面长柔毛具龙骨状突起合萼片卵形宽卵形长228cm 宽1828cm 先端钝尖背面长柔毛具2条稍钝龙骨状突起花瓣宽卵形宽椭圆形圆形长2832cm 宽2635 cm钝浑圆形先端白色长柔毛表面基部背面少短柔毛唇瓣深囊状卵状椭圆形球形长4565cm 宽4555cm 基部具短爪囊口圆形整边缘折囊底白色长柔毛退化雄蕊椭圆形长115cm 宽78mm先端急尖两侧边缘尤中部边缘直立少弯中央貌似具槽2枚育雄蕊退化雄蕊边缘卷清晰辨甚美观花期35月[6]
兜兰属兰科植物群体中非常具特色兰花奇特观赏兰花具金童玉女称杏黄兜兰硬叶兜兰享玉兜美称麻栗坡兜兰非常珍贵种类[5]外原产国色兜兰亨利兜兰带叶兜兰彩云兜兰长瓣兜兰……极具观赏性兜兰属植物身观赏价值高受国兰花爱者青睐[7]种植中心消费市场分布欧美该品种已100年栽培历史注册品种数万计国丰富野生兜兰种质资源国兜兰属植物栽培历史较短目前止没进入真正意义品种繁育阶段[8]满足市场消费需求世界现代兜兰杂交品种层出穷根花色分红花系斑点花系黄花系白花系绿花系中具代表性优良品种斑点花系品种富凯(PAndy YamamotoFuki＇)红色花系品种苏瓦达(P KeyeshillSuwada＇)绿色花系品种白花兜兰(PGowerianumAlbum＇)白色花系品种苏栅花边(PSusanTucker＇)黄色花系品种石灰光(PGreen MoonLime Light＇)等根花朵数量华系单花系划分品种种更实方法单花系品种阴森峡谷(PColoradeDeep Dark Canyon＇)白胡椒(PSkip BartlettWhite Pepper＇)闪光(PMaudiaeBank House＇)花系品种珍宝(PSaintSwithinJumbo Jamboree＇)苏栅棚屋(P SusanBooth＇)米奇(PMike RoccaforteMike＇)等[9]然备受青时兰属植物减少年生态环境破坏度挖掘兜兰现已成世界濒危植物许物种濒灭绝兜兰属植物保护越越受重视野生兜兰属物种列入濒危野生动植物种国际贸易公约禁止贸易年许学者角度兜兰属植物保育学进行研究中兜兰育种生物学目前研究热点[1011]鉴兰科植物通播种菌播种植物繁殖分子育种组织培养等技术进行繁殖[12]
12 兜兰属植物研究进展
121 兜兰属植物繁殖方法
数兜兰属植物分布热带区根部生长石隙积聚腐殖质土中溪旁树皮潮湿石头苔藓蕨类植物起生长[7]缺乏许兰科植物具储藏养料水分假鳞茎气候适应性差兜兰栽培理较特殊土壤施肥浇水等方面均热带兰种类[13]外兰科植物种子非常具备胚乳茹果中通常含数万粒萌发时需某真菌生野外然萌发率极低开始运种方法兜兰属植物进行繁殖
组织培养 组织培养技术兜兰属植物规模繁殖中应濒危野生种兜兰具重意义然兜兰属植物组织培养技术难度领域成功报道少组织培养技术法实现兜兰属植物规模化生产目前兜兰组织培养研究集中外植体类型阶段培养基优化激素选择等方面目前兜兰组织培养般茎尖叶片幼虫根等外植体茎尖常外植体部位成功率较高兜兰属植物茎非常短取材较困难易受细菌污染目前少数种杏黄兜兰硬叶兜兰等侧芽根状茎样伸长便茎段培养[14]杨燕[15]等亨利兜兰侧芽外植体研究基培养基类型激素浓度继代增殖影响结果表明：茎尖诱导培养基Heller培养基＋6BA 20mgL＋NAA 02mgL＋活性炭05gL佳继代培养中培养基12MS＋6BA02mgL＋NAA20mgL＋椰汁100mlL＋活性炭20gL丛生芽增殖效果增殖倍数达350壮苗生根12MS＋NAA10mgL＋土豆汁100mlL＋活性碳20ｇＬ培养基优
菌播种 兜兰种子没胚乳然条件需真菌生获营养萌发兜兰杂交种子般需含生真菌兜兰原生土壤播种兜兰母株基质中萌发萌发率低[12]目前方面研究处起步阶段研究重点集中兜兰种生真菌分离兜兰生长影响李明等采根组织切片法杏黄兜兰根分离13株真菌镰刀菌组丝核菌优势菌组丝核菌JF74JF75JF80制成菌剂施入杏黄兜兰根部杏黄兜兰产生定促进生长效果朱鑫敏[12]等硬叶兜兰杏黄兜兰根中分分离瘤菌根菌属真菌PM１美孢胶膜菌PA１观察培养基２种真菌硬叶兜兰杏黄兜兰生长影响结果表明基养分水显著影响生真菌杏黄兜兰生关系营养相贫瘠 ＤＥ培养基利两者生营养丰富 Ｈarvais培养基利生现已分离许兜兰生真菌研究表明真菌兜兰生长明显促进作生真菌促进兜兰种子萌发相关研究较少
分株繁殖 兜兰属植物生长状态良条件年基部发出新萌糵般情况23年便母株分开进行繁殖通分株换盆相结合早春花皆进行分株繁殖前停水3天基质水分排干进行分株时整盆植株花盆中带基质起取出然基质轻轻清理干净兜兰属植物根系较少基质时做根系造成损伤烂根萎缩老根剪刀酒精浸泡烂根然植株轻轻分开新植株尚未老株完全脱离根系较发达刀片中间分开伤口涂抹硫磺粉防止细菌侵加快伤口愈合般23株新苗起进行盆[16]
122 ITS技术兰科植物中运
转录间隔区（ITS）位18S58S26S区三部分组成：ITS1ITS2间高度保守58S rDNA外显子区子植物中该区域总长度500〜750bp间种子植物中较长达1500〜3500bp间隔区会组装成成熟核糖体ITS1ITS2转录物rRNA加工程中会切掉两部分核rRNA成熟中起重作现肯定ITS2核糖体源理中构建rRNA亚基必需间隔区正确高阶结构找指端核苷酸合适切割位点重然ITS2序列长度生物体中变化Hadjiolova等证实哺乳动物酿酒酵母具结构源域编码区域相间隔区进化更快例部转录间隔区（ITS）研究属种间更紧密家族间属间关系时表现出较高趋异率已水系统重建中广泛[17]
缘种亲缘关系中应 Cox[17])等应核rDNA ITS序列研究兜兰属 (Paphiopedilum)美洲兜兰属(Phragmipedium)杓兰属 (Cypripedium)墨西哥兰属(Mexipedium)碗兰属(Selenipedium) 150～170种间亲缘关系证明兜兰属划分传统分类基致丁余[18]等分束花石斛(Dendrobium chrysanthum ) 曲茎石斛 (D flexicaule )属相似种进行rDNA ITS区域序列较研究挑选出157碱基位点作鉴束花石斛缘种曲茎石斛 似种DNA证
系统进化中应 Tsai[17]根ITS序列差异确定台湾12种石斛属植物亲缘关系12种石斛属植物2种非石斛属植物ITS序列进行全面分析发现684特征测定遗传距离建立系统发育树Gravendeel等通利独蒜兰属(Pleione)质体DNArDNA ITS 序列结合形态学方法特点分析独蒜兰属野生种起源进化趋势
分子系统理学中应 分子系统理学起源20世纪70年代中期线粒体DNA研究 研究物种物种现分布格局历史原演变 植物分子系统理学通常利植物叶绿体DNA估计植物物种遗传变异空间分布格局确定植物冰期避难冰期迁移路线估测缘种间歧化时间确定植物物种保护单元[18] 年分子系统理学已应兰科植物研究Tsai等基核糖体DNA质体DNA(包括trnLtrnLFatpBrbcL间隔区)苏门答腊岛马西亚半岛明威群岛蝴蝶兰(Phalaenopsis violacea)进行研究利核r DNA ITS 质体DNAtrnL含子atpBrbc L间隔区蝴蝶兰属系统进化生物理学分布进行深入探讨[17]
13 研究目意义
传统植物系统学建立形态解剖学孢粉学生理学生物化学等性状表型基础然分子遗传学角度表型差异基型差异引起直接分析植物DNA序列进行分析基组水植物系统学提供力直接分子水解物种分化原物质基础[19]着现代生物技术飞速发展分子标记技术兰科植物种质资源遗传样性系统进化研究中广泛应子植物中rDNA ITS核苷酸序列具高度变异性长度保守性表明间隔区序列容易缘类群间排序丰富变异较低分类阶元解决植物系统发育问题解决植物系统发育问题方法广泛应系统发育亲缘关系研究中[20]ITS诸优点成种重分子标记广泛应植物源分类物种鉴定物种进化物种起源分子系统理学等方面目前利核rDNA ITS标记兰科植物进行研究尚属空白兰科植物中遗传变异等原rDNN中区域差异法效区分需传统细胞遗传学形态学鉴定分子标记方法进行补充着现代分子生物学迅速发展植物基组测序断深入ITS更全面更深入认识探索出更方法兰科植物种质资源鉴定系统学研究特国药兰科植物珍稀濒危兰科植物分类鉴定种质资源保护等方面发挥重作[17]
2材料方法
21 材料收集处理
通机抽样体间距离1m选择植株生长状况良病害少少虫害等四居群剪刀剪叶记编号贴标签带回实验室采集放入70℃保存液氮磨细装入离心保存70℃
表1 四种硬叶兜兰源
四种硬叶兜兰源
居群编号
物种
点
1
山车硬叶兜兰
马关县坡脚
2
砚山梅子菁硬叶兜兰
砚山县梅子菁
3
奢硬叶兜兰
文山县柳井
4
东山硬叶兜兰
麻栗坡八里河
22 DNA提取
采改良CTAB法提取基组DNA步骤：
（1） 提前水浴锅加热65℃时预热2×CTAB异丙醇放入70℃（2）取03g 液氮中研磨硬叶兜兰叶片装入15ml离心中离心中加入3PVP2β巯基乙醇混合液500ul静置10min中间摇晃两次然离心机中12000rmin离心5min倒掉清液（3）加入650ul预热2×CTAB摇匀65℃水浴锅中放1h第次摇晃间隔5min剩55min间隔10min摇次时间取出冷常温（4）冷加入等体积（2×CTAB体积650ul）24：1（三氯甲烷：异丙醇）混匀静置15min然离心机中12000rmin离心10min取出清液15ml离心中次加入等体积24：1静置10min然离心机中12000rmin离心10min取出清液（5）取出清液中加入23体积70℃异丙醇放入70℃中30min融化12000rmin离心10min倒出清液（6）加入75乙醇洗涤12000rmin离心5min倒出乙醇（8）DNA置37℃烘箱中烘干加入30μlRNase酶水轻轻弹均匀20℃冰箱备
23 ITSPCR反应体系建立确定引物退火温度
231 ITSPCR反应体系建立
硬叶兜兰基组DNA模板初步筛选ITS1ITS4次试验固定引物10×PCR buffer 1ul Mg2+ 浓度25molL dNTP浓度03mmolL 引物浓度05umolLTaq DNA酶浓度06U10ulddH2O 345ul反应物质10×PCR buffer 1ulMg2+125uldNTP 12ul引物 025ulTaq酶03ulddH2O 345ul单位量通改变反应物质量模板DNA2ul (纯度50ngul)量变硬叶兜兰进行核基ITS间隔子扩增进行较研究8组DNA 3次重复模板DNA2ul (浓度50ngul)成分表2计算加样述提引物Taq酶dNTP均生工生物技术限公司提供
表2 兜兰ITS—PCR反应体系素
实验表
素
浓度
单位量
Tap DNA聚合酶
06U10ul
03ul
Mg2+
25molL
125ul
引物
05umolL
025ul
dNTP
03mmolL
12ul
10×PCR buffer
1ul
ddH2O
345ul
组合
1
2
3
4
5
6
7
8
量倍数
8
14
20
26
32
40
46
60
PCR扩增BioRad梯度PCR扩增仪进行反应程序：预变性：94℃4min变性：94℃1min退火：根引物选择合适退火温度525℃1min延伸：72℃90s循环：2435循环72℃延伸10min 4℃放置备
232确定引物退火温度
确定佳反应体系BioRad梯度PCR扩增仪次试验引物退火温度进行优化筛选设定退火温度500～580℃扩增仪动生成8梯度500502508516525535545555564572578580℃通PCR扩增产物08％琼脂糖凝胶电泳检测
24 产物检测数分析
基组DNA检测取3ul溴酚蓝核酸染色剂3uL样品缓液混匀08％琼脂糖凝胶220V电压电泳20min左右BioRad凝胶成系统检测拍存PCR扩增产物检测取3ul溴酚蓝核酸染色剂3ul样品缓液混匀通琼脂糖凝胶电泳220V电压电泳15min左右BioRad凝胶成系统筛选行反应体系
25 试剂仪器
药品：液氮CTAB异丙醇（前放20℃冰箱夜）75酒精1molLTrisC05molLEDTA9999β巯基乙醇10mgmlRNase酶贮藏液氯仿异戊醇溴酚蓝NaOH琼脂糖溴化乙锭DNAmaker浓盐酸氢氧化钠氯化钠TaqDNA聚合酶引物dNTPs
器材：离心15ml电子天研钵移液枪量筒类枪头恒温水浴锅4℃冰箱20℃冰箱台式高速离心机DYY8B型稳压稳流电泳仪（北京六仪器厂）DYY33A34A电泳槽Gen Genius凝胶成系统Nano Vue超微量分光光度计微波炉Gene Amp PCR system 9700（Applied Biosystems）
3 结果分析
31 DNA质量检测结果
4居群提取DNA进行08％琼脂糖凝胶电泳抽样检测图1提取DNA条带清晰拖尾现象DNA保存较完没发生降解符合续实验质量求
图1 基组DNA检测
作PCR扩增模板DNA进行核酸质量测量测量浓度OD值（DNA模板质量求：DNA纯度>200ngul 18
表3 DNA纯度OD值测定
居群1
居群2
居群3
居群4
样编号
浓度（ngul）
OD值
样编号
浓度（ngul）
OD值
样编号
浓度（ngul）
OD值
样编号
浓度（ngul）
OD值
11
4131
181
22
1924
188
33
1966
186
42
2235
186
12
3692
192
23
10782
180
34
2237
191
44
11018
181
14
5233
187
24
2968
191
35
1928
191
49
3508
187
15
3254
190
25
10961
183
36
1816
186
410
1874
181
16
7445
181
26
4760
187
37
4307
182
411
3421
186
18
5096
183
27
1967
188
38
2879
190
412
3435
186
19
3546
182
213
5637
183
39
8945
196
423
5347
184
110
8581
189
214
5241
186
311
3768
184
424
4224
187
111
4160
189
215
1999
188
312
4565
185
426
6348
183
113
5227
183
218
4448
182
314
1847
183
427
5468
191
注：1山车居群2梅子菁居群3奢居群4东山居群
32 ITSPCR反应体系
PCR扩增BioRad梯度PCR仪扩增凝胶电泳图2知8处理组合中条单明亮条带丰度高没拖尾现象组3次重复实验稳定性较目基片段约800bp PCR反应产物基片段高达PCR反应产物测序求建立PCR扩增体系够满足硬叶兜兰植物ITS扩增求
图2 硬叶兜兰ITSPCR扩增结果
33退火温度确定
硬叶兜兰PCR扩增中物种引物佳退火温度退火温度低会发生非特异性扩增高会影响引物模板DNA结合降低扩增效率次实验操作摸索避免非特异扩增试验结果造成影响试验终确定引物适退火温度525℃
34 目基生物学信息
次试验材料4居群84样37样扩增序列成功表4中知目基片段793809bp间居群1中6扩增成功目基805809bp间目基17809bp1215805bp居群2中11扩增成功目基802809bp间目基214809bp23目基802bp居群38扩增成功目基800808bp间目基33808bp39目基800bp居群4中12扩增成功目基793808bp间目基423808bp目基44427目基793bp
表4 居群ITS基
居群1
居群2
居群3
居群4
样编号
基（bp）
样编号
基（bp）
样编号
基（bp）
样编号
基（bp）
12
805
21
805
33
808
42
800
15
805
22
807
35
805
44
793
16
808
23
802
36
802
49
801
17
809
24
806
38
807
410
796
18
807
27
805
39
800
412
807
19
807
213
805
311
807
421
806
214
809
312
802
423
805
215
805
314
806
424
805
218
808
426
808
219
806
427
793
220
807
430
806
434
806
注：居群1山车居群居群2梅子菁居群居群3奢居群居群4东山居群
选择居群1中153样扩增基通NBCI数库进行网线blast 图3图4目基硬叶兜兰 ITS 基该基兜兰属植物源率源物种表5核苷酸序列源性高99硬叶兜兰源性稍低杏黄兜兰源性982种源物种源性96马面兜兰绿叶兜兰源性93越南兜兰假白旗兜兰源性低紫毛兜兰白旗兜兰海伦兜兰紫纹兜兰带叶兜兰亨利兜兰瘤瓣兜兰苏式兜兰源性90
表5 居群1中153 ITS基核苷酸序列兰属植物源率源物种
源率
99
98
96
95
94
93
92
91
90
源物种
硬叶兜兰
杏黄兜兰
马面兜兰
德式兜兰
菲律宾兜兰
越南兜兰
麻栗坡兜兰
波瓣兜兰
紫毛兜兰
绿叶兜兰
硬叶兜兰
卓林兜兰
假白旗兜兰
色兜兰
白旗兜兰
国王兜兰
流放兜兰
巨瓣兜兰
海伦兜兰
麻栗坡兜兰
岩兜兰
紫纹兜兰
百花兜兰
黄花囊兰
带叶兜兰
桑德兜兰
叶兜兰
亨利兜兰
格力兜兰
瘤瓣兜兰
苏式兜兰
图3 153ITS核苷酸序列
图4 目基核苷酸序列兰属植物源性较
35 四居群DNA序列变异情况
通ITSPCR扩增反应获目基片段793806bp 间采DNAstar分析四居群37样ITS序列组成进行结果见图5431碱基发生变异均样12位点变异变异碱基占总位点例1：67分碱基 ACGT位点发生变异
Megalign 系统分析图
图51
图52
图5 样ITS核苷酸序列分析
4居群37样中53变异位点图6样均1变异位点表6知硬叶兜兰种群植物基发生变异碱基TCCG CTAGAT间相互转变 碱基位点增添GA
表6 居群基突变位点情况统计
项目
居群1
居群2
居群3
居群4
原碱基→变异碱基
C→T
T→C
C→G
A→G
G→T
C→A
A→T
T→C
—→G
C→T
T→C
G→A
C→G
C→A
G→T
_→A
T→A
A→C
G→C
T→C
C→T
G→C
C→A
G→T
G→A
T→A
A→C
T→C
C→T
C→G
G→C
C→T
C→A
G→T
A→C
A→T
A→G
碱基变异数目
64
46
112
209
居群碱基变异情况图6示居群1中含27变异位点6样样均5变异位点居群2中含30变异位点11样样均3变异位点居群3中含31变异位点8样样均4变异位点居群4中含44变异位点12样样均4变异位点
图61
图62
图6 居群4 样ITS核苷酸序列分析
ITS属保守序列变异位点少四居群中37样ITS序列变异位点定相似性变异位点集中前端118位点间末端788816位点间49位点发生变异时居群1居群2居群3位点501715116854位点变异样间位点变异样表7居群1中变异1918位点变异变异位点少186变异位点居群2中变异2819位点变异变异位点少2132145变异位点居群3中变异3624位点变异变异位点少338变异位点居群4中变异444930位点变异变异位点少4346变异位点突变位点占074—378
表7 样间位点变异数
居群1
居群2
居群3
居群4
样编号
基（bp）
位点变异数目（）
样编号
基（bp）
位点变异数目（）
样编号
基（bp）
位点变异数目（）
样编号
基（bp）
位点变异数目（）
12
805
8
21
805
8
33
808
8
42
800
19
15
805
10
22
807
10
35
805
22
44
793
30
16
808
10
23
802
7
36
802
24
49
801
30
17
809
11
24
806
10
38
807
9
410
796
27
18
807
6
27
805
6
39
800
25
412
807
15
19
807
18
213
805
5
311
807
17
421
806
15
214
809
5
312
802
15
423
805
11
215
805
9
314
806
13
424
805
7
218
808
19
426
808
11
219
806
14
427
793
22
220
807
8
430
806
11
434
806
6
结讨
1） 试验通ITS—PCR扩增研究硬叶兜兰进行核基ITS间隔子扩增10×PCR buffer1ulMg2+125uldNTP12ul引物025ulTaq酶03ulddH2O345ul基础模板DNA2ul (浓度50ngul)变通实验摸索确定PCR适退火温度度525℃PCR扩增BioRad梯度PCR扩增仪进行反应程序：预变性：94℃4min变性：94℃1min退火：根引物选择合适退火温度525℃1min延伸：72℃90s循环：2435循环72℃延伸10min 4℃放置备Baldwin B G统计子植物核rDNAITS区包括58S rDNA总长度600700bp中ITS1ITS2长度较保守次实验均获条带清晰单拖尾目基片段700800bp间利反应体系预期ITS基片段
2） rDNA ITS ITS158S ITS2 组成58S编码序列进化程中受压力较发生变异较少序列长度碱基组成相保守 ITS1 ITS2 非编码区进化程中受选择压力较碱基变异较存着丰富态性植物鉴定中广泛应利原理鉴种质源硬叶兜兰通NBCI网线分析证实硬叶兜兰ITS基该基属植物源性高99源物种硬叶兜兰杏黄兜兰98源马面兜兰绿叶兜兰96源德式兜兰硬叶兜兰国王兜兰麻栗坡兜兰等95源紫毛兜兰瘤瓣兜兰紫纹兜兰等90源
3） ITS序列(包括58S)相基序列言体群体甚整植物界相保守变异位点较少实验ITS序列位点突变率074—378间变异位点碱基CGAT发生置换缺失碱基位点发生增添53变异位点中C碱基位点占283G碱基位点占113A碱基位点占151T碱基位点占302碱基位点发生增添占151
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