2 株芽孢杆菌生物学特性研究菌种鉴定
陈雅茜 1樊 溢 1Saad Abdelrahman2王景雪 1
（1山西学生命科学学院山西太原 0300062新英格兰学环境农业学院澳利亚阿米代尔 2350）
摘 ：发酵食品分离出 10 株芽孢杆菌中通进行耐酸耐胆盐筛选选取 2 株存活率高菌株
513 A 513 O 2 菌株进行产酶定性试验测定产蛋白酶活力结合细菌形态学生理生化特
征 16S rDNA 序列分析进行鉴定结果显示513 A 短芽孢杆菌513 O Bacillus gobiensis513 A 菌株
pH 值 20 HCl 处理 1 h 存活率达 706103猪胆盐处理 1 h 存活率达 6730513 O 菌株 pH 值 20
HCl 处理 1 h 存活率达 594303猪胆盐处理 1 h 存活率达 87502 株菌株均具产纤维素酶蛋白酶
力产碱性蛋白酶活力分 43676572 UmL短芽孢杆菌具提高饲料利率动物免疫力
功513 A 513 O 2 株菌株作动物饲料添加剂候选菌种潜力513 O 作产碱性蛋白
酶菌种潜力首次发现 Bacillus gobiensis 具产纤维素酶蛋白酶功
关键词：芽孢杆菌饲料添加剂碱性蛋白酶Bacillus gobiensis
中图分类号：S8167 文献标识码：A 文章编号：1002 2481（2018）02 0175 07
Study on Biological Characteristics and Identification of Two Bacillus Species
CHEN Yaqian1FAN Yi1SAAD Abdelrahman2WANG Jingxue1
（1College of Life ScienceShanxi UniversityTaiyuan 030006China
2College of Environment and Rural ScienceNew England UniversityArmidale NSW 2350Australia）
Abstract：2 strains of the 10 Bacillus strains isolated from fermented food were selected by acid and bile salt resistance tests
named 513 A and 513 O The enzyme production of the two strains was tested and the ability of producing protease activity was
determined The two strains were identified combining the synthesis morphology bacterial physiological biochemical characteristics and
16S rDNA sequence analysis The results showed that the strain 513 A was identified as Bacillus pumilus and the strain 513 O was
identified as Bacillus gobiensis The survival rate of 513 A after 1 h HCl treatment （pH＝20）was 7012 and 03 after 1 h pig bile
salt treatment was 6730 The survival rate of 513 O after 1 h HCl treatment （pH＝20）was 5943 and 03 after 1 h pig bile salt
treatment was 8750 Both of the two strains have the ability to produce cellulase and protease and their alkaline protease activity were
4367 6572 UmL respectively The two strains both have the potential to be used as candidate bacteria for probiotics added in animal
feed and 513 O has the potential as an alkaline protease producing strain Besides the function of producing cellulase and protease in
Bacillus gobiensis is found at the first time
Key words：Bacillus feed supplement alcalase Bacillus gobiensis
收稿日期：2017 12 22
作者简介：陈雅茜（1992）女山西吕梁读硕士研究方：细胞生物学王景雪通信作者
doi103969jissn1002248120180206
芽孢杆菌属（Bacillus）类非致病机体
害氧细菌生长繁殖快消化道环境较
强适应力定条件产生芽孢芽孢
特殊结构芽孢杆菌耐酸碱耐高温耐挤压具
稳定性抗性强复活性高等优势[1]肠道酸
性环境中稳定生存国家允许饲料微
生物菌种分泌较强活性蛋白酶纤维素酶
淀粉酶等种活性物质[2]邝哲师等[3]研究发现
断奶仔猪饲养 14 d 添加芽孢杆菌制剂试验
组组胃蛋白酶活性提高 5868胰淀粉酶
活性提高 2405回肠蛋白酶淀粉酶活性分
提高 61 203差异均显著（P＜005）陈连
民等[4]研究发现日粮添加巨芽孢杆菌 1259
效改善产蛋中期蛋鸡生产性蛋品质
量研究表明单饲微生态制剂复合产品添
加家畜饲料中具减少代饲抗生素作
[5 10]
碱性蛋白酶（alkaline protease）广泛应洗
涤剂食品丝绸制革等行业目前市场流行
洗涤添加剂幅度提高洗涤污力
山西农业科学 201846（2）：175 181 Journal of Shanxi Agricultural Sciences
175··山西农业科学 2018 年第 46 卷第 2 期
洗涤添加剂外 21 世纪初研究蛋白
酶脱毛利碱性蛋白酶处理羊毛成国外研
究热点郝建华[11]种新型海洋碱性蛋白酶部
分性质水解羊毛方面做初步研究结果表
明具良处理羊毛特性发展潜力微
生物蛋白酶均胞外酶动植物源蛋白酶相具
易培养产量高成低生产快速处理相简
单等优点易实现规模生产碱性蛋白酶
中性蛋白酶具更强水解力耐碱力
碱性蛋白酶研究成蛋白酶研究热点[12 14]
碱性蛋白酶需求量产生观济效
益筛选产生碱性蛋白酶新型菌株通
适物理化学手段提高产酶量研究碱性蛋白
酶酶学性质直研究热点
试验首先通常规细菌分离纯化方法 10 株
芽孢杆菌分离开筛选出 2 株耐酸耐胆盐产
生纤维素酶蛋白酶菌株测定产蛋白酶
力通微生物常规生理生化检测结合分
子生物学手段鉴定出 1 株短芽孢杆菌1 株
Bacillus gobiens
1 材料方法
11 材料
供试菌株发酵食物中分离 10 株芽
孢杆菌
基础培养基 LB 培养基发酵培养基产纤维
素酶培养基产蛋白酶培养基[14]
12 方法
121 芽孢杆菌分离纯化形态观察
发酵食物中 10 株芽孢杆菌混合菌液接种 LB
液体培养基中37 ℃180 rmin 置恒温摇床培养
24～36 h取 1 mL 富集菌液菌生理盐水
作梯度稀释取 100 μL 10 6 菌液均匀涂布 LB 固
体培养基倒置 37 ℃恒温培养箱培养 24 h
挑取菌落形态单菌落板划线分离培养重复
3～4 次纯化菌株编号观察菌株菌落
形态革兰氏染色镜检挑取菌株分接种
LB 液体培养基扩培养 24 h续试验
122 芽孢杆菌耐酸性试验 LB 液体培养基
中加入 HCl pH 值 20 05接菌量分接
入纯化菌株培养条件 37 ℃180 rmin
未加 HCl 处理培养基样条件培养作
分取酸处理 12 h 菌液组菌液
菌生理盐水稀释 10 510 610 7 浓度梯
度吸 100 μL 均匀涂布板重复 3 板进
行板菌落计数算出均数计算存活率
K＝C1C0×100 （1）
中C1 浓度菌液酸处理时间
活菌均数C0 未做酸处理菌液应浓度
时间活菌均数K 芽孢杆菌存活率
123 芽孢杆菌耐胆盐试验 LB 液体培养基
中加入猪胆盐浓度 03培养条件 122未
加猪胆盐培养基样条件培养作
分取胆盐处理 12 h 菌液组菌液
菌生理盐水稀释 10 510 610 7 浓度梯
度吸 100 μL 均匀涂布板重复 3 板进
行板菌落计数算出均数计算存活率
K＝D1D0 ×100 （2）
中D1 浓度菌液胆盐处理时间
活菌均数D0 未做胆盐处理菌液应浓
度时间活菌均数
124 芽孢杆菌产纤维素酶力试验 灭菌
接种环挑取斜面保存筛选菌株点种产纤维素
酶板中 37 ℃恒温培养箱中培养 72 h培养
产纤维素酶板中加入 2 mL 02刚果红水溶
液显色 30 min倒出显色液加入 3 mL 1 molL NaCl
洗脱液 15 min观察菌落周围否出现水解圈
125 芽孢杆菌产蛋白酶力试验 灭菌接
种环挑取斜面保存筛选菌株点种产蛋白酶
板中 37 ℃恒温培养箱中培养 72 h产蛋白酶
板直接观察否透明水解圈出现
126 酪氨酸标准曲线绘制 参中华民
国国家标准 GBT 23527—2009 标准曲线绘制方
法绘制
127 样品蛋白酶活测定 300 mL 发酵培
养基中 1接种量分接种 513 A 513 O
180 rmin37 ℃培养 24 h 离心收集清液分
加入 30（NH4）2SO4 固体搅拌4 h 8 000 rmin
冷冻离心清液中缓慢加入 70（NH4）2SO4 固
体边加边搅拌整程冰浴进行4 ℃
夜冷冻离心沉淀 10 mL PBS 缓液溶解透
析4 h 换次蒸馏水 AgNO3 检测直没白色
沉淀止制成粗酶液续酶活测定蛋白
酶活力测定参国家标准 GBT 23527—2009 中
样品测定方法测定计算酶活力
128 菌株生理生化特征鉴定 生理生化试验参
常见细菌系统鉴定手册[15]伯杰细菌鉴定手
册[16] 513 A 513 O 分进行 MR 试验VP
176··陈雅茜等：2 株芽孢杆菌生物学特性研究菌种鉴定
试验接触酶试验糖发酵试验丙二酸盐利柠
檬酸盐利渗透压试验硝酸盐原试验亚硝酸
盐原试验明胶液化酯酶试验
129 分子生物学鉴定 细菌总 DNA 提取
Ezup 柱式细菌基组 DNA 抽提试剂盒操作提
取 DNA 模板PCR 扩增引物 16S rDNA 细菌
通引物正引物 27F：5′ AGAGTTTGATCCT
GGCTCAG 3′反引物 1429R：5′ GGTTACCTT
GTTACGACTT 3′扩增条件 94 ℃ 4 min94 ℃
45 s55 ℃ 45 s72 ℃ 1 min30 循环72 ℃ 10 min
4 ℃终止反应PCR 纯化产物海生工生物工程
限公司测序根 16S rDNA 测序结果 NCBI
GenBank 中进行 BLAST 检索利 MEGA 70 软
件进行序列匹配排列采 Neighbor Joining 法
构建系统发育树
2 结果分析
21 芽孢杆菌分离菌落形态观察
10 株测菌革兰氏染色镜检终
确定 K1K2K3513 AK8513 OK10K11K12
K13 号菌株革兰氏阳性菌呈直杆菌芽孢中
生端生均芽孢杆菌观察杆菌菌落形态
描述列表 1中513 A 513 O 菌落形态
显微结构图 1 示
表 1 10 株芽孢杆菌菌落形态
透明度
透明
透明
透明
透明
透明
透明
透明
透明
透明
半透明
菌落颜色
乳白色
白色
灰白色
乳白色
白色
乳白色
乳白色
乳白色
乳白色
淡黄色
菌株
K1
K2
K3
513 A
K8
513 O
K10
K11
K12
K13
菌落直径 mm
45
60
55
35
35
35
45
40
40
50
菌落形态
褶皱凸起边缘整齐表面干燥
环形纹路整齐
火山口状整齐表面干燥
表面纹路边缘整齐表面湿润
环形凸起边缘整齐表面湿润
环形纹路边缘整齐表面干燥
外围环形凸起边缘整齐
表面褶皱边缘整齐表面干燥
表面褶皱表面干燥
表面光滑湿润边缘整齐
22 耐酸性试验结果
图 2 知10 株芽孢杆菌中耐酸
513 A 菌株pH 值 20 酸处理 1 h 存活率
70左右处理 2 h 存活率 50 较耐
酸 513 O 菌株pH 值 20 酸处理 12 h
存活率 50耐酸 K1K2 菌株存
活率分 303 077筛选出 513 A
513 O 2 株耐酸芽孢杆菌
23 耐胆盐试验结果
图 3 知 10 株芽孢杆菌中耐胆盐
513 O 菌株03胆盐处理 1 h 存活率 87
左右处理 2 h 存活率 70左右较耐胆盐
513 A 菌株03胆盐处理 1 h 存活率接
70处理 2 h 存活率 60左右耐胆盐
K1K10 菌株存活率分 1 10左右
筛选出 513 A 513 O 菌株耐胆盐芽孢杆菌
177··山西农业科学 2018 年第 46 卷第 2 期
结合耐酸试验结果终确定 513 A 513 O
菌株作续试验菌种
24 产酶力试验结果
241 产纤维素酶定分析 124 步骤进
行试验结果图 4 示图 4 出
513 A 513 O 菌株周围均出现透明圈说明
513 A 513 O 菌株均产生纤维素酶力
力测量水解圈直径知513 A 菌株
产纤维素酶力 513 O 菌株（图 5）
242 产蛋白酶定分析 124 步骤进行
试验结果图 6 示图 6 出513 A
513 O 菌株周围均出现水解圈说明 513 A
513 O 菌株均产生蛋白酶力力
测量水解圈直径知513 O 菌株产蛋白酶
力 513 A 菌株（图 7）
25 蛋白酶活力测定结果
251 酪氨酸标准曲线绘制 酪氨酸标准
品根酪氨酸含量应吸光度值绘
制标准曲线（y 吸光度值x 酪氨酸含量）图
8 示标准曲线回方程：y＝0009 7x－
0005 1R2＝0999 3
252 菌株蛋白酶活测定结果 127
方法进行试验结果图 9 示
178··27 分子生物学鉴定
分 513 A 513 O 2 菌株细菌 DNA
模板16S rDNA 通引物进行 PCR 扩增获
2 条长度分 1 4261 441 bp PCR 产物系统
进化树构建结果图 1011 示
图 10 知菌株 513 A 短芽孢杆菌遗
传距离亲缘关系测序结果显示513 A
菌株短芽孢杆菌（KC7710511）特异性序列
源性达 99 513 A 菌株短芽孢杆菌生
理生化特征十分相似判定 513 A 菌株短芽孢
杆菌
图 11 知菌株 513 O Bacillus gobiensis
遗传距离亲缘关系测序结果显示
513 O Bacillus gobiensis（NZ CP0126001）特异
性序列源性达 99推断 513 O 菌株
Bacillus gobiensis
表 2 513A 513O 菌株生理生化特征
注：+ 表示阳性反应 表示阴性反应+ 表示属种间细微差异ND 表示未确定
图 9 知513 A 513 O 菌株均酸性蛋
白酶活性513 O 菌株中性蛋白酶碱性蛋白酶
活力均高 513 A 菌株分 56526572 UmL
513 O 菌株碱性蛋白酶活力
26 513A 513O 菌株生理生化特征鉴定
513 A 513 O 菌株生理生化特征列表 2
参考常见细菌系统鉴定手册伯杰氏细菌鉴
定手册进行鉴
项目
生长 NaCl 2
5
10
淀粉水解
硝酸盐原
亚硝酸盐原
明胶液化
柠檬酸盐利
酯酶试验
513 A
+
+
+
+
+
+
短芽孢杆菌
+
+
+
+
+
+
ND
+
+
项目
革兰氏染色
MR 试验
VP 试验
触酶试验
D 葡萄糖产酸
D 麦芽糖产酸
D 果糖产酸
D 半乳糖产酸
D 甘露糖醇产酸
蔗糖产酸
513 A
+
+
+
+
+
+
+
+
+
513 O
+
+
+
+
+
+
+
+
513 O
+
+
+
+
+
短芽孢杆菌
+
+
+
+
+
+
菌株 菌株
陈雅茜等：2 株芽孢杆菌生物学特性研究菌种鉴定
179··3 讨
传统细菌分类鉴定方法菌落形态观察
革兰氏染色等存判断粗略误差等缺点法
满足现代细菌学研究发展求着分子生物学
发展16S rDNA 成细菌系统分类研究中常
效分子指标[17]种类少含量
分子适中约 15 kb 左右结构功具
高度保守性体现菌属间差异
利测序技术较容易序列般认
16SrDNA 序列源性 99认属种
源性 95～98认属种源性
95认属[18 19]试验中 513 A
513 O DNA 进行 PCR 扩增产物片段
分 1 4261 441 bp具典型 16S rDNA
特征 GenBank 中进行序列发现513 A 菌
株短芽孢杆菌特异性序列源性达 99
菌落形态生理生化特性短芽孢杆菌基
致认 513 A 菌株短芽孢杆菌
513 O 菌株 Bacillus gobiensis 特异性序列源性
达 99说明属种结合系统进化树
知 Bacillus gobiensis 亲缘关系初步推断
513 O 菌株 Bacillus gobiensis 16S保
守基者种特基种分子生物学手
段菌种鉴定提供定证
动物体环境十分复杂胃液酸性环
境肠道胆盐环境酶分解作等影响
益生菌存活率重素1 株优良益生菌
必须具备定耐酸性耐胆盐性[20 21]芽孢杆菌
分泌促进动物机体消化营养物质酶类淀粉
酶蛋白质酶纤维素酶等提高动物机饲
料吸收利率试验中筛选出 513 A 513 O
菌株 pH 值 20 酸性 03胆盐环境中
保持较高存活率具较强耐酸耐胆盐
力作饲料添加剂前提通产酶定
性 试 验 出 513 A 菌株产纤维素酶力优
513 O 菌株意味着 513 A 菌株较强消化纤维
素力513 O 菌株产蛋白酶力优 513 A 菌
株意味着 513 O菌株较强消化蛋白力
2 菌株均具作益生菌候选菌种潜力外
研究表明微生物饲料添加剂具维护动物肠道
健康缓解良应激改善畜舍环境净化水质[22]
调节机体脂肪代谢改善畜产品品质等功[23]
目前国外碱性蛋白酶应洗涤皮
山西农业科学 2018 年第 46 卷第 2 期
180··革等行业90洗涤剂均添加碱性蛋白酶
呈升趋势市场出现供应求状况[24]
碱性蛋白酶存细菌放线菌真菌中研
究较种属枯草芽孢杆菌短芽孢杆菌嗜
碱性芽孢杆菌衣芽孢杆菌纳豆芽孢杆菌米曲
酶栖土曲霉灰色链霉菌费氏链霉菌镰刀菌
等[25]国常工业生产产碱性蛋白酶菌株
种类够丰富品种较单试验中筛选出
产碱性蛋白酶菌株 513 O Bacillus gobiensis
国外均鲜报道作产碱性蛋白酶芽孢杆菌
种类补充更加完善产酶菌株体系
试验生理生化特性产酶特性进行初
步研究填补该菌株方面研究空白外
试验筛选出 2 株菌株产碱性蛋白酶活力均
高续通适方法提高产酶
力改变发酵条件诱变育种基工程手
段分子水进行定改造等
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陈雅茜等：2 株芽孢杆菌生物学特性研究菌种鉴定
181··
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陈雅茜 1樊 溢 1Saad Abdelrahman2王景雪 1
（1山西学生命科学学院山西太原 0300062新英格兰学环境农业学院澳利亚阿米代尔 2350）
摘 ：发酵食品分离出 10 株芽孢杆菌中通进行耐酸耐胆盐筛选选取 2 株存活率高菌株
513 A 513 O 2 菌株进行产酶定性试验测定产蛋白酶活力结合细菌形态学生理生化特
征 16S rDNA 序列分析进行鉴定结果显示513 A 短芽孢杆菌513 O Bacillus gobiensis513 A 菌株
pH 值 20 HCl 处理 1 h 存活率达 706103猪胆盐处理 1 h 存活率达 6730513 O 菌株 pH 值 20
HCl 处理 1 h 存活率达 594303猪胆盐处理 1 h 存活率达 87502 株菌株均具产纤维素酶蛋白酶
力产碱性蛋白酶活力分 43676572 UmL短芽孢杆菌具提高饲料利率动物免疫力
功513 A 513 O 2 株菌株作动物饲料添加剂候选菌种潜力513 O 作产碱性蛋白
酶菌种潜力首次发现 Bacillus gobiensis 具产纤维素酶蛋白酶功
关键词：芽孢杆菌饲料添加剂碱性蛋白酶Bacillus gobiensis
中图分类号：S8167 文献标识码：A 文章编号：1002 2481（2018）02 0175 07
Study on Biological Characteristics and Identification of Two Bacillus Species
CHEN Yaqian1FAN Yi1SAAD Abdelrahman2WANG Jingxue1
（1College of Life ScienceShanxi UniversityTaiyuan 030006China
2College of Environment and Rural ScienceNew England UniversityArmidale NSW 2350Australia）
Abstract：2 strains of the 10 Bacillus strains isolated from fermented food were selected by acid and bile salt resistance tests
named 513 A and 513 O The enzyme production of the two strains was tested and the ability of producing protease activity was
determined The two strains were identified combining the synthesis morphology bacterial physiological biochemical characteristics and
16S rDNA sequence analysis The results showed that the strain 513 A was identified as Bacillus pumilus and the strain 513 O was
identified as Bacillus gobiensis The survival rate of 513 A after 1 h HCl treatment （pH＝20）was 7012 and 03 after 1 h pig bile
salt treatment was 6730 The survival rate of 513 O after 1 h HCl treatment （pH＝20）was 5943 and 03 after 1 h pig bile salt
treatment was 8750 Both of the two strains have the ability to produce cellulase and protease and their alkaline protease activity were
4367 6572 UmL respectively The two strains both have the potential to be used as candidate bacteria for probiotics added in animal
feed and 513 O has the potential as an alkaline protease producing strain Besides the function of producing cellulase and protease in
Bacillus gobiensis is found at the first time
Key words：Bacillus feed supplement alcalase Bacillus gobiensis
收稿日期：2017 12 22
作者简介：陈雅茜（1992）女山西吕梁读硕士研究方：细胞生物学王景雪通信作者
doi103969jissn1002248120180206
芽孢杆菌属（Bacillus）类非致病机体
害氧细菌生长繁殖快消化道环境较
强适应力定条件产生芽孢芽孢
特殊结构芽孢杆菌耐酸碱耐高温耐挤压具
稳定性抗性强复活性高等优势[1]肠道酸
性环境中稳定生存国家允许饲料微
生物菌种分泌较强活性蛋白酶纤维素酶
淀粉酶等种活性物质[2]邝哲师等[3]研究发现
断奶仔猪饲养 14 d 添加芽孢杆菌制剂试验
组组胃蛋白酶活性提高 5868胰淀粉酶
活性提高 2405回肠蛋白酶淀粉酶活性分
提高 61 203差异均显著（P＜005）陈连
民等[4]研究发现日粮添加巨芽孢杆菌 1259
效改善产蛋中期蛋鸡生产性蛋品质
量研究表明单饲微生态制剂复合产品添
加家畜饲料中具减少代饲抗生素作
[5 10]
碱性蛋白酶（alkaline protease）广泛应洗
涤剂食品丝绸制革等行业目前市场流行
洗涤添加剂幅度提高洗涤污力
山西农业科学 201846（2）：175 181 Journal of Shanxi Agricultural Sciences
175··山西农业科学 2018 年第 46 卷第 2 期
洗涤添加剂外 21 世纪初研究蛋白
酶脱毛利碱性蛋白酶处理羊毛成国外研
究热点郝建华[11]种新型海洋碱性蛋白酶部
分性质水解羊毛方面做初步研究结果表
明具良处理羊毛特性发展潜力微
生物蛋白酶均胞外酶动植物源蛋白酶相具
易培养产量高成低生产快速处理相简
单等优点易实现规模生产碱性蛋白酶
中性蛋白酶具更强水解力耐碱力
碱性蛋白酶研究成蛋白酶研究热点[12 14]
碱性蛋白酶需求量产生观济效
益筛选产生碱性蛋白酶新型菌株通
适物理化学手段提高产酶量研究碱性蛋白
酶酶学性质直研究热点
试验首先通常规细菌分离纯化方法 10 株
芽孢杆菌分离开筛选出 2 株耐酸耐胆盐产
生纤维素酶蛋白酶菌株测定产蛋白酶
力通微生物常规生理生化检测结合分
子生物学手段鉴定出 1 株短芽孢杆菌1 株
Bacillus gobiens
1 材料方法
11 材料
供试菌株发酵食物中分离 10 株芽
孢杆菌
基础培养基 LB 培养基发酵培养基产纤维
素酶培养基产蛋白酶培养基[14]
12 方法
121 芽孢杆菌分离纯化形态观察
发酵食物中 10 株芽孢杆菌混合菌液接种 LB
液体培养基中37 ℃180 rmin 置恒温摇床培养
24～36 h取 1 mL 富集菌液菌生理盐水
作梯度稀释取 100 μL 10 6 菌液均匀涂布 LB 固
体培养基倒置 37 ℃恒温培养箱培养 24 h
挑取菌落形态单菌落板划线分离培养重复
3～4 次纯化菌株编号观察菌株菌落
形态革兰氏染色镜检挑取菌株分接种
LB 液体培养基扩培养 24 h续试验
122 芽孢杆菌耐酸性试验 LB 液体培养基
中加入 HCl pH 值 20 05接菌量分接
入纯化菌株培养条件 37 ℃180 rmin
未加 HCl 处理培养基样条件培养作
分取酸处理 12 h 菌液组菌液
菌生理盐水稀释 10 510 610 7 浓度梯
度吸 100 μL 均匀涂布板重复 3 板进
行板菌落计数算出均数计算存活率
K＝C1C0×100 （1）
中C1 浓度菌液酸处理时间
活菌均数C0 未做酸处理菌液应浓度
时间活菌均数K 芽孢杆菌存活率
123 芽孢杆菌耐胆盐试验 LB 液体培养基
中加入猪胆盐浓度 03培养条件 122未
加猪胆盐培养基样条件培养作
分取胆盐处理 12 h 菌液组菌液
菌生理盐水稀释 10 510 610 7 浓度梯
度吸 100 μL 均匀涂布板重复 3 板进
行板菌落计数算出均数计算存活率
K＝D1D0 ×100 （2）
中D1 浓度菌液胆盐处理时间
活菌均数D0 未做胆盐处理菌液应浓
度时间活菌均数
124 芽孢杆菌产纤维素酶力试验 灭菌
接种环挑取斜面保存筛选菌株点种产纤维素
酶板中 37 ℃恒温培养箱中培养 72 h培养
产纤维素酶板中加入 2 mL 02刚果红水溶
液显色 30 min倒出显色液加入 3 mL 1 molL NaCl
洗脱液 15 min观察菌落周围否出现水解圈
125 芽孢杆菌产蛋白酶力试验 灭菌接
种环挑取斜面保存筛选菌株点种产蛋白酶
板中 37 ℃恒温培养箱中培养 72 h产蛋白酶
板直接观察否透明水解圈出现
126 酪氨酸标准曲线绘制 参中华民
国国家标准 GBT 23527—2009 标准曲线绘制方
法绘制
127 样品蛋白酶活测定 300 mL 发酵培
养基中 1接种量分接种 513 A 513 O
180 rmin37 ℃培养 24 h 离心收集清液分
加入 30（NH4）2SO4 固体搅拌4 h 8 000 rmin
冷冻离心清液中缓慢加入 70（NH4）2SO4 固
体边加边搅拌整程冰浴进行4 ℃
夜冷冻离心沉淀 10 mL PBS 缓液溶解透
析4 h 换次蒸馏水 AgNO3 检测直没白色
沉淀止制成粗酶液续酶活测定蛋白
酶活力测定参国家标准 GBT 23527—2009 中
样品测定方法测定计算酶活力
128 菌株生理生化特征鉴定 生理生化试验参
常见细菌系统鉴定手册[15]伯杰细菌鉴定手
册[16] 513 A 513 O 分进行 MR 试验VP
176··陈雅茜等：2 株芽孢杆菌生物学特性研究菌种鉴定
试验接触酶试验糖发酵试验丙二酸盐利柠
檬酸盐利渗透压试验硝酸盐原试验亚硝酸
盐原试验明胶液化酯酶试验
129 分子生物学鉴定 细菌总 DNA 提取
Ezup 柱式细菌基组 DNA 抽提试剂盒操作提
取 DNA 模板PCR 扩增引物 16S rDNA 细菌
通引物正引物 27F：5′ AGAGTTTGATCCT
GGCTCAG 3′反引物 1429R：5′ GGTTACCTT
GTTACGACTT 3′扩增条件 94 ℃ 4 min94 ℃
45 s55 ℃ 45 s72 ℃ 1 min30 循环72 ℃ 10 min
4 ℃终止反应PCR 纯化产物海生工生物工程
限公司测序根 16S rDNA 测序结果 NCBI
GenBank 中进行 BLAST 检索利 MEGA 70 软
件进行序列匹配排列采 Neighbor Joining 法
构建系统发育树
2 结果分析
21 芽孢杆菌分离菌落形态观察
10 株测菌革兰氏染色镜检终
确定 K1K2K3513 AK8513 OK10K11K12
K13 号菌株革兰氏阳性菌呈直杆菌芽孢中
生端生均芽孢杆菌观察杆菌菌落形态
描述列表 1中513 A 513 O 菌落形态
显微结构图 1 示
表 1 10 株芽孢杆菌菌落形态
透明度
透明
透明
透明
透明
透明
透明
透明
透明
透明
半透明
菌落颜色
乳白色
白色
灰白色
乳白色
白色
乳白色
乳白色
乳白色
乳白色
淡黄色
菌株
K1
K2
K3
513 A
K8
513 O
K10
K11
K12
K13
菌落直径 mm
45
60
55
35
35
35
45
40
40
50
菌落形态
褶皱凸起边缘整齐表面干燥
环形纹路整齐
火山口状整齐表面干燥
表面纹路边缘整齐表面湿润
环形凸起边缘整齐表面湿润
环形纹路边缘整齐表面干燥
外围环形凸起边缘整齐
表面褶皱边缘整齐表面干燥
表面褶皱表面干燥
表面光滑湿润边缘整齐
22 耐酸性试验结果
图 2 知10 株芽孢杆菌中耐酸
513 A 菌株pH 值 20 酸处理 1 h 存活率
70左右处理 2 h 存活率 50 较耐
酸 513 O 菌株pH 值 20 酸处理 12 h
存活率 50耐酸 K1K2 菌株存
活率分 303 077筛选出 513 A
513 O 2 株耐酸芽孢杆菌
23 耐胆盐试验结果
图 3 知 10 株芽孢杆菌中耐胆盐
513 O 菌株03胆盐处理 1 h 存活率 87
左右处理 2 h 存活率 70左右较耐胆盐
513 A 菌株03胆盐处理 1 h 存活率接
70处理 2 h 存活率 60左右耐胆盐
K1K10 菌株存活率分 1 10左右
筛选出 513 A 513 O 菌株耐胆盐芽孢杆菌
177··山西农业科学 2018 年第 46 卷第 2 期
结合耐酸试验结果终确定 513 A 513 O
菌株作续试验菌种
24 产酶力试验结果
241 产纤维素酶定分析 124 步骤进
行试验结果图 4 示图 4 出
513 A 513 O 菌株周围均出现透明圈说明
513 A 513 O 菌株均产生纤维素酶力
力测量水解圈直径知513 A 菌株
产纤维素酶力 513 O 菌株（图 5）
242 产蛋白酶定分析 124 步骤进行
试验结果图 6 示图 6 出513 A
513 O 菌株周围均出现水解圈说明 513 A
513 O 菌株均产生蛋白酶力力
测量水解圈直径知513 O 菌株产蛋白酶
力 513 A 菌株（图 7）
25 蛋白酶活力测定结果
251 酪氨酸标准曲线绘制 酪氨酸标准
品根酪氨酸含量应吸光度值绘
制标准曲线（y 吸光度值x 酪氨酸含量）图
8 示标准曲线回方程：y＝0009 7x－
0005 1R2＝0999 3
252 菌株蛋白酶活测定结果 127
方法进行试验结果图 9 示
178··27 分子生物学鉴定
分 513 A 513 O 2 菌株细菌 DNA
模板16S rDNA 通引物进行 PCR 扩增获
2 条长度分 1 4261 441 bp PCR 产物系统
进化树构建结果图 1011 示
图 10 知菌株 513 A 短芽孢杆菌遗
传距离亲缘关系测序结果显示513 A
菌株短芽孢杆菌（KC7710511）特异性序列
源性达 99 513 A 菌株短芽孢杆菌生
理生化特征十分相似判定 513 A 菌株短芽孢
杆菌
图 11 知菌株 513 O Bacillus gobiensis
遗传距离亲缘关系测序结果显示
513 O Bacillus gobiensis（NZ CP0126001）特异
性序列源性达 99推断 513 O 菌株
Bacillus gobiensis
表 2 513A 513O 菌株生理生化特征
注：+ 表示阳性反应 表示阴性反应+ 表示属种间细微差异ND 表示未确定
图 9 知513 A 513 O 菌株均酸性蛋
白酶活性513 O 菌株中性蛋白酶碱性蛋白酶
活力均高 513 A 菌株分 56526572 UmL
513 O 菌株碱性蛋白酶活力
26 513A 513O 菌株生理生化特征鉴定
513 A 513 O 菌株生理生化特征列表 2
参考常见细菌系统鉴定手册伯杰氏细菌鉴
定手册进行鉴
项目
生长 NaCl 2
5
10
淀粉水解
硝酸盐原
亚硝酸盐原
明胶液化
柠檬酸盐利
酯酶试验
513 A
+
+
+
+
+
+
短芽孢杆菌
+
+
+
+
+
+
ND
+
+
项目
革兰氏染色
MR 试验
VP 试验
触酶试验
D 葡萄糖产酸
D 麦芽糖产酸
D 果糖产酸
D 半乳糖产酸
D 甘露糖醇产酸
蔗糖产酸
513 A
+
+
+
+
+
+
+
+
+
513 O
+
+
+
+
+
+
+
+
513 O
+
+
+
+
+
短芽孢杆菌
+
+
+
+
+
+
菌株 菌株
陈雅茜等：2 株芽孢杆菌生物学特性研究菌种鉴定
179··3 讨
传统细菌分类鉴定方法菌落形态观察
革兰氏染色等存判断粗略误差等缺点法
满足现代细菌学研究发展求着分子生物学
发展16S rDNA 成细菌系统分类研究中常
效分子指标[17]种类少含量
分子适中约 15 kb 左右结构功具
高度保守性体现菌属间差异
利测序技术较容易序列般认
16SrDNA 序列源性 99认属种
源性 95～98认属种源性
95认属[18 19]试验中 513 A
513 O DNA 进行 PCR 扩增产物片段
分 1 4261 441 bp具典型 16S rDNA
特征 GenBank 中进行序列发现513 A 菌
株短芽孢杆菌特异性序列源性达 99
菌落形态生理生化特性短芽孢杆菌基
致认 513 A 菌株短芽孢杆菌
513 O 菌株 Bacillus gobiensis 特异性序列源性
达 99说明属种结合系统进化树
知 Bacillus gobiensis 亲缘关系初步推断
513 O 菌株 Bacillus gobiensis 16S保
守基者种特基种分子生物学手
段菌种鉴定提供定证
动物体环境十分复杂胃液酸性环
境肠道胆盐环境酶分解作等影响
益生菌存活率重素1 株优良益生菌
必须具备定耐酸性耐胆盐性[20 21]芽孢杆菌
分泌促进动物机体消化营养物质酶类淀粉
酶蛋白质酶纤维素酶等提高动物机饲
料吸收利率试验中筛选出 513 A 513 O
菌株 pH 值 20 酸性 03胆盐环境中
保持较高存活率具较强耐酸耐胆盐
力作饲料添加剂前提通产酶定
性 试 验 出 513 A 菌株产纤维素酶力优
513 O 菌株意味着 513 A 菌株较强消化纤维
素力513 O 菌株产蛋白酶力优 513 A 菌
株意味着 513 O菌株较强消化蛋白力
2 菌株均具作益生菌候选菌种潜力外
研究表明微生物饲料添加剂具维护动物肠道
健康缓解良应激改善畜舍环境净化水质[22]
调节机体脂肪代谢改善畜产品品质等功[23]
目前国外碱性蛋白酶应洗涤皮
山西农业科学 2018 年第 46 卷第 2 期
180··革等行业90洗涤剂均添加碱性蛋白酶
呈升趋势市场出现供应求状况[24]
碱性蛋白酶存细菌放线菌真菌中研
究较种属枯草芽孢杆菌短芽孢杆菌嗜
碱性芽孢杆菌衣芽孢杆菌纳豆芽孢杆菌米曲
酶栖土曲霉灰色链霉菌费氏链霉菌镰刀菌
等[25]国常工业生产产碱性蛋白酶菌株
种类够丰富品种较单试验中筛选出
产碱性蛋白酶菌株 513 O Bacillus gobiensis
国外均鲜报道作产碱性蛋白酶芽孢杆菌
种类补充更加完善产酶菌株体系
试验生理生化特性产酶特性进行初
步研究填补该菌株方面研究空白外
试验筛选出 2 株菌株产碱性蛋白酶活力均
高续通适方法提高产酶
力改变发酵条件诱变育种基工程手
段分子水进行定改造等
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181··
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