现代预防医学 2018 年第 45 卷第 4 期 Modern Preventive Medicine 2018 Vol45 NO4
肠道菌群肠道中定植细菌组成类健
康关重微生态系统仅维持肠道正常
生理组成功拮抗病原微生物入侵促进
免疫器官成熟调控机体免疫应答力[12]肠道
菌群数量例种类分布异常改变时正常菌群
间制约关系失控导致肠道菌群失调尤革
兰阴性菌增加促细胞壁中脂糖
（LipopolysaccharidesLPS）量释放导致毒素破坏
肠黏膜肠壁渗漏LPS 吸收入血激发免疫细胞分
泌炎性子 TNF αIL 1 等干预机体固
适应性免疫应答[3]巨噬细胞树突细胞等表达
TLR4 够识 LPS LPSTLR4 途径调节细胞
游信号通路激活核转录子 （Nuclear transcription
facto Kappa B NF κB） 激 活 子 蛋 白 1
（Transcription factor activating protein 1AP 1）诱
导炎症子趋化子活性氧表达[4]
作者简介：吴遥（1982 ）女硕士护师研究方：肠道菌群失
调机制研究肠道护理
·实验技术应·
肠道菌群失调流感病毒感染鼠急性肺损伤影响
吴遥
锦州医科学附属第医院辽宁锦州 121000
摘：目 探讨肠道菌群失调流感病毒感染鼠急性肺损伤影响作机制方法 BALBc 鼠机分正常
组流感病毒组甲硝唑模型组组12 甲硝唑模型组鼠甲硝唑（18 mgmL）连续灌胃8 dd9 滴鼻
甲型流感病毒 APR84 稀释液（103pfu 鼠）构建肠道菌群失调鼠感染流感病毒模型观察组鼠肺组织盲肠
病理变化检测肺组织中脂糖LPS 炎性相关子肿瘤坏死子 α（Tumor necrosis factor αTNF α）白介
素 1β（Interleukin 1β IL 1β）白介素 6（Interleukin 6IL 6）干扰素 β（Interferon βIFN β）水
采免疫组织化学染色法定位肺组织 Toll 样受体 4（Toll like receptor 4 TLR4）表达情况结果 甲硝唑模型组鼠肺
盲肠组织炎症损伤病理改变情况较病毒组更加严重时鼠肺组织中LPS 含量显著增加差异统计学
意义（P＜005）TNF αIL 1βIL 6IFN β 水明显升高（P＜005）TLR4 甲硝唑模型组鼠肺组织中表
达明显高病毒组差异统计学意义（P＜005）结 肠道菌群失调引起 LPSTLR4 通路激活调鼠肺
组织流感病毒致炎性风暴进步加重流感病毒引起组织病理改变
关键词：肠道菌群流感病毒炎症子TLR4
中图分类号：R5117R5744 文献标志码：A 文章编号：1003 8507（2018）04 694 06
Effect of intestinal flora imbalance on acute lung injury in mice infected
with influenza virus
WU Yao
First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University Jinzhou Liaoning 121000 China
Abstract Objective The aim of this study was to investigate the effect and mechanism of intestinal flora imbalance on acute
lung injury in mice infected with influenza virus Methods The BALBc mice were divided into normal control group
influenza virus control group and metronidazole model group with 12 mice in each group Metronidazole model group was
treated with metronidazole (18 mgmL) for 8 days in order to construct the model of intestinal flora imbalance Then the mice
were infected with influenza virus APR84 (103 pfumouse) by intranasal instillation to construct the model of influenza virus
infection on day 9 The pathological changes of lung tissue and cecum were observed The levels of lipopolysaccharide (LPS)
and inflammatory cytokine of TNFα IL1 IL6 and IFNβ in lung tissue were detected The expression of TLR4 in lung
tissue was determined by immunohistochemistry Results Compared with the virus control group the tissue of lung and cecal
in metronidazole model group showed more severe inflammatory injury while the content of LPS in lung tissue increased
significantly (P<005) The level of TNFα IL1β IL6 IFNβ level were significantly increased (P<005) The location of
TLR4 in the metronidazole model group was significantly higher than that in the virus control group (P<005) Conclusion
Intestinal flora imbalance activated LPSTLR4 pathway then up regulated inflammatory storm caused by influenza virus
infection and further aggravated the histopathological changes in lung tissue of mice infected influenza virus
Keywords Intestinal flora Influenza virus Inflammatory cytokine TLR4
694· ·现代预防医学 2018 年第 45 卷第 4 期 Modern Preventive Medicine 2018 Vol45 NO4
目前研究已证实肠道菌群失调诱发心脑血
分泌系统呼吸系统疾病身免疫系统疾病等
种疾病发生[5]Michael C Abt[6]等研究发现肠道菌群失
调鼠感染流感病毒 I 型Ⅱ型 IFN 表达减少病
毒滴度增加清时间延长鼠抵抗病毒固
适应性免疫应答受损实验选针厌氧菌甲
硝唑流感病毒鼠肺适应株 APR84（PR8）构建肠
道菌群失调鼠感染流感病毒模型探讨肠道菌群
失调流感病毒感染鼠急性肺损伤影响
LPSTLR4 通路作
1 材料方法
1 1 实验动物 SPF级 BALBc 雄性鼠 36 6
周龄体质量 18～20 g购北京维通利华动物处
置方法参关善实验动物指导性意见
1 2 试剂 甲型流感病毒（APR84PR8）国
家疾病预防控制中心传染病防治馈赠甲硝唑
（C6H9N3O3分子量 17115）江西药仁制药
限公司生产片剂（200 mg 片）纯度≥95水溶度
9 500 mgL（25℃）片剂研细精细称取甲硝唑细粉
18 g 100 ml 菌 PBS 缓液中制备甲硝唑混悬
液肠球菌培养基胆汁七叶干叠氮钠琼脂（BAAA）
肠杆菌培养基伊红美蓝琼脂培养基（EMB）总厌氧菌
培养基脑心浸液琼脂（BHI）双歧杆菌培养基（BBL）
乳酸杆菌琼脂培养基（MRS）购北京陆桥RNA 提
取试剂购 QIAGENRT PCR 试剂盒购
TaKaRa鲎试剂盒购海榕柏生物技术限公司
TLR4 抗体购 Abcam
1 3 流感病毒 PR8 培养[7] 200μl PR8 培养液接
种 9～11 d 龄鸡胚尿囊腔中35℃孵育 2～3 d
鸡胚收获前 4℃夜菌收获尿囊液3000 rmin
离心 15 min取清进行空斑实检测 PR8 滴度剩余
清分装80℃保存
1 4 鼠模型建立 36 BALBc 鼠机分
空白组病毒组甲硝唑组组12 空
白组：连续饲养 8 dd9 乙醚麻醉滴鼻 30μl
生理盐水病毒组：连续饲养 8 dd9 乙醚麻醉
滴鼻 30μl PR8 稀释液（PR8 滴度 103pfu 鼠）甲
硝唑模型组：甲硝唑（18 mgml）连续灌胃 8 d200μl
次天 2 次[8]d9 滴鼻 30μl PR8 稀释液（滴度 103
pfu 鼠）PR8 感染 d4 取肺盲肠组织
1 5 肠道细菌培养计数 d8 菌采集 3 组鼠
新鲜粪便进行肠道菌群培养计数鼠粪便
置菌生理盐水中充分混匀稀释 10 8培养
计数 5 种优势菌群：肠球菌肠杆菌总厌氧菌双
歧杆菌乳酸杆菌检测方法参国家标准 GB47893
GB478941GB478913GB478934GB478935 检验方
法细菌计数菌落形成单位数值 g 表示
lgCFUg
1 6 标采集 鼠脱颈处死开胸腔腹腔
菌取肺盲肠组织菌生理盐水洗肺左叶
盲肠置 4聚甲醛中固定肺右叶置 80℃冰
箱保存LPS mRNA 检测
1 7 HE 免疫组化染色 肺左叶盲肠做石蜡包
埋连续5μm 切片HE 免疫组化染色步骤参实
验室操作流程试剂说明书TLR4 抗体羊血清工
作液 1∶100 稀释 IMAGE PRO PLUS 细胞
图分析系统分析
1 8 鲎实验检测 LPS 含量 肺组织匀浆离心取
清具体步骤参试剂说明书 10 EUml
毒素溶液母液稀释成 010250510 EUml 浓
度梯度建立标准曲线545 nm 波长处读取吸光度值
1 9 qPCR 检测 TNF αIL 1βIL 6IFN β
mRNA 水 肺组织匀浆提取 RNA（QIAGEN）
SYBR 法进行步法 qPCR（TaKaRa）引物 TNF α
F 5 CCAAAGGGATGAGAAGTTCC 3R5
CTCCACTTGGTGGTT TGCTA 3IL 6 F 5
ATGAAGTTCCTCTCTGCAAG 3 R5
GTGTAATTAAGC CTCCGACT 3IL 1β F 5
AAGGAGAACCAAGCACGACAAAA 3 R5 TGGG
GAACTCTGCAGACTCAAACT 3IFN β F 5
AGCT CCAAGAAAGGAC GAA CAT 3R5
GCCCTGTAGGTGAGGTTGATCT 3GAPDH F 5
ACCACCATGG AGAAGGCTGG 3 R 5
CTCAGTGTAGCCCAG GATGC 3反应条件：42℃ 5
min95℃ 10 s95℃ 3 s60℃ 30 s 40 循 环
GAPDH 参采 2 ΔΔCT 法计算基相表达
量
1 10 数统计 应 GraphPad Prism SPSS170
统计学软件分析采 one way ANOVA 进行组间
较 LSD 法进行两两较检验水准 α 005
2 结 果
2 1 肠道菌群失调模型建立 正常鼠粪便呈粒
状紧密较硬甲硝唑模型组鼠甲硝唑干预
d8粪便呈松散状态湿润易成型3 组鼠粪便
方差分析肠球菌总厌氧菌双歧杆菌乳酸杆
菌数总体差异均统计学意义（F 24611P＜
0001F 30556P＜0001F 38607P＜0001F
27452P＜0001）甲硝唑模型组肠球菌数量较正
常组显著增总厌氧菌双歧杆菌乳酸杆菌均
明显减少（P＜005）见表1鼠甲硝唑连续灌胃
695· ·现代预防医学 2018 年第 45 卷第 4 期 Modern Preventive Medicine 2018 Vol45 NO4
8 h 肠道 4 种优势菌群数量例均发生异 常证实鼠肠道菌群失调模型建立成功
分组 肠球菌 肠杆菌 总厌氧菌 双歧杆菌 乳酸杆菌
正常组 662±028 724±032 936±087 910±083 894±064
病毒组 645±020 719±028 944±069 892±084 888±060
甲硝唑模型组 755±033a 746±028 704±063a 642±042a 613±047a
2 2 肺组织HE染色 正常组肺泡肺泡隔肺
泡壁支气皮形态正常腔炎性渗出物
病毒组肺泡形态较紊乱肺泡隔轻度断裂少数
肺泡壁增厚腔中度炎性细胞红细胞渗出
甲硝唑模型组肺泡壁弥漫性增厚 局部肺间质实变
腔炎性渗出物支气周围组织结构紊乱伴
结缔组织增生见图 1
表 1 鼠肠道菌群计数（lgCFUgx±sn 12）
注：鼠采集 1 次样进行检测甲硝唑模型组正常组较a 代表 P＜005
注：A：正常组B：病毒组C：甲硝唑模型组D：甲硝唑模型组（白色箭头指示炎性细胞浸润黑色箭头指示红细胞渗出）
图 1 肺组织病理变化(A～C×100D×200)
2 3 盲肠 HE 染色 正常组鼠盲肠结构正
常病毒组鼠盲肠组织轻度肿肠黏膜皮
细胞微水肿肠间质少量炎性细胞浸润红细胞漏
出甲硝唑模型组肠组织肿变形肠黏膜皮细胞
肿胀甚断裂脱落肠间质炎性细胞浸润量
红细胞漏出见图2
2 4 鼠肺组织 LPS 含量 3 组鼠肺组织 LPS 含
量方差分析总体差异统计学意义（F
18143P＜0001）甲硝唑模型组鼠肺中 LPS 含量
明显高病毒组（P＜005）正常组较
病毒组 LPS 含量升高差异统计学意
义（P＞005）见图 3
2 5 TNF αIL 1βIL 6IFN β mRNA 表达
水 3组鼠肺组织TNF αIL 1βIL 6
IFN β mRNA 表达量方差分析指标总体差
异均统计学意义（F 23165P＜0001F 11387
P＜0001F 20737P＜0001F 38494P＜0001）
正常组较病毒组鼠肺组织匀浆液中
696· ·现代预防医学 2018 年第 45 卷第 4 期 Modern Preventive Medicine 2018 Vol45 NO4
TNF αIL 1βIL 6IFN β mRNA 表达量明
显升（P＜005）病毒组较甲硝唑模型组
TNF αIL 1βIL 6IFN β mRNA 表达均
程度增加（P＜005）见图4
注：A：正常组B：病毒组C：甲硝唑模型组D：甲硝唑模型组（白色箭头指示红细胞渗出黑色箭头指示粘膜皮细胞肿胀断裂）
图 2 盲肠组织病理变化(A～C×100D×200)
注：A：正常组B：病毒组C：甲硝唑模型组C组 B 组
较★代表 P＜005
图 3 鼠肺组织中 LPS 含量
2 6 TLR4 组织免疫学染色结果 TLR4 定位细胞
膜阳性表达呈棕黄棕褐等3 组鼠肺组织
TLR4 阳性表达量方差分析总体差异统计学
意义（F 12854P＜0001）正常组较病
毒组 TLR4 阳性表达明显增加（P＜005）病
毒组较甲硝唑模型 TLR4 阳性表达呈升高趋
势（P＜005）见图56
3 讨
Toll 样受体表达巨噬细胞树突细胞T 细胞
组织皮细胞等通识病原相关分子模式抵抗
病原微生物入侵机体抗感染第道防线[9]
病毒入侵早期通介导 TLR4 NF κB 信号
转导通路诱导炎性子趋化子产生控制病
毒侵袭规模病毒感染引起细胞子
高水持续表达细胞子风暴成流感病毒致
机体急性肺损伤机制[1011]肠道微生物维持体
积环境免疫系统稳定机体抵抗病原微生物
干扰发挥重作肠道菌群失调时细菌外膜
毒素 LPS 作引起低水炎症始动素释放
进入血循环 CD14 TLR 结合激活机体固免
疫系统引起机体局部全身非特异性炎症反应[12]
极剧增加促炎性细胞子 IL 1IL 6IL 12
TNF αIFN β 等否会加重流感病毒致急
性肺损伤作机制实验研究重点
697· ·现代预防医学 2018 年第 45 卷第 4 期 Modern Preventive Medicine 2018 Vol45 NO4
研究发现病毒组相甲硝唑诱导
鼠菌群失调感染流感病毒 PR8 鼠肺盲肠组
织表现出严重病理改变炎症损伤肺组织中 TNF
αIL 1βIL 6IFN β 水明显升高
见鼠肠道菌群失调加剧流感病毒致炎性子
分泌肺组织免疫应答发生紊乱导致急性肺损
伤进步恶化鲎实验组化结果显示病毒组
注：A：正常组B：病毒组C：甲硝唑模型组A组 B 组较◆代表 P＜005C组 B 组较★代表 P＜005
图 4 肺组织 TNF αIL 1βIL 6IFN β mRNA 相表达量
注：A：正常组B：病毒组C：甲硝唑模型组D：组化阴性（抗：PBS）
图 5 肺组织 TLR4 表达（×100）
注：A：正常组B：病毒组C：甲硝唑模型组A组 B 组
较◆代表 P＜005C组 B 组较★代表 P＜005
图 6 肺组织 TLR4 阳性表达量
698· ·现代预防医学 2018 年第 45 卷第 4 期 Modern Preventive Medicine 2018 Vol45 NO4
（接第 665 页）
ternationalis 2011 9(1) 385 395
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力影响[J]安徽医科学学报200136（1）：29 32．
收稿日期：2017 09 09
正常组肺组织 LPS 水明显变化病毒
组 TLR4 表达高正常组甲硝唑模型组肺
组织 LPS 水 TLR4 表达量较病毒组
显著升高提示菌群失调诱导 LPS 释放造成肠壁渗
漏LPS 吸收入血达肺肺组织中已流感病毒活
化 TLR4 通识 LPS 进步激活启动 Toll
样受体游信号细胞子发生级联反应干扰机
体流感病毒免疫应答分析菌群失调致
毒素 LPS 调流感病毒激活 TLR4进加
剧 TLR4 NF κB 诱发细胞子风暴肺组织
急性损伤进步恶化Chassaing B[4]等研究发现酒精
导致肠道菌群失调部分细菌 LPS 通血液循环
移肝脏激活 TLR4 信号通路诱发酒精性肝病
发生LPSTLR4NF κB 信号通路通诱发种
致病分子炎症子引起肝纤维化关节炎（CIA）
发生[13 14]Wang X[15]等研究结果显示LPSTLR4 相
互作胰腺 β 细胞氧化应激诱导凋亡中发挥重
作针 LPSTLR4 信号通路抗氧化治疗
脓毒性高血糖症新型治疗方法
综述肠道菌群免疫系统间存联
系高剂量抗生素破坏鼠肠道菌群稳态
促毒素 LPS 干扰机体免疫应答流感病毒入
侵机体时LPS 已激活肺组织 TLR 信号通路导致
肺炎性细胞子风暴加剧肺组织病理损伤加重
难恢复LPS TLR4 加剧流感致细胞子
风暴菌群失调加重流感急性肺损伤关键途径
参考文献
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Molecular Medicine Reports 2017 15(2) 805 812
收稿日期：2017 08 28
699· ·
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肠道菌群肠道中定植细菌组成类健
康关重微生态系统仅维持肠道正常
生理组成功拮抗病原微生物入侵促进
免疫器官成熟调控机体免疫应答力[12]肠道
菌群数量例种类分布异常改变时正常菌群
间制约关系失控导致肠道菌群失调尤革
兰阴性菌增加促细胞壁中脂糖
（LipopolysaccharidesLPS）量释放导致毒素破坏
肠黏膜肠壁渗漏LPS 吸收入血激发免疫细胞分
泌炎性子 TNF αIL 1 等干预机体固
适应性免疫应答[3]巨噬细胞树突细胞等表达
TLR4 够识 LPS LPSTLR4 途径调节细胞
游信号通路激活核转录子 （Nuclear transcription
facto Kappa B NF κB） 激 活 子 蛋 白 1
（Transcription factor activating protein 1AP 1）诱
导炎症子趋化子活性氧表达[4]
作者简介：吴遥（1982 ）女硕士护师研究方：肠道菌群失
调机制研究肠道护理
·实验技术应·
肠道菌群失调流感病毒感染鼠急性肺损伤影响
吴遥
锦州医科学附属第医院辽宁锦州 121000
摘：目 探讨肠道菌群失调流感病毒感染鼠急性肺损伤影响作机制方法 BALBc 鼠机分正常
组流感病毒组甲硝唑模型组组12 甲硝唑模型组鼠甲硝唑（18 mgmL）连续灌胃8 dd9 滴鼻
甲型流感病毒 APR84 稀释液（103pfu 鼠）构建肠道菌群失调鼠感染流感病毒模型观察组鼠肺组织盲肠
病理变化检测肺组织中脂糖LPS 炎性相关子肿瘤坏死子 α（Tumor necrosis factor αTNF α）白介
素 1β（Interleukin 1β IL 1β）白介素 6（Interleukin 6IL 6）干扰素 β（Interferon βIFN β）水
采免疫组织化学染色法定位肺组织 Toll 样受体 4（Toll like receptor 4 TLR4）表达情况结果 甲硝唑模型组鼠肺
盲肠组织炎症损伤病理改变情况较病毒组更加严重时鼠肺组织中LPS 含量显著增加差异统计学
意义（P＜005）TNF αIL 1βIL 6IFN β 水明显升高（P＜005）TLR4 甲硝唑模型组鼠肺组织中表
达明显高病毒组差异统计学意义（P＜005）结 肠道菌群失调引起 LPSTLR4 通路激活调鼠肺
组织流感病毒致炎性风暴进步加重流感病毒引起组织病理改变
关键词：肠道菌群流感病毒炎症子TLR4
中图分类号：R5117R5744 文献标志码：A 文章编号：1003 8507（2018）04 694 06
Effect of intestinal flora imbalance on acute lung injury in mice infected
with influenza virus
WU Yao
First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University Jinzhou Liaoning 121000 China
Abstract Objective The aim of this study was to investigate the effect and mechanism of intestinal flora imbalance on acute
lung injury in mice infected with influenza virus Methods The BALBc mice were divided into normal control group
influenza virus control group and metronidazole model group with 12 mice in each group Metronidazole model group was
treated with metronidazole (18 mgmL) for 8 days in order to construct the model of intestinal flora imbalance Then the mice
were infected with influenza virus APR84 (103 pfumouse) by intranasal instillation to construct the model of influenza virus
infection on day 9 The pathological changes of lung tissue and cecum were observed The levels of lipopolysaccharide (LPS)
and inflammatory cytokine of TNFα IL1 IL6 and IFNβ in lung tissue were detected The expression of TLR4 in lung
tissue was determined by immunohistochemistry Results Compared with the virus control group the tissue of lung and cecal
in metronidazole model group showed more severe inflammatory injury while the content of LPS in lung tissue increased
significantly (P<005) The level of TNFα IL1β IL6 IFNβ level were significantly increased (P<005) The location of
TLR4 in the metronidazole model group was significantly higher than that in the virus control group (P<005) Conclusion
Intestinal flora imbalance activated LPSTLR4 pathway then up regulated inflammatory storm caused by influenza virus
infection and further aggravated the histopathological changes in lung tissue of mice infected influenza virus
Keywords Intestinal flora Influenza virus Inflammatory cytokine TLR4
694· ·现代预防医学 2018 年第 45 卷第 4 期 Modern Preventive Medicine 2018 Vol45 NO4
目前研究已证实肠道菌群失调诱发心脑血
分泌系统呼吸系统疾病身免疫系统疾病等
种疾病发生[5]Michael C Abt[6]等研究发现肠道菌群失
调鼠感染流感病毒 I 型Ⅱ型 IFN 表达减少病
毒滴度增加清时间延长鼠抵抗病毒固
适应性免疫应答受损实验选针厌氧菌甲
硝唑流感病毒鼠肺适应株 APR84（PR8）构建肠
道菌群失调鼠感染流感病毒模型探讨肠道菌群
失调流感病毒感染鼠急性肺损伤影响
LPSTLR4 通路作
1 材料方法
1 1 实验动物 SPF级 BALBc 雄性鼠 36 6
周龄体质量 18～20 g购北京维通利华动物处
置方法参关善实验动物指导性意见
1 2 试剂 甲型流感病毒（APR84PR8）国
家疾病预防控制中心传染病防治馈赠甲硝唑
（C6H9N3O3分子量 17115）江西药仁制药
限公司生产片剂（200 mg 片）纯度≥95水溶度
9 500 mgL（25℃）片剂研细精细称取甲硝唑细粉
18 g 100 ml 菌 PBS 缓液中制备甲硝唑混悬
液肠球菌培养基胆汁七叶干叠氮钠琼脂（BAAA）
肠杆菌培养基伊红美蓝琼脂培养基（EMB）总厌氧菌
培养基脑心浸液琼脂（BHI）双歧杆菌培养基（BBL）
乳酸杆菌琼脂培养基（MRS）购北京陆桥RNA 提
取试剂购 QIAGENRT PCR 试剂盒购
TaKaRa鲎试剂盒购海榕柏生物技术限公司
TLR4 抗体购 Abcam
1 3 流感病毒 PR8 培养[7] 200μl PR8 培养液接
种 9～11 d 龄鸡胚尿囊腔中35℃孵育 2～3 d
鸡胚收获前 4℃夜菌收获尿囊液3000 rmin
离心 15 min取清进行空斑实检测 PR8 滴度剩余
清分装80℃保存
1 4 鼠模型建立 36 BALBc 鼠机分
空白组病毒组甲硝唑组组12 空
白组：连续饲养 8 dd9 乙醚麻醉滴鼻 30μl
生理盐水病毒组：连续饲养 8 dd9 乙醚麻醉
滴鼻 30μl PR8 稀释液（PR8 滴度 103pfu 鼠）甲
硝唑模型组：甲硝唑（18 mgml）连续灌胃 8 d200μl
次天 2 次[8]d9 滴鼻 30μl PR8 稀释液（滴度 103
pfu 鼠）PR8 感染 d4 取肺盲肠组织
1 5 肠道细菌培养计数 d8 菌采集 3 组鼠
新鲜粪便进行肠道菌群培养计数鼠粪便
置菌生理盐水中充分混匀稀释 10 8培养
计数 5 种优势菌群：肠球菌肠杆菌总厌氧菌双
歧杆菌乳酸杆菌检测方法参国家标准 GB47893
GB478941GB478913GB478934GB478935 检验方
法细菌计数菌落形成单位数值 g 表示
lgCFUg
1 6 标采集 鼠脱颈处死开胸腔腹腔
菌取肺盲肠组织菌生理盐水洗肺左叶
盲肠置 4聚甲醛中固定肺右叶置 80℃冰
箱保存LPS mRNA 检测
1 7 HE 免疫组化染色 肺左叶盲肠做石蜡包
埋连续5μm 切片HE 免疫组化染色步骤参实
验室操作流程试剂说明书TLR4 抗体羊血清工
作液 1∶100 稀释 IMAGE PRO PLUS 细胞
图分析系统分析
1 8 鲎实验检测 LPS 含量 肺组织匀浆离心取
清具体步骤参试剂说明书 10 EUml
毒素溶液母液稀释成 010250510 EUml 浓
度梯度建立标准曲线545 nm 波长处读取吸光度值
1 9 qPCR 检测 TNF αIL 1βIL 6IFN β
mRNA 水 肺组织匀浆提取 RNA（QIAGEN）
SYBR 法进行步法 qPCR（TaKaRa）引物 TNF α
F 5 CCAAAGGGATGAGAAGTTCC 3R5
CTCCACTTGGTGGTT TGCTA 3IL 6 F 5
ATGAAGTTCCTCTCTGCAAG 3 R5
GTGTAATTAAGC CTCCGACT 3IL 1β F 5
AAGGAGAACCAAGCACGACAAAA 3 R5 TGGG
GAACTCTGCAGACTCAAACT 3IFN β F 5
AGCT CCAAGAAAGGAC GAA CAT 3R5
GCCCTGTAGGTGAGGTTGATCT 3GAPDH F 5
ACCACCATGG AGAAGGCTGG 3 R 5
CTCAGTGTAGCCCAG GATGC 3反应条件：42℃ 5
min95℃ 10 s95℃ 3 s60℃ 30 s 40 循 环
GAPDH 参采 2 ΔΔCT 法计算基相表达
量
1 10 数统计 应 GraphPad Prism SPSS170
统计学软件分析采 one way ANOVA 进行组间
较 LSD 法进行两两较检验水准 α 005
2 结 果
2 1 肠道菌群失调模型建立 正常鼠粪便呈粒
状紧密较硬甲硝唑模型组鼠甲硝唑干预
d8粪便呈松散状态湿润易成型3 组鼠粪便
方差分析肠球菌总厌氧菌双歧杆菌乳酸杆
菌数总体差异均统计学意义（F 24611P＜
0001F 30556P＜0001F 38607P＜0001F
27452P＜0001）甲硝唑模型组肠球菌数量较正
常组显著增总厌氧菌双歧杆菌乳酸杆菌均
明显减少（P＜005）见表1鼠甲硝唑连续灌胃
695· ·现代预防医学 2018 年第 45 卷第 4 期 Modern Preventive Medicine 2018 Vol45 NO4
8 h 肠道 4 种优势菌群数量例均发生异 常证实鼠肠道菌群失调模型建立成功
分组 肠球菌 肠杆菌 总厌氧菌 双歧杆菌 乳酸杆菌
正常组 662±028 724±032 936±087 910±083 894±064
病毒组 645±020 719±028 944±069 892±084 888±060
甲硝唑模型组 755±033a 746±028 704±063a 642±042a 613±047a
2 2 肺组织HE染色 正常组肺泡肺泡隔肺
泡壁支气皮形态正常腔炎性渗出物
病毒组肺泡形态较紊乱肺泡隔轻度断裂少数
肺泡壁增厚腔中度炎性细胞红细胞渗出
甲硝唑模型组肺泡壁弥漫性增厚 局部肺间质实变
腔炎性渗出物支气周围组织结构紊乱伴
结缔组织增生见图 1
表 1 鼠肠道菌群计数（lgCFUgx±sn 12）
注：鼠采集 1 次样进行检测甲硝唑模型组正常组较a 代表 P＜005
注：A：正常组B：病毒组C：甲硝唑模型组D：甲硝唑模型组（白色箭头指示炎性细胞浸润黑色箭头指示红细胞渗出）
图 1 肺组织病理变化(A～C×100D×200)
2 3 盲肠 HE 染色 正常组鼠盲肠结构正
常病毒组鼠盲肠组织轻度肿肠黏膜皮
细胞微水肿肠间质少量炎性细胞浸润红细胞漏
出甲硝唑模型组肠组织肿变形肠黏膜皮细胞
肿胀甚断裂脱落肠间质炎性细胞浸润量
红细胞漏出见图2
2 4 鼠肺组织 LPS 含量 3 组鼠肺组织 LPS 含
量方差分析总体差异统计学意义（F
18143P＜0001）甲硝唑模型组鼠肺中 LPS 含量
明显高病毒组（P＜005）正常组较
病毒组 LPS 含量升高差异统计学意
义（P＞005）见图 3
2 5 TNF αIL 1βIL 6IFN β mRNA 表达
水 3组鼠肺组织TNF αIL 1βIL 6
IFN β mRNA 表达量方差分析指标总体差
异均统计学意义（F 23165P＜0001F 11387
P＜0001F 20737P＜0001F 38494P＜0001）
正常组较病毒组鼠肺组织匀浆液中
696· ·现代预防医学 2018 年第 45 卷第 4 期 Modern Preventive Medicine 2018 Vol45 NO4
TNF αIL 1βIL 6IFN β mRNA 表达量明
显升（P＜005）病毒组较甲硝唑模型组
TNF αIL 1βIL 6IFN β mRNA 表达均
程度增加（P＜005）见图4
注：A：正常组B：病毒组C：甲硝唑模型组D：甲硝唑模型组（白色箭头指示红细胞渗出黑色箭头指示粘膜皮细胞肿胀断裂）
图 2 盲肠组织病理变化(A～C×100D×200)
注：A：正常组B：病毒组C：甲硝唑模型组C组 B 组
较★代表 P＜005
图 3 鼠肺组织中 LPS 含量
2 6 TLR4 组织免疫学染色结果 TLR4 定位细胞
膜阳性表达呈棕黄棕褐等3 组鼠肺组织
TLR4 阳性表达量方差分析总体差异统计学
意义（F 12854P＜0001）正常组较病
毒组 TLR4 阳性表达明显增加（P＜005）病
毒组较甲硝唑模型 TLR4 阳性表达呈升高趋
势（P＜005）见图56
3 讨
Toll 样受体表达巨噬细胞树突细胞T 细胞
组织皮细胞等通识病原相关分子模式抵抗
病原微生物入侵机体抗感染第道防线[9]
病毒入侵早期通介导 TLR4 NF κB 信号
转导通路诱导炎性子趋化子产生控制病
毒侵袭规模病毒感染引起细胞子
高水持续表达细胞子风暴成流感病毒致
机体急性肺损伤机制[1011]肠道微生物维持体
积环境免疫系统稳定机体抵抗病原微生物
干扰发挥重作肠道菌群失调时细菌外膜
毒素 LPS 作引起低水炎症始动素释放
进入血循环 CD14 TLR 结合激活机体固免
疫系统引起机体局部全身非特异性炎症反应[12]
极剧增加促炎性细胞子 IL 1IL 6IL 12
TNF αIFN β 等否会加重流感病毒致急
性肺损伤作机制实验研究重点
697· ·现代预防医学 2018 年第 45 卷第 4 期 Modern Preventive Medicine 2018 Vol45 NO4
研究发现病毒组相甲硝唑诱导
鼠菌群失调感染流感病毒 PR8 鼠肺盲肠组
织表现出严重病理改变炎症损伤肺组织中 TNF
αIL 1βIL 6IFN β 水明显升高
见鼠肠道菌群失调加剧流感病毒致炎性子
分泌肺组织免疫应答发生紊乱导致急性肺损
伤进步恶化鲎实验组化结果显示病毒组
注：A：正常组B：病毒组C：甲硝唑模型组A组 B 组较◆代表 P＜005C组 B 组较★代表 P＜005
图 4 肺组织 TNF αIL 1βIL 6IFN β mRNA 相表达量
注：A：正常组B：病毒组C：甲硝唑模型组D：组化阴性（抗：PBS）
图 5 肺组织 TLR4 表达（×100）
注：A：正常组B：病毒组C：甲硝唑模型组A组 B 组
较◆代表 P＜005C组 B 组较★代表 P＜005
图 6 肺组织 TLR4 阳性表达量
698· ·现代预防医学 2018 年第 45 卷第 4 期 Modern Preventive Medicine 2018 Vol45 NO4
（接第 665 页）
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收稿日期：2017 09 09
正常组肺组织 LPS 水明显变化病毒
组 TLR4 表达高正常组甲硝唑模型组肺
组织 LPS 水 TLR4 表达量较病毒组
显著升高提示菌群失调诱导 LPS 释放造成肠壁渗
漏LPS 吸收入血达肺肺组织中已流感病毒活
化 TLR4 通识 LPS 进步激活启动 Toll
样受体游信号细胞子发生级联反应干扰机
体流感病毒免疫应答分析菌群失调致
毒素 LPS 调流感病毒激活 TLR4进加
剧 TLR4 NF κB 诱发细胞子风暴肺组织
急性损伤进步恶化Chassaing B[4]等研究发现酒精
导致肠道菌群失调部分细菌 LPS 通血液循环
移肝脏激活 TLR4 信号通路诱发酒精性肝病
发生LPSTLR4NF κB 信号通路通诱发种
致病分子炎症子引起肝纤维化关节炎（CIA）
发生[13 14]Wang X[15]等研究结果显示LPSTLR4 相
互作胰腺 β 细胞氧化应激诱导凋亡中发挥重
作针 LPSTLR4 信号通路抗氧化治疗
脓毒性高血糖症新型治疗方法
综述肠道菌群免疫系统间存联
系高剂量抗生素破坏鼠肠道菌群稳态
促毒素 LPS 干扰机体免疫应答流感病毒入
侵机体时LPS 已激活肺组织 TLR 信号通路导致
肺炎性细胞子风暴加剧肺组织病理损伤加重
难恢复LPS TLR4 加剧流感致细胞子
风暴菌群失调加重流感急性肺损伤关键途径
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