分子生物学基工程实验报告
绿色荧光蛋白(GFP)基克隆表达
背景知识
绿色荧光蛋白（green fluorescent proteinGFP）类存包括水母水螅珊瑚等腔肠动物体生物发光蛋白受紫外蓝光激发时GFP 发射绿色荧光产生荧光需底物辅子发色团蛋白质级序列固GFP 3 外显子组成长26kbGFP 238 氨基酸组成单体蛋白相分子质量270kMr蛋白性质十分稳定耐受60℃处理1996 年GFP 晶体结构解出蛋白质中央圆柱形水桶样结构长420 nm宽240 nm11 围绕中心α螺旋反行β折叠组成荧光基团形成螺旋开始桶顶部3 短垂直片段覆盖底部短垂直片段覆盖荧光活性重生色团位空腔发色团蛋白质部第6567位SerTyrGly身环化氧化形成
1996 年GFP 晶体结构解出蛋白质中央圆柱形水桶样结构长420 nm宽240 nm11 围绕中心α螺旋反行β折叠组成荧光基团形成螺旋开始桶顶部3 短垂直片段覆盖底部短垂直片段覆盖荧光活性重生色团位空腔
绿色荧光蛋白(GFP)基克隆表达
实验目
学掌握种常质粒DNA提取方法：碱裂解法该法量培养物中抽提质粒DNA较方便省时提取质粒DNA质量较高DNA酶切PCR甚测序学利核酸蛋白测定仪测算核酸浓度纯度掌握种常分离鉴定纯化DNA片段较方便省时技术：琼脂糖凝胶电泳基原理操作方法学限制型切酶进行DNA酶切原理方法解掌握肠杆菌感受态细胞制备方法原理操作点质粒DNA转化肠杆菌细胞原理方法掌握双酶切法鉴定重组质粒DNA基原理操作步骤菌落PCR法鉴定重组质粒DNA基原理解菌落PCR法鉴定菌落保存操作方法掌握IPTG诱导GFP基表达基原理基操作步骤实验训练学生聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质外需掌握蛋白质转移硝酸纤维素膜转移电泳技术运酶法显色蛋白质通实验学生学会检测表达蛋白质分子生物学重技术
二基原理
1质粒DNA分离纯化原理：
质粒类细菌细胞发现独立染色体外够复制稳定遗传单位迄止细菌中分离质粒环型双链DNA分子分子量范围1kb200kb质粒DNA持续稳定处染色体外游离状态定条件会逆整合寄染色体着染色体复制复制通细胞分裂传递代数情况质粒DNA复制中酶体系细菌染色体复制时酶相质粒复制受宿细胞复制作严格限制细胞中含拷贝称严谨型质粒质粒复制受宿细胞控制严称松弛型质粒细胞中数目达
10200拷贝宿细胞蛋白质合成受抑制时（例氯霉素处理）细菌染色体增加松弛型质粒DNA继续复制细胞拷贝数增千千
质粒具定生物功带抗药标记质粒DNA方法转化进细菌时转化细菌会表现出质粒基具新生物表现型例含抗药基质粒转入细菌原抗药性细菌表现出抗药新表型助转化菌获新表型特征证实质粒已转入宿细菌中样作转化菌选择性标记
质粒作基克隆载体分子重条件获批量纯化质粒DNA分子目前已许方法质粒DNA提取包括三基步骤：细菌生长质粒扩增菌体收集裂解质粒DNA分离质粒DNA纯化
（1）细菌生长质粒扩增
琼脂培养基板挑取单菌落接种含适抗生素液体培养基中培养松弛型质粒（pUC系列）说培养物放标准LB2YT培养基中生长数晚期量提取质粒必选择性扩增质粒DNA严谨型质粒（pBR322）说需部分生长细菌培养物中加入氯霉素继续培养干时便质粒进行选择性扩增
（2）菌体收集裂解质粒DNA分离
质粒分离基原理利宿菌（般肠杆菌菌株）DNA质粒DNA间两种性质差异：（1）肠杆菌染色体较般载体质粒DNA（2）细胞中提取肠杆菌DNA体变性线性分子数质粒DNA价闭合环状分子里介绍碱裂解法基原理：细菌悬浮液中加入SDS（十二烷基硫酸钠）NaOH菌体裂解（时需先溶菌酶水解细胞壁）处理破坏碱基配细菌线状染色体DNA变性闭环质粒DNA链处拓扑缠绕状态彼分开条件恢复正常时（加入酸性NaAcKac中碱性NaOH）质粒DNA链迅速准确配重新恢复成天然超螺旋分子通离心染色体DNA变性蛋白质RNA分子起沉淀质粒超螺旋分子滞留清中
（3）质粒DNA提纯
量制备质粒DNA苯酚抽提RNA酶消化酒精沉淀等简单步骤残余蛋白质RNA达纯化目
质粒DNA分子具三种构型：价闭合环形DNA（cccDNASC构型）开环DNA（OC构型）线性分子（L构型）细菌体质粒DNA负超螺旋构型存琼脂糖凝胶电泳中构型种质粒DNA分子量相具电泳迁移率中走前SC DNA次L DNAOC DNA
2琼脂糖凝胶电泳原理：
影响DNA琼脂糖凝胶中迁移速率素：（1）DNA分子 双链DNA分子凝胶基质中迁移速率碱基数常数成反分子越迁移越慢摩擦阻力越分子通凝胶孔径效率低较分子（2）琼脂糖浓度 定线状DNA片段浓度琼脂糖凝胶中迁移速率DNA电泳迁移速率数凝胶浓度间存线性相关（3）DNA构象 超螺旋环状（Ⅰ型）切口环状（Ⅱ型）线状（Ⅲ型）DNA琼脂糖凝胶中速率迁移相迁移速率取决琼脂糖凝胶浓度类型次电流强度缓液离子强度Ⅰ型超螺旋绞紧程度密度条件Ⅰ型DNAⅢ型迁移快条件序相反（4）电压 低电压时DNA片段迁移率电压成正电场强度升高时高分子量片段迁移率遂成例增加电压增时琼脂糖凝胶分离效范围反减获2kb DNA片段良分辨率电压应高58Vcm（5）电泳缓液 DNA泳动受电泳缓液组成离子强度影响缺乏离子电导率降低DNA者动者迁移慢高离子强度时（10×buffer）电导率升高应适中电压会产生量热严重时凝胶会熔化DNA变性
3酶切连接原理：
迄已发现3000种限制性切酶传统限制性切酶亚基组成酶切位置识位点辅助子等素划分三类II型酶识位点中确定位点特异切开DNA链产生确定限制片段三类限制性切酶中唯DNA分析克隆类
II型限制性切酶中普遍象EcoR IHind IIIBamHINot I样识序列中进行切割酶类酶构成商业化酶部分部分类酶二聚体形式结合
DNA识称序列极少酶作单聚体结合DNA识非称序列酶识连续序列（EcoR I识GAATTCHind III识AAGCTTBamHI识G↓GATCC Not I识GC↓GGCCGC）识连续序列（Bgl I识GCCNNNNNGGC）限制性切酶酶切DNA形成两种类型末端：(i)两条链断裂位置交错产生粘性末端EcoR I酶切产生末端(ii)两条链断裂位置处称结构
中心产生末端HaeIII酶切产生DNA连接酶够催化两条DNA链间形成磷酸二酯键种酶需条DNA链3’末端具游离羟基（OH）条DNA链5’末端具磷酸基团（P）
4肠杆菌感受态细胞制备转化原理：
外源DNA转化肠杆菌细胞扩增感受态指细菌细胞具够接受外源DNA种特殊生理状态肠杆菌感受态CaCl2处理诱导产生：正生长肠杆菌细胞0℃加入低渗CaCl2溶液中便会细胞膜透性发生改变时细胞呈现感受态方法批量制备感受态细胞转化效率达5×1062×107转化克隆子μg超螺旋质粒DNA制备肠杆菌感受态细胞70℃冻存
0℃外源DNA吸附感受态细胞表面短时间热刺激（42℃90s）诱导细胞吸收DNA转化质粒DNA肠杆菌培养基中37℃培养1hr质粒DNA中编码抗生素抗性基表达转化质粒DNA肠杆菌细胞含相应抗生素培养基生长没转化细胞法生长
5重组质粒DNA鉴定（双酶切法菌落PCR法）原理：
重组质粒DNA利限制性切酶（BamH INot I）分酶切基片段质粒利基片段质粒DNA端带相粘性末端连接起重组质粒果利相限制性切酶识重组基片段两侧酶切位点通酶切重组片段连接基片段否相判断质粒DNA否重组质粒
单菌落提取质粒DNA通PCR方法鉴定正确克隆聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction简称PCR）体外酶促合成特异DNA片段种方法典型
PCR高温变性低温退火适温延伸等三步反应组成循环周期通次循环反应目DNA迅速扩增步骤：扩增DNA置高温解链工合成两寡核苷酸引物低温分目片段两侧DNA两条链互补结合DNA聚合酶72℃单核苷酸引物3’端开始掺入模板5’→3’方延伸合成DNA新互补链
具体说PCR反应系统寡核苷酸引物反应缓液热稳定DNA聚合酶（Taq酶）脱氧核苷三磷酸底物靶序列（模板）等五部分组成缺
PCR技术试中建立反应数时极微量某特定目DNA片段扩增106倍需烦琐基克隆程序便获足够数量精确DNA拷贝操作简单易掌握结果较基分析研究提供种强力手段整生命科学研究发展深远影响PCR技术产生时间长惊速度广泛应分子生物学领域基分离克隆核苷酸序列分析突变体重组体构建基表达调控研究基态性分析遗传病传染病诊断肿瘤机制探索法医鉴定等诸方面
6GFP蛋白诱导表达原理：
IPTG（异丙基硫代βL半乳糖苷）种常见诱导基表达诱导剂结构类似乳糖GFP基连接pET28a克隆位点（MCS）GFP基表达受游T7启动子操基O位点结合式作元件蛋白子控制LacI基编码调节蛋白四聚体形式结合操基O位点关闭GFP基表达IPTG四聚体调节蛋白结合改变调节蛋白构象调节蛋白O位点结合接着BL21编码T7 RNA聚合酶结合T7启动子位点启动GFP基表达
7Westernblotting原理：
蛋白质印迹（Westernblotting）蛋白质转移固定化学合成膜支撑物利抗原抗体反应原理抗作探针目蛋白作连接带标记二抗抗作显色显色位置目蛋白种高强力形成印迹方法称Westernblotting技术
作抗原物质：天然蛋白重组蛋白偶联肽等抗原通常抗原决定簇组成种抗原决定簇刺激机体
B淋巴细胞接受该抗原产生抗体称单克隆抗体（Monclone antibody）种抗原决定簇刺激机体相应产生种样单克隆抗体单克隆抗体混杂起克隆抗体机体产生抗体克隆抗体克隆抗体识抗原表位制备时间短成低原广泛应研究诊断方面
第抗体非抗体性抗原特异性结合蛋白种类包括单克隆抗体克隆抗体
第二抗体抗体集合抗体抗体作检测抗体存放抗信号二抗利抗体分子蛋白质具抗原性性质免疫异种动物异种动物免疫系统产生免疫球蛋白抗充抗原刺激机体产生抗体二抗带检测标记荧光放射性化学发光显色集团
His标签蛋白质重组技术中常种标签序列六组氨酸特点分子量基改变蛋白质生物结构蛋白质溶解性目蛋白质检测纯化方面极方便His标签抗体检测His标签融合蛋白表达细胞定位定性定量检测His融合表达蛋白等
免疫印迹实验包括5步骤：
（1） 固定：蛋白质进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）胶转移硝酸纤维素膜
（2）封闭（blocked）：保持膜没特殊抗体结合场场处饱状态保护特异性抗体结合膜蛋白质反应
（3）初级抗体（第抗体）特异性
（4）第二抗体配体试剂初级抗体特异性结合作指示物
（5）适保温酶标记蛋白质区带产生见溶解状态颜色反应
三实验材料仪器试剂
1．实验材料
含pEGFP－N3肠杆菌液含pET28a DNA肠杆菌液DH5αBL21pET28a重组质粒DNA正引物：5’ggg CAT ATg gTg AgC AAg ggC gAg g3’反引物：5’ggg CTC gAg TTA CTT gTA CAg CTC g3’第抗体（兔源His标签抗体）第二抗体（羊抗兔Ig克隆抗体）
2．仪器
恒温培养箱超净工作台恒温摇床制冰机台式离心机掌中宝离心机型混合器冰箱
移液枪核酸电泳仪型混合器冰箱蓝盾见光透射仪水浴锅移液器电泳槽电泳仪振荡器蓝盾见光透射仪凝胶成仪高压灭菌锅离心机PCR仪15ml离心蛋白质电泳槽蛋白质电转移槽套（百晶公司）硝酸纤维素滤膜直径20cm10cm培养皿剪刀镊子刀片普通滤纸
3．试剂
BamH I(10UμL) (TaKaRa公司)Not I(10UμL)(TaKaRa公司)T4 ligase1琼脂糖凝胶 LB（LuriaBertain）液体固体培养基
四实验步骤
1质粒DNA分离纯化：
（1）取20ml DH5α培养液倒入20mL 离心中13000rpm离心1min
（2）重复1
（3）弃清倒置卫生纸数分钟液体流
（4）菌体沉淀重悬浮100μL溶液Ⅰ中(需剧烈振荡)室温放置10min
（5）加入新配制溶液Ⅱ200μL（SDSNaOH等量混匀）盖紧口快速温颠倒离心5次混匀容物(千万振荡)冰浴5min
（6）加入150μL预冷溶液Ⅲ盖紧口倒置离心温振荡3次沉淀混匀冰浴中15分钟13000rpm离心10min
（7）吸取400μL清液移入干净离心中加入800μl等体积氯仿异戊醇(24：1)振荡混匀静置10min（重复）
（8）水相300μL移入干净离心中加入800μl等体积氯仿异戊醇(24：1)振荡混匀13000rpm离心2min
（9） 水相移入干净离心中加入2 倍体积水乙醇振荡混匀置室温10min然13000rpm离心10min
（10）弃清
（11）吸清液倒置卫生纸液体流室温干燥
（12）沉淀溶30μL ddH2O中取溶解质粒液18μL进行加入酶切体系剩余12μL 保存20℃冰箱中
（13）样流程方法pET28a质粒提出保存20℃冰箱中
2 酶切连接
双酶切体系（30μL）混合：
反应物
pEGFPN3（μL）
pET28a（μL）
质粒
18
18
BamH I
2
2
Not I
2
2
10×buffer K
3
3
ddH2O
5
5
（1）37℃水浴酶切23h
（2）配制10（MV）普通琼脂糖凝胶30ml
（3）适放置冷60℃左右倒电泳胶板插梳子
（4）凝胶凝固拨梳子
（5）酶切样品中加入5µl样缓液（含GeneFinder）混匀全部样
（6）1×TBE Buffer80V(34Vcm)电泳30min观察结果拍
（7）干净刀片需DNA条带凝胶切称取重量01g凝胶应300μL体积加入PN
（8） 50℃水浴放置10min期间断温翻动离心胶完全融解
（9）步溶液加入吸附柱中吸附柱放入收集静置3min13000rpm离心60s弃掉废液
（10）加入750μL漂洗液PW13000rpm离心60s弃掉废液重复次
（11）取出吸附柱放入干净离心中吸附膜中间位置加入适量洗脱缓液EB 30μL洗脱缓液先室温放置2min13000rpm离心1min然离心溶液重新加回离心吸附柱中13000rpm离心1min
连接体系进行16℃室温连接夜
反应物
体积μL
回收纯化pET28a质粒
5
gfp基片段
12
T4连接酶
1
缓液（10×）
2
3 肠杆菌感受态细胞制备转化
3． 1感受态细胞制备 (CaCl2法)
（1）活化DH5αBL21培养液转入2mL离心中冰放置10min然4℃4000rpm离心5min
（2）弃清预冷01molL CaCl2溶液600μL轻轻悬浮细胞冰放置20min 4℃4000rpm离心5min
（3）弃清加入300μL预冷01molLCaCl2溶液轻轻悬浮细胞冰放置5min成感受态细胞悬液80℃长期保存
32转化涂板
（1）取2菌离心分加入100μL DH5α感受态细胞悬液第1加5μl菌水第2加入质粒DNA溶液5μl轻轻摇匀冰放置30min
（2）42℃水浴中热激90s热激迅速置冰冷5min
（3）分中加入100μL LB液体培养基混匀37℃振荡培养30min
（4）1中取50μL涂布含抗生素含抗生素板2中取50μL涂布含抗生素板正面放置约10分钟菌液完全培养基吸收倒置培养皿37℃培养20时凝胶成系统采集图片
1 1 2
50μL 50μL 50μL
ddH2O ddH2O 重组质粒
4重组质粒DNA鉴定（菌落PCR法）
（1）挑取菌落
机挑取1菌落首先菌枪头挑取菌落已准备含卡抗菌素分区固体培养基中轻划（保菌种）然余菌置离心中（作PCR反应模板）
（2）PCR反应体系（20μl）
反应物
体积
dNTP（10mM）
2
左引物
05
右引物
05
Taq酶（5UμL）
05
MgCl2(25mM)
12
10×Buffer
2
ddH2O
133
（3）PCR循环：
95℃ 5min予变性
（95℃30s58℃30s72℃60s）30cycles
72℃ 10min延伸
（4）PCR产物检测
PCR产物加入5μl溴酚蓝GeneFinder混合液分编号加入DNA琼脂糖凝胶电泳加样孔1琼脂糖电泳分离
（5）荧光激发器结果采集片
5 GFP蛋白诱导表达
（1）取3组培养含重组质粒DNA肠杆菌液2ml2ml离心中加入IPTG3μL分诱导0h1h2h
（2）分取15ml10000rpm离心5min清收集沉淀重复次收集沉淀
（3）观察蛋白表达：紫外线射菌体沉淀培养板绿色荧光分均匀涂布板表达蛋白样品相保存片
6 Westernblotting
61 蛋白质电泳
（1）洗净电泳玻璃板晾干仪器说明装
（2）配12％分离胶8mL分取：
30％丙烯酰胺 32mL
15M pH88TrisHCl 208mL
（分离胶缓液）
10％SDS 8μL
TEMED 10μL
双蒸水 264mL 混匀加
10％硫酸铵 30μL 混匀灌胶
（3）灌分离胶面双蒸水封
（4）分离胶凝固(凝胶时间半时左右)配6％浓缩胶（23ml）：
30％丙烯酰胺 045mL
05M pH68TrisHCl 06mL
（浓缩胶缓液）
10％SDS 225μL
TEMED 2μL
双蒸水 12mL混匀加
10％硫酸铵 20μL混匀
（5）吸净面水灌入浓缩胶插入梳子凝固半时
（6）胶凝固拔出梳子加入电泳缓Buffer
（7）沉淀200μL 1×SDS样缓液悬浮煮3分钟12000rpm离心5min取清
（8）序样时标准相分子质量蛋白质样品样序 Marker（5μL）样品（15μL）Marker样品
（9）开始电泳时80V样品全部进入胶增160V
（10）溴酚蓝指示剂电泳分离胶底部时（距底部15cm左右）停止电泳
（11）聚丙烯酰胺电泳凝胶中间位置切成两等份
（12）第份胶考马斯亮蓝染色：先固定液固定半时（省）考马斯亮蓝染色液染色05时然脱色2时
62电泳转移
（1）转移第二份胶切割效部分
（2）量尺寸尺寸切割硝酸纤维素膜（硝酸纤维素膜手接触注意正反面N正面）
（3）转移板序操作步气泡：
① 转移Buffer浸湿海绵片张（接触转移板黑色部分）
② 转移Buffer浸湿普通滤纸两张
③ 放切割胶
④ 胶放硝酸纤维素膜正面贴胶
⑤ 湿滤纸两张
⑥ 湿海绵片张（接触转移板白色部分）
（4）合转移板放入电泳槽注意电极胶负极倒入300mL转移缓液（甲醇现现加）
（5）插入电极120mA恒流电泳15h
（6）转移结束取出硝酸纤维素膜
63 免疫印迹
（1）TBS缓液洗膜10min摇床轻轻摇动
（2）膜封闭溶液封闭摇床轻轻摇动45min
（3）轻轻转移掉封闭溶液TBS溶液洗膜两次悬浮洗膜次第二次10min
（4）1块润湿滤纸放皿中滤纸放块滤纸稍Parafilm膜
GFP蛋白Western blot
（5）取500μL抗溶液（抗原液：封闭液＝1：500）Parafilm膜面均匀点液滴
（6）纤维素膜蛋白面（硝酸纤维素膜正面）铺抗间气泡盖盖保湿室温夜
（7）掉第抗体溶液TTBS洗膜3次次10min置摇床轻轻摇动
（8）抗样操作纤维素膜贴二抗（羊抗兔辣根氧化酶）二抗：抗体稀释液1：500稀释
（9）室温结合15h
（10）TTBS洗2次次10min（更免疫条带洗次两次）
（11）TBS溶液洗膜次
（12）显色（试剂盒）
l 皿准备10mLTBS预热60℃
l 取20μl DAB母液（20×）迅速混合皿中加20μL氧化氢（20×）混匀迅速加入硝酸纤维素膜晃动5min等条带显出加离子水终止反应滤纸保存（刘佳楠李洁）已做
（13）观察条带然相
五实验结果分析
1质粒DNA分离纯化（琼脂糖凝胶电泳）
图 1琼脂糖凝胶电泳蓝盾见光透射仪观察结果（序：1N3 2N3含GFP基质粒 3Marker 428a没酶切 528a酶切）
结果：
28a质粒双酶切电泳条带该带切作质粒载体
N3质粒双酶切电泳两条带跑前端GFP基片段（组条带明显）切目基质粒载体连接成重组质粒
分析：电泳含GFP基条带太明显组双酶切实验成功步需肠杆菌没培养出部分原
2 肠杆菌感受态细胞制备转化
图组做失败实验
图2 左：卡霉素板纯感受态细胞 中：卡霉素板纯感受态细胞 右：卡霉素板转入目基肠杆菌细胞
分析：左边板长满菌落两板菌落原：
1 双酶切实验跑出含GFP基片段电泳条带明显
2 感受态细胞没制备
3 回收条带没回收正确
4 目基载体连接时候没连接
图武连富田彦彪学长出需菌落图
图 3 菌落图
结果：
50μLddH2O+感受态细胞悬液培养基长出菌落
50μLddH2O+感受态细胞悬液培养基长菌落
50μL重组质粒+感受态细胞悬液培养基长出簇菌落
分析：图说明野生肠杆菌含抗生素培养基生长重组质粒成功转化进野生肠杆菌体肠杆菌具抗生素抗性够含抗生素培养基生长
3 重组质粒DNA鉴定（菌落PCR法）
组实验结果 （武连富组）
图 4左：Marker 中右：含目基质粒PCR菌落
结果：N3质粒没跑出条带第组中菌落PCR跑出清晰条带
分析：组做两组菌落PCRPCR菌落跑出明显条带应Marker齐说明菌落中成功转化重组N3质粒直接N3质粒样没跑出条带N3质粒样量少1μL没PCR
4 GFP蛋白诱导表达
图 5 左右离心次诱导0h1h2h3h
结果：诱导0h作荧光亮度较低诱导1h诱导2h诱导3h亮度组荧光亮度更高诱导2h诱导3h间荧光亮度差
分析：诱导2h诱导3h间荧光亮度差GFP基诱导表达出饱状态
5 Westernblotting
51电泳考马斯亮蓝染色
图 6右左：Marker 0h诱导 1h诱导 2h诱导 3h诱导
分析：图片中难清条带分布情况原两染色时间长脱色够充分
52电泳转移显色
图 7显色
结果：法观察
分析：免疫印迹步骤洗膜封闭时候没掉胶
六组讨
组实验整体完成步骤操作失误错误结果进行双酶切时样品应放室温夜保存组离心盖写T4导致学误离心放入冰块中重组质粒反应量偏少进行转化含重组质粒肠杆菌较少实验中会注意清实验报告思考实验步骤原理样做实验时少出错更实验结果
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分子生物学基工程实验报告
绿色荧光蛋白(GFP)基克隆表达
背景知识
绿色荧光蛋白（green fluorescent proteinGFP）类存包括水母水螅珊瑚等腔肠动物体生物发光蛋白受紫外蓝光激发时GFP 发射绿色荧光产生荧光需底物辅子发色团蛋白质级序列固GFP 3 外显子组成长26kbGFP 238 氨基酸组成单体蛋白相分子质量270kMr蛋白性质十分稳定耐受60℃处理1996 年GFP 晶体结构解出蛋白质中央圆柱形水桶样结构长420 nm宽240 nm11 围绕中心α螺旋反行β折叠组成荧光基团形成螺旋开始桶顶部3 短垂直片段覆盖底部短垂直片段覆盖荧光活性重生色团位空腔发色团蛋白质部第6567位SerTyrGly身环化氧化形成
1996 年GFP 晶体结构解出蛋白质中央圆柱形水桶样结构长420 nm宽240 nm11 围绕中心α螺旋反行β折叠组成荧光基团形成螺旋开始桶顶部3 短垂直片段覆盖底部短垂直片段覆盖荧光活性重生色团位空腔
绿色荧光蛋白(GFP)基克隆表达
实验目
学掌握种常质粒DNA提取方法：碱裂解法该法量培养物中抽提质粒DNA较方便省时提取质粒DNA质量较高DNA酶切PCR甚测序学利核酸蛋白测定仪测算核酸浓度纯度掌握种常分离鉴定纯化DNA片段较方便省时技术：琼脂糖凝胶电泳基原理操作方法学限制型切酶进行DNA酶切原理方法解掌握肠杆菌感受态细胞制备方法原理操作点质粒DNA转化肠杆菌细胞原理方法掌握双酶切法鉴定重组质粒DNA基原理操作步骤菌落PCR法鉴定重组质粒DNA基原理解菌落PCR法鉴定菌落保存操作方法掌握IPTG诱导GFP基表达基原理基操作步骤实验训练学生聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质外需掌握蛋白质转移硝酸纤维素膜转移电泳技术运酶法显色蛋白质通实验学生学会检测表达蛋白质分子生物学重技术
二基原理
1质粒DNA分离纯化原理：
质粒类细菌细胞发现独立染色体外够复制稳定遗传单位迄止细菌中分离质粒环型双链DNA分子分子量范围1kb200kb质粒DNA持续稳定处染色体外游离状态定条件会逆整合寄染色体着染色体复制复制通细胞分裂传递代数情况质粒DNA复制中酶体系细菌染色体复制时酶相质粒复制受宿细胞复制作严格限制细胞中含拷贝称严谨型质粒质粒复制受宿细胞控制严称松弛型质粒细胞中数目达
10200拷贝宿细胞蛋白质合成受抑制时（例氯霉素处理）细菌染色体增加松弛型质粒DNA继续复制细胞拷贝数增千千
质粒具定生物功带抗药标记质粒DNA方法转化进细菌时转化细菌会表现出质粒基具新生物表现型例含抗药基质粒转入细菌原抗药性细菌表现出抗药新表型助转化菌获新表型特征证实质粒已转入宿细菌中样作转化菌选择性标记
质粒作基克隆载体分子重条件获批量纯化质粒DNA分子目前已许方法质粒DNA提取包括三基步骤：细菌生长质粒扩增菌体收集裂解质粒DNA分离质粒DNA纯化
（1）细菌生长质粒扩增
琼脂培养基板挑取单菌落接种含适抗生素液体培养基中培养松弛型质粒（pUC系列）说培养物放标准LB2YT培养基中生长数晚期量提取质粒必选择性扩增质粒DNA严谨型质粒（pBR322）说需部分生长细菌培养物中加入氯霉素继续培养干时便质粒进行选择性扩增
（2）菌体收集裂解质粒DNA分离
质粒分离基原理利宿菌（般肠杆菌菌株）DNA质粒DNA间两种性质差异：（1）肠杆菌染色体较般载体质粒DNA（2）细胞中提取肠杆菌DNA体变性线性分子数质粒DNA价闭合环状分子里介绍碱裂解法基原理：细菌悬浮液中加入SDS（十二烷基硫酸钠）NaOH菌体裂解（时需先溶菌酶水解细胞壁）处理破坏碱基配细菌线状染色体DNA变性闭环质粒DNA链处拓扑缠绕状态彼分开条件恢复正常时（加入酸性NaAcKac中碱性NaOH）质粒DNA链迅速准确配重新恢复成天然超螺旋分子通离心染色体DNA变性蛋白质RNA分子起沉淀质粒超螺旋分子滞留清中
（3）质粒DNA提纯
量制备质粒DNA苯酚抽提RNA酶消化酒精沉淀等简单步骤残余蛋白质RNA达纯化目
质粒DNA分子具三种构型：价闭合环形DNA（cccDNASC构型）开环DNA（OC构型）线性分子（L构型）细菌体质粒DNA负超螺旋构型存琼脂糖凝胶电泳中构型种质粒DNA分子量相具电泳迁移率中走前SC DNA次L DNAOC DNA
2琼脂糖凝胶电泳原理：
影响DNA琼脂糖凝胶中迁移速率素：（1）DNA分子 双链DNA分子凝胶基质中迁移速率碱基数常数成反分子越迁移越慢摩擦阻力越分子通凝胶孔径效率低较分子（2）琼脂糖浓度 定线状DNA片段浓度琼脂糖凝胶中迁移速率DNA电泳迁移速率数凝胶浓度间存线性相关（3）DNA构象 超螺旋环状（Ⅰ型）切口环状（Ⅱ型）线状（Ⅲ型）DNA琼脂糖凝胶中速率迁移相迁移速率取决琼脂糖凝胶浓度类型次电流强度缓液离子强度Ⅰ型超螺旋绞紧程度密度条件Ⅰ型DNAⅢ型迁移快条件序相反（4）电压 低电压时DNA片段迁移率电压成正电场强度升高时高分子量片段迁移率遂成例增加电压增时琼脂糖凝胶分离效范围反减获2kb DNA片段良分辨率电压应高58Vcm（5）电泳缓液 DNA泳动受电泳缓液组成离子强度影响缺乏离子电导率降低DNA者动者迁移慢高离子强度时（10×buffer）电导率升高应适中电压会产生量热严重时凝胶会熔化DNA变性
3酶切连接原理：
迄已发现3000种限制性切酶传统限制性切酶亚基组成酶切位置识位点辅助子等素划分三类II型酶识位点中确定位点特异切开DNA链产生确定限制片段三类限制性切酶中唯DNA分析克隆类
II型限制性切酶中普遍象EcoR IHind IIIBamHINot I样识序列中进行切割酶类酶构成商业化酶部分部分类酶二聚体形式结合
DNA识称序列极少酶作单聚体结合DNA识非称序列酶识连续序列（EcoR I识GAATTCHind III识AAGCTTBamHI识G↓GATCC Not I识GC↓GGCCGC）识连续序列（Bgl I识GCCNNNNNGGC）限制性切酶酶切DNA形成两种类型末端：(i)两条链断裂位置交错产生粘性末端EcoR I酶切产生末端(ii)两条链断裂位置处称结构
中心产生末端HaeIII酶切产生DNA连接酶够催化两条DNA链间形成磷酸二酯键种酶需条DNA链3’末端具游离羟基（OH）条DNA链5’末端具磷酸基团（P）
4肠杆菌感受态细胞制备转化原理：
外源DNA转化肠杆菌细胞扩增感受态指细菌细胞具够接受外源DNA种特殊生理状态肠杆菌感受态CaCl2处理诱导产生：正生长肠杆菌细胞0℃加入低渗CaCl2溶液中便会细胞膜透性发生改变时细胞呈现感受态方法批量制备感受态细胞转化效率达5×1062×107转化克隆子μg超螺旋质粒DNA制备肠杆菌感受态细胞70℃冻存
0℃外源DNA吸附感受态细胞表面短时间热刺激（42℃90s）诱导细胞吸收DNA转化质粒DNA肠杆菌培养基中37℃培养1hr质粒DNA中编码抗生素抗性基表达转化质粒DNA肠杆菌细胞含相应抗生素培养基生长没转化细胞法生长
5重组质粒DNA鉴定（双酶切法菌落PCR法）原理：
重组质粒DNA利限制性切酶（BamH INot I）分酶切基片段质粒利基片段质粒DNA端带相粘性末端连接起重组质粒果利相限制性切酶识重组基片段两侧酶切位点通酶切重组片段连接基片段否相判断质粒DNA否重组质粒
单菌落提取质粒DNA通PCR方法鉴定正确克隆聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction简称PCR）体外酶促合成特异DNA片段种方法典型
PCR高温变性低温退火适温延伸等三步反应组成循环周期通次循环反应目DNA迅速扩增步骤：扩增DNA置高温解链工合成两寡核苷酸引物低温分目片段两侧DNA两条链互补结合DNA聚合酶72℃单核苷酸引物3’端开始掺入模板5’→3’方延伸合成DNA新互补链
具体说PCR反应系统寡核苷酸引物反应缓液热稳定DNA聚合酶（Taq酶）脱氧核苷三磷酸底物靶序列（模板）等五部分组成缺
PCR技术试中建立反应数时极微量某特定目DNA片段扩增106倍需烦琐基克隆程序便获足够数量精确DNA拷贝操作简单易掌握结果较基分析研究提供种强力手段整生命科学研究发展深远影响PCR技术产生时间长惊速度广泛应分子生物学领域基分离克隆核苷酸序列分析突变体重组体构建基表达调控研究基态性分析遗传病传染病诊断肿瘤机制探索法医鉴定等诸方面
6GFP蛋白诱导表达原理：
IPTG（异丙基硫代βL半乳糖苷）种常见诱导基表达诱导剂结构类似乳糖GFP基连接pET28a克隆位点（MCS）GFP基表达受游T7启动子操基O位点结合式作元件蛋白子控制LacI基编码调节蛋白四聚体形式结合操基O位点关闭GFP基表达IPTG四聚体调节蛋白结合改变调节蛋白构象调节蛋白O位点结合接着BL21编码T7 RNA聚合酶结合T7启动子位点启动GFP基表达
7Westernblotting原理：
蛋白质印迹（Westernblotting）蛋白质转移固定化学合成膜支撑物利抗原抗体反应原理抗作探针目蛋白作连接带标记二抗抗作显色显色位置目蛋白种高强力形成印迹方法称Westernblotting技术
作抗原物质：天然蛋白重组蛋白偶联肽等抗原通常抗原决定簇组成种抗原决定簇刺激机体
B淋巴细胞接受该抗原产生抗体称单克隆抗体（Monclone antibody）种抗原决定簇刺激机体相应产生种样单克隆抗体单克隆抗体混杂起克隆抗体机体产生抗体克隆抗体克隆抗体识抗原表位制备时间短成低原广泛应研究诊断方面
第抗体非抗体性抗原特异性结合蛋白种类包括单克隆抗体克隆抗体
第二抗体抗体集合抗体抗体作检测抗体存放抗信号二抗利抗体分子蛋白质具抗原性性质免疫异种动物异种动物免疫系统产生免疫球蛋白抗充抗原刺激机体产生抗体二抗带检测标记荧光放射性化学发光显色集团
His标签蛋白质重组技术中常种标签序列六组氨酸特点分子量基改变蛋白质生物结构蛋白质溶解性目蛋白质检测纯化方面极方便His标签抗体检测His标签融合蛋白表达细胞定位定性定量检测His融合表达蛋白等
免疫印迹实验包括5步骤：
（1） 固定：蛋白质进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）胶转移硝酸纤维素膜
（2）封闭（blocked）：保持膜没特殊抗体结合场场处饱状态保护特异性抗体结合膜蛋白质反应
（3）初级抗体（第抗体）特异性
（4）第二抗体配体试剂初级抗体特异性结合作指示物
（5）适保温酶标记蛋白质区带产生见溶解状态颜色反应
三实验材料仪器试剂
1．实验材料
含pEGFP－N3肠杆菌液含pET28a DNA肠杆菌液DH5αBL21pET28a重组质粒DNA正引物：5’ggg CAT ATg gTg AgC AAg ggC gAg g3’反引物：5’ggg CTC gAg TTA CTT gTA CAg CTC g3’第抗体（兔源His标签抗体）第二抗体（羊抗兔Ig克隆抗体）
2．仪器
恒温培养箱超净工作台恒温摇床制冰机台式离心机掌中宝离心机型混合器冰箱
移液枪核酸电泳仪型混合器冰箱蓝盾见光透射仪水浴锅移液器电泳槽电泳仪振荡器蓝盾见光透射仪凝胶成仪高压灭菌锅离心机PCR仪15ml离心蛋白质电泳槽蛋白质电转移槽套（百晶公司）硝酸纤维素滤膜直径20cm10cm培养皿剪刀镊子刀片普通滤纸
3．试剂
BamH I(10UμL) (TaKaRa公司)Not I(10UμL)(TaKaRa公司)T4 ligase1琼脂糖凝胶 LB（LuriaBertain）液体固体培养基
四实验步骤
1质粒DNA分离纯化：
（1）取20ml DH5α培养液倒入20mL 离心中13000rpm离心1min
（2）重复1
（3）弃清倒置卫生纸数分钟液体流
（4）菌体沉淀重悬浮100μL溶液Ⅰ中(需剧烈振荡)室温放置10min
（5）加入新配制溶液Ⅱ200μL（SDSNaOH等量混匀）盖紧口快速温颠倒离心5次混匀容物(千万振荡)冰浴5min
（6）加入150μL预冷溶液Ⅲ盖紧口倒置离心温振荡3次沉淀混匀冰浴中15分钟13000rpm离心10min
（7）吸取400μL清液移入干净离心中加入800μl等体积氯仿异戊醇(24：1)振荡混匀静置10min（重复）
（8）水相300μL移入干净离心中加入800μl等体积氯仿异戊醇(24：1)振荡混匀13000rpm离心2min
（9） 水相移入干净离心中加入2 倍体积水乙醇振荡混匀置室温10min然13000rpm离心10min
（10）弃清
（11）吸清液倒置卫生纸液体流室温干燥
（12）沉淀溶30μL ddH2O中取溶解质粒液18μL进行加入酶切体系剩余12μL 保存20℃冰箱中
（13）样流程方法pET28a质粒提出保存20℃冰箱中
2 酶切连接
双酶切体系（30μL）混合：
反应物
pEGFPN3（μL）
pET28a（μL）
质粒
18
18
BamH I
2
2
Not I
2
2
10×buffer K
3
3
ddH2O
5
5
（1）37℃水浴酶切23h
（2）配制10（MV）普通琼脂糖凝胶30ml
（3）适放置冷60℃左右倒电泳胶板插梳子
（4）凝胶凝固拨梳子
（5）酶切样品中加入5µl样缓液（含GeneFinder）混匀全部样
（6）1×TBE Buffer80V(34Vcm)电泳30min观察结果拍
（7）干净刀片需DNA条带凝胶切称取重量01g凝胶应300μL体积加入PN
（8） 50℃水浴放置10min期间断温翻动离心胶完全融解
（9）步溶液加入吸附柱中吸附柱放入收集静置3min13000rpm离心60s弃掉废液
（10）加入750μL漂洗液PW13000rpm离心60s弃掉废液重复次
（11）取出吸附柱放入干净离心中吸附膜中间位置加入适量洗脱缓液EB 30μL洗脱缓液先室温放置2min13000rpm离心1min然离心溶液重新加回离心吸附柱中13000rpm离心1min
连接体系进行16℃室温连接夜
反应物
体积μL
回收纯化pET28a质粒
5
gfp基片段
12
T4连接酶
1
缓液（10×）
2
3 肠杆菌感受态细胞制备转化
3． 1感受态细胞制备 (CaCl2法)
（1）活化DH5αBL21培养液转入2mL离心中冰放置10min然4℃4000rpm离心5min
（2）弃清预冷01molL CaCl2溶液600μL轻轻悬浮细胞冰放置20min 4℃4000rpm离心5min
（3）弃清加入300μL预冷01molLCaCl2溶液轻轻悬浮细胞冰放置5min成感受态细胞悬液80℃长期保存
32转化涂板
（1）取2菌离心分加入100μL DH5α感受态细胞悬液第1加5μl菌水第2加入质粒DNA溶液5μl轻轻摇匀冰放置30min
（2）42℃水浴中热激90s热激迅速置冰冷5min
（3）分中加入100μL LB液体培养基混匀37℃振荡培养30min
（4）1中取50μL涂布含抗生素含抗生素板2中取50μL涂布含抗生素板正面放置约10分钟菌液完全培养基吸收倒置培养皿37℃培养20时凝胶成系统采集图片
1 1 2
50μL 50μL 50μL
ddH2O ddH2O 重组质粒
4重组质粒DNA鉴定（菌落PCR法）
（1）挑取菌落
机挑取1菌落首先菌枪头挑取菌落已准备含卡抗菌素分区固体培养基中轻划（保菌种）然余菌置离心中（作PCR反应模板）
（2）PCR反应体系（20μl）
反应物
体积
dNTP（10mM）
2
左引物
05
右引物
05
Taq酶（5UμL）
05
MgCl2(25mM)
12
10×Buffer
2
ddH2O
133
（3）PCR循环：
95℃ 5min予变性
（95℃30s58℃30s72℃60s）30cycles
72℃ 10min延伸
（4）PCR产物检测
PCR产物加入5μl溴酚蓝GeneFinder混合液分编号加入DNA琼脂糖凝胶电泳加样孔1琼脂糖电泳分离
（5）荧光激发器结果采集片
5 GFP蛋白诱导表达
（1）取3组培养含重组质粒DNA肠杆菌液2ml2ml离心中加入IPTG3μL分诱导0h1h2h
（2）分取15ml10000rpm离心5min清收集沉淀重复次收集沉淀
（3）观察蛋白表达：紫外线射菌体沉淀培养板绿色荧光分均匀涂布板表达蛋白样品相保存片
6 Westernblotting
61 蛋白质电泳
（1）洗净电泳玻璃板晾干仪器说明装
（2）配12％分离胶8mL分取：
30％丙烯酰胺 32mL
15M pH88TrisHCl 208mL
（分离胶缓液）
10％SDS 8μL
TEMED 10μL
双蒸水 264mL 混匀加
10％硫酸铵 30μL 混匀灌胶
（3）灌分离胶面双蒸水封
（4）分离胶凝固(凝胶时间半时左右)配6％浓缩胶（23ml）：
30％丙烯酰胺 045mL
05M pH68TrisHCl 06mL
（浓缩胶缓液）
10％SDS 225μL
TEMED 2μL
双蒸水 12mL混匀加
10％硫酸铵 20μL混匀
（5）吸净面水灌入浓缩胶插入梳子凝固半时
（6）胶凝固拔出梳子加入电泳缓Buffer
（7）沉淀200μL 1×SDS样缓液悬浮煮3分钟12000rpm离心5min取清
（8）序样时标准相分子质量蛋白质样品样序 Marker（5μL）样品（15μL）Marker样品
（9）开始电泳时80V样品全部进入胶增160V
（10）溴酚蓝指示剂电泳分离胶底部时（距底部15cm左右）停止电泳
（11）聚丙烯酰胺电泳凝胶中间位置切成两等份
（12）第份胶考马斯亮蓝染色：先固定液固定半时（省）考马斯亮蓝染色液染色05时然脱色2时
62电泳转移
（1）转移第二份胶切割效部分
（2）量尺寸尺寸切割硝酸纤维素膜（硝酸纤维素膜手接触注意正反面N正面）
（3）转移板序操作步气泡：
① 转移Buffer浸湿海绵片张（接触转移板黑色部分）
② 转移Buffer浸湿普通滤纸两张
③ 放切割胶
④ 胶放硝酸纤维素膜正面贴胶
⑤ 湿滤纸两张
⑥ 湿海绵片张（接触转移板白色部分）
（4）合转移板放入电泳槽注意电极胶负极倒入300mL转移缓液（甲醇现现加）
（5）插入电极120mA恒流电泳15h
（6）转移结束取出硝酸纤维素膜
63 免疫印迹
（1）TBS缓液洗膜10min摇床轻轻摇动
（2）膜封闭溶液封闭摇床轻轻摇动45min
（3）轻轻转移掉封闭溶液TBS溶液洗膜两次悬浮洗膜次第二次10min
（4）1块润湿滤纸放皿中滤纸放块滤纸稍Parafilm膜
GFP蛋白Western blot
（5）取500μL抗溶液（抗原液：封闭液＝1：500）Parafilm膜面均匀点液滴
（6）纤维素膜蛋白面（硝酸纤维素膜正面）铺抗间气泡盖盖保湿室温夜
（7）掉第抗体溶液TTBS洗膜3次次10min置摇床轻轻摇动
（8）抗样操作纤维素膜贴二抗（羊抗兔辣根氧化酶）二抗：抗体稀释液1：500稀释
（9）室温结合15h
（10）TTBS洗2次次10min（更免疫条带洗次两次）
（11）TBS溶液洗膜次
（12）显色（试剂盒）
l 皿准备10mLTBS预热60℃
l 取20μl DAB母液（20×）迅速混合皿中加20μL氧化氢（20×）混匀迅速加入硝酸纤维素膜晃动5min等条带显出加离子水终止反应滤纸保存（刘佳楠李洁）已做
（13）观察条带然相
五实验结果分析
1质粒DNA分离纯化（琼脂糖凝胶电泳）
图 1琼脂糖凝胶电泳蓝盾见光透射仪观察结果（序：1N3 2N3含GFP基质粒 3Marker 428a没酶切 528a酶切）
结果：
28a质粒双酶切电泳条带该带切作质粒载体
N3质粒双酶切电泳两条带跑前端GFP基片段（组条带明显）切目基质粒载体连接成重组质粒
分析：电泳含GFP基条带太明显组双酶切实验成功步需肠杆菌没培养出部分原
2 肠杆菌感受态细胞制备转化
图组做失败实验
图2 左：卡霉素板纯感受态细胞 中：卡霉素板纯感受态细胞 右：卡霉素板转入目基肠杆菌细胞
分析：左边板长满菌落两板菌落原：
1 双酶切实验跑出含GFP基片段电泳条带明显
2 感受态细胞没制备
3 回收条带没回收正确
4 目基载体连接时候没连接
图武连富田彦彪学长出需菌落图
图 3 菌落图
结果：
50μLddH2O+感受态细胞悬液培养基长出菌落
50μLddH2O+感受态细胞悬液培养基长菌落
50μL重组质粒+感受态细胞悬液培养基长出簇菌落
分析：图说明野生肠杆菌含抗生素培养基生长重组质粒成功转化进野生肠杆菌体肠杆菌具抗生素抗性够含抗生素培养基生长
3 重组质粒DNA鉴定（菌落PCR法）
组实验结果 （武连富组）
图 4左：Marker 中右：含目基质粒PCR菌落
结果：N3质粒没跑出条带第组中菌落PCR跑出清晰条带
分析：组做两组菌落PCRPCR菌落跑出明显条带应Marker齐说明菌落中成功转化重组N3质粒直接N3质粒样没跑出条带N3质粒样量少1μL没PCR
4 GFP蛋白诱导表达
图 5 左右离心次诱导0h1h2h3h
结果：诱导0h作荧光亮度较低诱导1h诱导2h诱导3h亮度组荧光亮度更高诱导2h诱导3h间荧光亮度差
分析：诱导2h诱导3h间荧光亮度差GFP基诱导表达出饱状态
5 Westernblotting
51电泳考马斯亮蓝染色
图 6右左：Marker 0h诱导 1h诱导 2h诱导 3h诱导
分析：图片中难清条带分布情况原两染色时间长脱色够充分
52电泳转移显色
图 7显色
结果：法观察
分析：免疫印迹步骤洗膜封闭时候没掉胶
六组讨
组实验整体完成步骤操作失误错误结果进行双酶切时样品应放室温夜保存组离心盖写T4导致学误离心放入冰块中重组质粒反应量偏少进行转化含重组质粒肠杆菌较少实验中会注意清实验报告思考实验步骤原理样做实验时少出错更实验结果
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