细胞分子生物学课程文
学 院 生命科学学院
专 业 植物学
学 号 201***6002
姓 名 常*
2014 年 1 月 10日
细胞死亡方式检测方法
摘：细胞受严重损伤累胞核时呈现代谢停止结构破坏功丧失等逆性变化细胞死亡细胞死亡包括坏死凋亡两类型传统细胞死亡方式分类包括细胞坏死细胞凋亡2种者称程序性细胞死亡死亡原切损伤子作达定强度持续定时间受损组织代谢完全停止会引起细胞组织死亡期发现细胞死亡途径够细胞死亡更透彻解检测方法入手反学死亡途径方法文总结常检测方法
关键词：细胞死亡凋亡坏死检测方法DNA片段
Abstract：The traditional way of cell death classification includes cell necrosis and apoptosis the latter also is known as programmed cell death recently we have discovered a lot of cell death pathways in order to be have a more thorough understanding we can start with detection method so that have a good understanding of means of death this article summarizes the most commonly used detection methods and will get a great help for our learning
Key words cell death Apoptosis Necrosis Detection methods DNA fragments
长期 细胞死亡方式分2种 坏死凋亡 者称程序性细胞死亡( programmed cell death PCD)年着研究深入细胞死亡机制途径进行更深入解 许科学家发展越越检测方法利种检测方法解选择文目前常实新发展检测细胞死亡方式方法进行总结种检测方法检测原理判定标准优缺点进行描述
1细胞死亡方式
11坏死
111坏死机制
坏死般认病理性原造成种规细胞死亡方式通常受严重急性损伤(急性缺氧突然营养供足等)严重物理化学伤害(热清洗剂强碱辐射等) 会引起细胞坏死细胞ATP 含量降低高浓度ROS(氧化物)BCL2量表达引起BCL家族蛋白表达失衡 caspases 活性抑制会造成细胞坏死途径[5]
112坏死细胞形态学特征
细胞坏死表现细胞肿胀细胞膜快速崩解细胞器崩溃细胞膜崩解细胞容物溢出导致细胞周围炎症反应[6]细胞核坏死程中变化：1）核浓缩(Pyknosis)：核体积变染色质浓缩深染2）核碎裂(Karyorhexis)：核染色质凝集崩解呈碎粒状聚体核膜处着核膜破裂 染色质颗粒直接分散胞浆中细胞膜破坏核碎粒分布细胞外3）核溶解(Karyolys is )[7]
12凋亡
121凋亡机制
细胞凋亡细胞种基生物学现象细胞生物需异常细胞中起着必作生物体进化环境稳定系统发育中起着重作细胞凋亡仅种特殊细胞死亡类型具重生物学意义复杂分子生物学机制
细胞凋亡指维持环境稳定基控制细胞序死亡凋亡称程序性死亡( Programmed cell death PCD) [1]凋亡发生正常细胞外凋亡诱发病理性原引起环境刺激引起例D N A损伤氧化压力激素病毒毒素药物营养良等然凋亡病理性原引起正常细胞死亡网[2]形成凋亡体附细胞吞噬 避免体炎症产生[3]
凋亡基严格控制程基种属间非常保守Bcl2家族caspase家族癌基Cmyc抑癌基P53等着分子生物学技术发展种细胞凋亡程相认识迄止凋亡程确切机制尚完全清楚凋亡程紊乱许疾病发生直接间接关系肿瘤身免疫性疾病等够诱发细胞凋亡素射线药物等
细胞凋亡两种途径：种外源性(细胞死亡子受体介导细胞凋亡)种源性(线粒体途径)然两种途径终必须种caspases家族成员介导蛋白酶级联反应程作底物导致凋亡[4]报道组织缺氧酸毒症作心肌细胞时细胞凋亡激活caspases
122凋亡细胞形态特征
凋亡细胞皱缩细胞间连接消失时细胞间密度增加核质浓缩成包团染色质迁移核模周边形成新月形凝集进细胞核裂解碎块进细胞膜陷行分割成细胞膜包裹表面光滑凋亡体( Apoptotic bod
y)DNA 特异性核酸切酶分解成18 0 ~ 220bp片断琼脂糖电泳出现特征性DNA梯状区带细胞凋亡早期需量ATP
13凋亡坏死区
更加彻底明白两种死亡方式两种特征做较表
表：细胞凋亡细胞坏死区
特征
细胞凋亡
细胞坏死
诱发素
特定生理性
种病理性
细胞数量
单细胞丢失
成群细胞死亡
质膜
完整保持
肿胀溶解破裂
细胞核
固缩破裂片段
溶解破裂
染色质
凝集呈半月状
模糊疏松
线粒体
肿胀通透性增加细胞C释放
肿胀破裂
细胞器
完整
损伤
含物释放
炎症反应
核DNA
降解完整倍数片段
机规断裂
凝胶电泳
梯状条带形
分散形态
2 细胞死亡检测方式
细胞死亡方式根形态学细胞膜通透性染色体变化情况结合种染色标记方法确定常观察方法光镜电镜聚焦荧光显微镜观察细胞细胞核形态细胞膜细胞超微结构改变目前数学者接受形态学标准加鉴
21线粒体跨膜电位检测法
线粒体膜电位线粒体膜两侧质子称分布形成电化学梯度 细胞凋亡程中常膜孔道改变转膜电位降低调节细胞凋亡凋亡早期线粒体形态学方面尚明显变化时膜电位已发生耗散 膜电位耗散认细胞凋亡级联反应程中早发生事件旦线粒体膜电位耗散凋亡逆转该方法时始终保持衡染液pH值致性线粒体跨膜电位存亲脂性阳离子荧光染料JC1等结合线粒体基质荧光增强减弱说明线粒体膜电负性增高降低注意凋亡中出现线粒体极化外胀亡中发生现象[8]
22 DNA片段检测
细胞发生凋亡坏死时DNA发生断裂胞质出现DNA片段探测DNA 片段琼脂糖凝胶电泳酶联免疫吸附法TUNEL法检测方法ISEL( insitu end labeling)ISOL( Insituo ligo Ligation)
221TUNEL法
TUNEL方法通检测DNA 双链断裂暴露出粘性3cOH 末端确定凋亡典方法脱氧核糖核苷酸末端转移酶作DNA3c末端荧光素辣根氧化物酶碱性磷酸酶生物素标记脱氧核糖核苷酸结合进行凋亡细胞检测TUNEL实际分子生物学形态学相结合研究方法完整单凋亡细胞核凋亡体进行原位染色准确反应细胞凋亡典型生物化学形态特征石蜡包埋组织切片冰冻组织切片培养细胞组织中分离出细胞检测出极少量凋亡细胞细胞凋亡研究中广泛采光学显微镜聚焦显微镜观察TUNEL检测结果阳性着色凋亡细胞[11]TUNEL法标记凋亡晚期阶段细胞阶段细胞形态已明显紊乱然TUNEL 方法识发生凋亡细胞时凋亡坏死重叠凋亡性细胞未染色情况会低估凋亡信息甲醛固定妨碍TUNEL染色标记细胞周围正常细胞性较差组织切片难确定准确结果TUNEL染色凋亡说特异胀亡中见[12]
222琼脂糖凝胶电泳酶联免疫吸附法
凋亡细胞DNA断裂点均规律发生核体间出现180~200 bp DNA片段胀亡坏死细胞DNA 断裂点特征弥漫性机片段利特征琼脂糖凝胶电泳确定细胞死亡方式凋亡细胞电泳出现阶梯状(DNA Ladder) 条带胀亡坏死细胞电泳呈机性电泳条带[9]观察DNA常方法利荧光染料EB进行染色凝胶应该EB情况电泳 电泳结束EB染色注意坏死中发生蛋白水解途径导致DNA分裂核体间片段酶激活出现DNA 阶梯状条带凋亡程中见情况区[10]
凋亡细胞DNA 断裂细胞质出现核体核体组蛋白DNA片段组成酶联免疫吸附法检测
23组化染料
根染料细胞组分结合分细胞核染料细胞膜染料细胞质染料死亡细胞活细胞染料亲性电镜观察分辨出细胞存活情况
231细胞核染料
常细胞核染料HoechstPIDAPIAO(acrid ine orange)EB等方法
2311 Hoechst种需透化作穿透细胞膜DNA 染色蓝色荧光染料[16]DNA 特异结合非细胞毒性活性染料优先双螺旋沟外面三腺嘌呤胸腺嘧啶碱基结合[17]染活力细胞染发生凋亡细胞常细胞凋亡检测染色荧光显微镜(紫外光明)观察流式细胞仪检测细胞发生凋亡时会凋亡细胞细胞核呈致密浓染呈碎块状致密浓染凋亡细胞凝缩染色质着色正常细胞染色质更亮
2312
PI种核酸荧光染料作死亡正死亡细胞种标志物染料穿透活细胞质膜穿受损细胞膜进入细胞[18]凋亡晚期细胞死细胞PI够透细胞膜细胞核红染PI染阳性细胞核凝聚断裂细胞认坏死性[19]
2313 DAPI( 4c6d iam id ino2pheny lindo le) DAPI种标记细胞核蓝色荧光染料够DNA中部分AT碱基相互结合DAPI透完整细胞膜活细胞固定细胞染色DAPI染色常细胞凋亡检测染色荧光显微镜观察流式细胞仪检测荧光显微镜观察时利紫外光激发显示染色体浓缩核分成裂片断裂
2314 AO种膜通透性活体染料区正常凋亡细胞核活细胞中AO 作种PH 指示剂酸性层包围时会发出鲜亮黄橘红色光正常凋亡性细胞核染色正常PH 时 AO双链核酸染绿色凋亡程中细胞核酸化PH 值降低凋亡细胞核染黄橘红色AO已作识凋亡细胞染色方法种简单方法灵活附加方法识研究凋亡性细胞次AOEB染色聚焦显微镜观察EB穿透活细胞质膜穿受损细胞膜进入细胞[18]选择性标记细胞膜受损细胞AO具细胞渗透性活死亡细胞均标记两种染色方法结果：活细胞核AO染色呈绿色凋亡细胞核AO染色呈黄橘红色坏死细胞核进步EB染色呈红色显示绿色红色光谱区存
232细胞膜染料(Annex inV)
正常细胞 PS 位质膜叶凋亡早期PS质膜叶易位外叶(发生核断裂前)Annex inV识Annex inV种Ca2+ 赖性磷脂结合蛋白PS高度亲AnnexinV进行荧光素生物素标记作荧光探针利流式细胞仪荧光显微镜检测细胞凋亡发生Annex inV结合细胞膜识正凋亡细胞Annex inV凋亡细胞相结合种活体模型中定量凋亡细胞数目Annex inV 标记阳性时程赖测系统敏感性[20]Annex inV法优点细胞需固定避免PI法中固定造成细胞碎片TUNEL法中固定造成DNA 片段丢失仅省时结果更然方法适合阐明关凋亡动力学方面问题
233细胞质染料
2331CalceinAM
CalceinAM 种非荧光膜通透性脂酶底物者动装载进细胞分子乙酰氧甲基酯部分水解时释放Calce in者透膜 包围膜完整细胞胞质Calcein蓝光( 497 nm ) 激发发出绿色荧光( 517 nm )Calcein绿色荧光提示细胞完整膜脂酶活性
成追踪活细胞工具[21]
2332TB( trypan blue)
TB检测细胞膜完整性果细胞膜完整破裂TB 染料进入细胞细胞变蓝坏死果细胞膜完整细胞TB蓝染色正常细胞凋亡细胞
2333H & E( hem atoxy lin & eosin)尼氏银染方法
尼氏H& E染色方法简单通形态学变化染色强度变化推断细胞变性显示变性细胞变化细胞皱缩空泡形成染色深银染方法选择性变性细胞染成黑色正常细胞染度高容易区分变性正常细胞
24流式细胞仪分析( flow cytometry assayFCA)
目前基础研究中凋亡定量分析流式细胞术细胞凋亡FCA 定量分析单参数双参数参数分析检测断裂点T UNEL 法等种方法FCA 单参数分析荧光探针PI吖啶橙等特异性染料标记细胞DNARNA蛋白质等 通观察细胞某种单成分含量变化 区分凋亡细胞应两种荧光染料标记细胞成分称双参数分析吖啶橙溴化乙锭染色淋巴细胞双参数FCA 法DNA RNA RNA 单链DNARNA 蛋白质等成分组合进行测定外 应谱线激光光源激发两种种荧光探针标记细胞成分进行参数分析定量检测
25 caspases检测
caspases四聚体蛋白酶构成表达caspases前体暴露凋亡刺激物时caspases裂解激活反导致游效应器caspases裂解激活 者启动导致凋亡程具形态学改变中caspase3诱导细胞死亡程中关键素[13]caspase3激活提示PCD进程中注定逆出现细胞死亡[14]caspase3激活种代表凋亡标志caspase3激活作凋亡标志优势死亡程早期阶段探测凋亡细胞[15]caspase3激活早期事件出现活力细胞发生细胞形态核结构发生改变前caspases检测免疫组化方法Western Blot分析方法
综述 种凋亡检测方法具特点均定局限性凋亡检测中应避免单方法 需结合灵敏性特异性较高种检测手段 检测细胞凋亡发生程中事件 更加准确客观全面反映实验结果时进步研究细胞死亡机制帮助
参考文献：
[1] Behl C Apoptosis and Alzheimer s disease (review) Journal of Nrural Transmisson 2000107325
[2] Brauchi S Cea C Faruas JG et al Apoptosis induced by prolonged exposure to odorants in cultured cells from rat of lactory epithelium [J] Brain Res 2006 1103(1) 114122
[3] Buja LMM yocardial ischemia and reperfusion injury [J] Cardiovasc Pathol 200514(4)170175
[4] Denecker G Vercammen D Declercq W et al Apoptotic and necrotic cell death induced be death domainreceptors Cellular and Molecular Life Sciences 201158356
[5] Denecker G Vercamen D Declercq W et al Apoptotic and nerotic cell death induced by death domainreceptors Cellular and Molecular Life Sciences 200158356
[6] Dong Z Saikumar P Weinberg M et al Intemucleosomal DNA cleavage triggered by plasma membrane damage during necrotic cell death Involvement of serine but cysteine proteases[J] Am J Pathol 1997 151(5) 12051213
[7] Fickert P Trauner M Fuchsbuchler A et al Oncosis represents the main type of cell death in mousem odels of cholestasis [J] JH epatol 2005 42(3)378385
[8] Golbs A Heck N Luhmann HJ A new technique for realtime analysis of caspase3 dependent neuronal cell death [J] Neurosci Methods 2007 161(2)234243
[9] Ishikawa Y Satoh T Enokido Y et al Generation of reactive oxygen species release of Lglutamate and activation of caspases are required for oxygeninduced apoptosis of embryonic hippocam palneurons in culture [J] Brain Res 1999 824(1) 7180
[10] Jaesche H Lemasters JJ Apoptosis versus on cotic necrosis in hepatic is chemiareperfusion injury [J] Gastroenterology 2003125(4) 12461257
[11] Jan PTuckermann Anna Kleimanet alMolecular mechanisms of glucocorticoids in the control of inflammation and lymphocyte apoptosisCritical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 2011 42(1)71
[12] Lakhani SA Masud A Kuida K et al Caspase 3 and 7key mediators of mitochondrial events of apoptosis [J] Science 2006 311(5762)847851
[13] Martin SGreen DProtease activation during apoptosis death by a thousand cuts Cell 199582 349
[14] Monette R Small DL Mealing G et al A fluorescence confocalassay to assess neuronal viability in brain slices [J] Brain Res Protoc 1998 2(2)99108
[15] Mironova EV Evstratova AA Antonov SM A fluorescence vital assay for the recognition and quantification of excitotoxic cell death by necrosis and apoptosis using confocal microscopy on neurons in culture [J] Neurosci Methods 2007 163(1)18
[16] Reichstein D Ren L Filippopou Los T et al Apoptotic retinal ganglion cell death in the DBA2 mouse model of glaucoma [J] Exp Eye Res 20010 84(1)1321
[17] Shimizu K Matsubara K Ohtakik et al Paraquat leads to dopaminergic neural vulnerability in organotypic midbrain culture [J] Neurosci Res 2003 46(4) 523532
[18] Tenn CC Wang Y VXinduced cell death involves activation of caspase3 in cultured rat cortical neurons [J] Neurosci Lett 2011 417(2)155159
[19] Williams GT Smith CAMolecular regulation of apoptoisi genetic controls on cell death Cell74777
[20] 牛万成 李玺 细胞死亡方式理研究进展[J] **医学院学报200626(5)467470
[21] 潘耀谦 细胞凋亡细胞坏死较研究进展 动物医学进展 200021(4)5
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细胞分子生物学课程文
学 院 生命科学学院
专 业 植物学
学 号 201***6002
姓 名 常*
2014 年 1 月 10日
细胞死亡方式检测方法
摘：细胞受严重损伤累胞核时呈现代谢停止结构破坏功丧失等逆性变化细胞死亡细胞死亡包括坏死凋亡两类型传统细胞死亡方式分类包括细胞坏死细胞凋亡2种者称程序性细胞死亡死亡原切损伤子作达定强度持续定时间受损组织代谢完全停止会引起细胞组织死亡期发现细胞死亡途径够细胞死亡更透彻解检测方法入手反学死亡途径方法文总结常检测方法
关键词：细胞死亡凋亡坏死检测方法DNA片段
Abstract：The traditional way of cell death classification includes cell necrosis and apoptosis the latter also is known as programmed cell death recently we have discovered a lot of cell death pathways in order to be have a more thorough understanding we can start with detection method so that have a good understanding of means of death this article summarizes the most commonly used detection methods and will get a great help for our learning
Key words cell death Apoptosis Necrosis Detection methods DNA fragments
长期 细胞死亡方式分2种 坏死凋亡 者称程序性细胞死亡( programmed cell death PCD)年着研究深入细胞死亡机制途径进行更深入解 许科学家发展越越检测方法利种检测方法解选择文目前常实新发展检测细胞死亡方式方法进行总结种检测方法检测原理判定标准优缺点进行描述
1细胞死亡方式
11坏死
111坏死机制
坏死般认病理性原造成种规细胞死亡方式通常受严重急性损伤(急性缺氧突然营养供足等)严重物理化学伤害(热清洗剂强碱辐射等) 会引起细胞坏死细胞ATP 含量降低高浓度ROS(氧化物)BCL2量表达引起BCL家族蛋白表达失衡 caspases 活性抑制会造成细胞坏死途径[5]
112坏死细胞形态学特征
细胞坏死表现细胞肿胀细胞膜快速崩解细胞器崩溃细胞膜崩解细胞容物溢出导致细胞周围炎症反应[6]细胞核坏死程中变化：1）核浓缩(Pyknosis)：核体积变染色质浓缩深染2）核碎裂(Karyorhexis)：核染色质凝集崩解呈碎粒状聚体核膜处着核膜破裂 染色质颗粒直接分散胞浆中细胞膜破坏核碎粒分布细胞外3）核溶解(Karyolys is )[7]
12凋亡
121凋亡机制
细胞凋亡细胞种基生物学现象细胞生物需异常细胞中起着必作生物体进化环境稳定系统发育中起着重作细胞凋亡仅种特殊细胞死亡类型具重生物学意义复杂分子生物学机制
细胞凋亡指维持环境稳定基控制细胞序死亡凋亡称程序性死亡( Programmed cell death PCD) [1]凋亡发生正常细胞外凋亡诱发病理性原引起环境刺激引起例D N A损伤氧化压力激素病毒毒素药物营养良等然凋亡病理性原引起正常细胞死亡网[2]形成凋亡体附细胞吞噬 避免体炎症产生[3]
凋亡基严格控制程基种属间非常保守Bcl2家族caspase家族癌基Cmyc抑癌基P53等着分子生物学技术发展种细胞凋亡程相认识迄止凋亡程确切机制尚完全清楚凋亡程紊乱许疾病发生直接间接关系肿瘤身免疫性疾病等够诱发细胞凋亡素射线药物等
细胞凋亡两种途径：种外源性(细胞死亡子受体介导细胞凋亡)种源性(线粒体途径)然两种途径终必须种caspases家族成员介导蛋白酶级联反应程作底物导致凋亡[4]报道组织缺氧酸毒症作心肌细胞时细胞凋亡激活caspases
122凋亡细胞形态特征
凋亡细胞皱缩细胞间连接消失时细胞间密度增加核质浓缩成包团染色质迁移核模周边形成新月形凝集进细胞核裂解碎块进细胞膜陷行分割成细胞膜包裹表面光滑凋亡体( Apoptotic bod
y)DNA 特异性核酸切酶分解成18 0 ~ 220bp片断琼脂糖电泳出现特征性DNA梯状区带细胞凋亡早期需量ATP
13凋亡坏死区
更加彻底明白两种死亡方式两种特征做较表
表：细胞凋亡细胞坏死区
特征
细胞凋亡
细胞坏死
诱发素
特定生理性
种病理性
细胞数量
单细胞丢失
成群细胞死亡
质膜
完整保持
肿胀溶解破裂
细胞核
固缩破裂片段
溶解破裂
染色质
凝集呈半月状
模糊疏松
线粒体
肿胀通透性增加细胞C释放
肿胀破裂
细胞器
完整
损伤
含物释放
炎症反应
核DNA
降解完整倍数片段
机规断裂
凝胶电泳
梯状条带形
分散形态
2 细胞死亡检测方式
细胞死亡方式根形态学细胞膜通透性染色体变化情况结合种染色标记方法确定常观察方法光镜电镜聚焦荧光显微镜观察细胞细胞核形态细胞膜细胞超微结构改变目前数学者接受形态学标准加鉴
21线粒体跨膜电位检测法
线粒体膜电位线粒体膜两侧质子称分布形成电化学梯度 细胞凋亡程中常膜孔道改变转膜电位降低调节细胞凋亡凋亡早期线粒体形态学方面尚明显变化时膜电位已发生耗散 膜电位耗散认细胞凋亡级联反应程中早发生事件旦线粒体膜电位耗散凋亡逆转该方法时始终保持衡染液pH值致性线粒体跨膜电位存亲脂性阳离子荧光染料JC1等结合线粒体基质荧光增强减弱说明线粒体膜电负性增高降低注意凋亡中出现线粒体极化外胀亡中发生现象[8]
22 DNA片段检测
细胞发生凋亡坏死时DNA发生断裂胞质出现DNA片段探测DNA 片段琼脂糖凝胶电泳酶联免疫吸附法TUNEL法检测方法ISEL( insitu end labeling)ISOL( Insituo ligo Ligation)
221TUNEL法
TUNEL方法通检测DNA 双链断裂暴露出粘性3cOH 末端确定凋亡典方法脱氧核糖核苷酸末端转移酶作DNA3c末端荧光素辣根氧化物酶碱性磷酸酶生物素标记脱氧核糖核苷酸结合进行凋亡细胞检测TUNEL实际分子生物学形态学相结合研究方法完整单凋亡细胞核凋亡体进行原位染色准确反应细胞凋亡典型生物化学形态特征石蜡包埋组织切片冰冻组织切片培养细胞组织中分离出细胞检测出极少量凋亡细胞细胞凋亡研究中广泛采光学显微镜聚焦显微镜观察TUNEL检测结果阳性着色凋亡细胞[11]TUNEL法标记凋亡晚期阶段细胞阶段细胞形态已明显紊乱然TUNEL 方法识发生凋亡细胞时凋亡坏死重叠凋亡性细胞未染色情况会低估凋亡信息甲醛固定妨碍TUNEL染色标记细胞周围正常细胞性较差组织切片难确定准确结果TUNEL染色凋亡说特异胀亡中见[12]
222琼脂糖凝胶电泳酶联免疫吸附法
凋亡细胞DNA断裂点均规律发生核体间出现180~200 bp DNA片段胀亡坏死细胞DNA 断裂点特征弥漫性机片段利特征琼脂糖凝胶电泳确定细胞死亡方式凋亡细胞电泳出现阶梯状(DNA Ladder) 条带胀亡坏死细胞电泳呈机性电泳条带[9]观察DNA常方法利荧光染料EB进行染色凝胶应该EB情况电泳 电泳结束EB染色注意坏死中发生蛋白水解途径导致DNA分裂核体间片段酶激活出现DNA 阶梯状条带凋亡程中见情况区[10]
凋亡细胞DNA 断裂细胞质出现核体核体组蛋白DNA片段组成酶联免疫吸附法检测
23组化染料
根染料细胞组分结合分细胞核染料细胞膜染料细胞质染料死亡细胞活细胞染料亲性电镜观察分辨出细胞存活情况
231细胞核染料
常细胞核染料HoechstPIDAPIAO(acrid ine orange)EB等方法
2311 Hoechst种需透化作穿透细胞膜DNA 染色蓝色荧光染料[16]DNA 特异结合非细胞毒性活性染料优先双螺旋沟外面三腺嘌呤胸腺嘧啶碱基结合[17]染活力细胞染发生凋亡细胞常细胞凋亡检测染色荧光显微镜(紫外光明)观察流式细胞仪检测细胞发生凋亡时会凋亡细胞细胞核呈致密浓染呈碎块状致密浓染凋亡细胞凝缩染色质着色正常细胞染色质更亮
2312
PI种核酸荧光染料作死亡正死亡细胞种标志物染料穿透活细胞质膜穿受损细胞膜进入细胞[18]凋亡晚期细胞死细胞PI够透细胞膜细胞核红染PI染阳性细胞核凝聚断裂细胞认坏死性[19]
2313 DAPI( 4c6d iam id ino2pheny lindo le) DAPI种标记细胞核蓝色荧光染料够DNA中部分AT碱基相互结合DAPI透完整细胞膜活细胞固定细胞染色DAPI染色常细胞凋亡检测染色荧光显微镜观察流式细胞仪检测荧光显微镜观察时利紫外光激发显示染色体浓缩核分成裂片断裂
2314 AO种膜通透性活体染料区正常凋亡细胞核活细胞中AO 作种PH 指示剂酸性层包围时会发出鲜亮黄橘红色光正常凋亡性细胞核染色正常PH 时 AO双链核酸染绿色凋亡程中细胞核酸化PH 值降低凋亡细胞核染黄橘红色AO已作识凋亡细胞染色方法种简单方法灵活附加方法识研究凋亡性细胞次AOEB染色聚焦显微镜观察EB穿透活细胞质膜穿受损细胞膜进入细胞[18]选择性标记细胞膜受损细胞AO具细胞渗透性活死亡细胞均标记两种染色方法结果：活细胞核AO染色呈绿色凋亡细胞核AO染色呈黄橘红色坏死细胞核进步EB染色呈红色显示绿色红色光谱区存
232细胞膜染料(Annex inV)
正常细胞 PS 位质膜叶凋亡早期PS质膜叶易位外叶(发生核断裂前)Annex inV识Annex inV种Ca2+ 赖性磷脂结合蛋白PS高度亲AnnexinV进行荧光素生物素标记作荧光探针利流式细胞仪荧光显微镜检测细胞凋亡发生Annex inV结合细胞膜识正凋亡细胞Annex inV凋亡细胞相结合种活体模型中定量凋亡细胞数目Annex inV 标记阳性时程赖测系统敏感性[20]Annex inV法优点细胞需固定避免PI法中固定造成细胞碎片TUNEL法中固定造成DNA 片段丢失仅省时结果更然方法适合阐明关凋亡动力学方面问题
233细胞质染料
2331CalceinAM
CalceinAM 种非荧光膜通透性脂酶底物者动装载进细胞分子乙酰氧甲基酯部分水解时释放Calce in者透膜 包围膜完整细胞胞质Calcein蓝光( 497 nm ) 激发发出绿色荧光( 517 nm )Calcein绿色荧光提示细胞完整膜脂酶活性
成追踪活细胞工具[21]
2332TB( trypan blue)
TB检测细胞膜完整性果细胞膜完整破裂TB 染料进入细胞细胞变蓝坏死果细胞膜完整细胞TB蓝染色正常细胞凋亡细胞
2333H & E( hem atoxy lin & eosin)尼氏银染方法
尼氏H& E染色方法简单通形态学变化染色强度变化推断细胞变性显示变性细胞变化细胞皱缩空泡形成染色深银染方法选择性变性细胞染成黑色正常细胞染度高容易区分变性正常细胞
24流式细胞仪分析( flow cytometry assayFCA)
目前基础研究中凋亡定量分析流式细胞术细胞凋亡FCA 定量分析单参数双参数参数分析检测断裂点T UNEL 法等种方法FCA 单参数分析荧光探针PI吖啶橙等特异性染料标记细胞DNARNA蛋白质等 通观察细胞某种单成分含量变化 区分凋亡细胞应两种荧光染料标记细胞成分称双参数分析吖啶橙溴化乙锭染色淋巴细胞双参数FCA 法DNA RNA RNA 单链DNARNA 蛋白质等成分组合进行测定外 应谱线激光光源激发两种种荧光探针标记细胞成分进行参数分析定量检测
25 caspases检测
caspases四聚体蛋白酶构成表达caspases前体暴露凋亡刺激物时caspases裂解激活反导致游效应器caspases裂解激活 者启动导致凋亡程具形态学改变中caspase3诱导细胞死亡程中关键素[13]caspase3激活提示PCD进程中注定逆出现细胞死亡[14]caspase3激活种代表凋亡标志caspase3激活作凋亡标志优势死亡程早期阶段探测凋亡细胞[15]caspase3激活早期事件出现活力细胞发生细胞形态核结构发生改变前caspases检测免疫组化方法Western Blot分析方法
综述 种凋亡检测方法具特点均定局限性凋亡检测中应避免单方法 需结合灵敏性特异性较高种检测手段 检测细胞凋亡发生程中事件 更加准确客观全面反映实验结果时进步研究细胞死亡机制帮助
参考文献：
[1] Behl C Apoptosis and Alzheimer s disease (review) Journal of Nrural Transmisson 2000107325
[2] Brauchi S Cea C Faruas JG et al Apoptosis induced by prolonged exposure to odorants in cultured cells from rat of lactory epithelium [J] Brain Res 2006 1103(1) 114122
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