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准备材料实验方法
11载体菌株
（1）载体：pMD18T载体购TaKaRa公司pcDNA31+载体购Invitrogen公司中pcDNA31+载体结构图示
（2）肠杆菌菌株（克隆）：DH5α购 TransGen 公司
（3）细胞系：采羊膜皮细胞（WISH 细胞）源试验室冻存细胞
12 PCR新增产物检测回收
5μL标准分子量DNA Marker DL2000作参考首先需取15琼脂糖凝胶检验测试PCR扩增产生物质次5 μL生成物质全部加入凝胶孔需凝胶孔物质进行电泳需电流200mA电压200V结束应凝胶孔成结果进行观察进行拍摄记录次实验需室常温进行该实验方法种浓度回收中琼脂糖凝胶60bp20kbDNA片段定实
琼脂糖凝胶回收：参考Omerga胶回收试剂盒说明书
13构建表达载体酶切回收
131pMD18T载体连接转化
回收PCR产物连入pMD18T载体根说明书进行操作
132质粒提取
连接pMD18T中质粒量提取参考Omega公司质粒提试剂盒
133重组表达质粒构建
载体pMD18TpcDNA31+进行双酶切中关键该载体需含质粒
134提取毒素表达质粒重组
参考Omega公司Endofree Plasmid Mini Kit II(D695001)说明书进行毒素提取重组
14细胞培养
（1）首先需细胞进行复苏
（2）细胞进行培养培养程需常规操作进行培养
（3）培养细胞冻存
15细胞转染
次实验细胞培养需细胞进行转染
转染操作参考：Life Technologies 公司LipofectamineTM 3000Invitrogen公司RNAiMAX
16提取细胞总RNA
提取细胞RNA程需参考 Omega RNA 提取说明书
17实时荧光定量分析
提取RNA需测定浓度进行电泳检测目检测质量否合格合格状态应提取RNA仅两条带分28S18S18S亮度应28S亮度半进行反转录操作（参考：Thermo Scientific反转录试剂盒）
18 Western Blot实验步骤
（1）首先提取蛋白
（2）SDSPAGE试剂进行电泳
（3）进行转模
（4）观察抗原抗体发生免疫反应
19ELISA
17βEstradiol EIA kit试剂盒收集细胞清进行ELISA分析
110免疫组化程
1101石蜡切片免疫组化实验步骤
（1）石蜡切片脱蜡水
（2）进行抗原修复
（3）切断源性氧化物酶
（4）血清BSA处封闭
（5）加入抗
（6）加入二抗
（7）DAB显色
（8）细胞核复染
（9）封片进行脱水处理
（10）显微镜进行镜检图数收集分析
111 活体实验实施方案
（1）首先试验分5组包括：PFTμ 组LPS 组PFTμLPS 组DMSO组PBS组
注意：DMSOPB分属PFTμLPS溶剂实验中需采两组
（2）雄性鼠雌性鼠放入笼子第二天带阴道栓雌鼠妊娠天数记录0机分组组放入6
雌鼠妊娠15天时分进行DMSOPFTμLPS PBS注射妊娠 15 天时PFTμLPS组首先注射 PFTμ约1 h注射 LPS两次量分：DMSO 100 μL PFTμ 1 mg浓度 10 mgmL PFTμ 注射 100 μL LPS 50 μg浓度05 mgmL LPS 注射 100 μL PBS 100 μL
雌鼠腹腔注射试剂6h第胎鼠分娩时需收集组胎膜
112统计学分析
实验通建立试验组组进行探究SPSS160SAS进行单素方差进行分析时带显著性检验产生结果均已均值±标准误表示中差异显著*表示p＜005差异极显著**表示p＜001
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11载体菌株
（1）载体：pMD18T载体购TaKaRa公司pcDNA31+载体购Invitrogen公司中pcDNA31+载体结构图示
（2）肠杆菌菌株（克隆）：DH5α购 TransGen 公司
（3）细胞系：采羊膜皮细胞（WISH 细胞）源试验室冻存细胞
12 PCR新增产物检测回收
5μL标准分子量DNA Marker DL2000作参考首先需取15琼脂糖凝胶检验测试PCR扩增产生物质次5 μL生成物质全部加入凝胶孔需凝胶孔物质进行电泳需电流200mA电压200V结束应凝胶孔成结果进行观察进行拍摄记录次实验需室常温进行该实验方法种浓度回收中琼脂糖凝胶60bp20kbDNA片段定实
琼脂糖凝胶回收：参考Omerga胶回收试剂盒说明书
13构建表达载体酶切回收
131pMD18T载体连接转化
回收PCR产物连入pMD18T载体根说明书进行操作
132质粒提取
连接pMD18T中质粒量提取参考Omega公司质粒提试剂盒
133重组表达质粒构建
载体pMD18TpcDNA31+进行双酶切中关键该载体需含质粒
134提取毒素表达质粒重组
参考Omega公司Endofree Plasmid Mini Kit II(D695001)说明书进行毒素提取重组
14细胞培养
（1）首先需细胞进行复苏
（2）细胞进行培养培养程需常规操作进行培养
（3）培养细胞冻存
15细胞转染
次实验细胞培养需细胞进行转染
转染操作参考：Life Technologies 公司LipofectamineTM 3000Invitrogen公司RNAiMAX
16提取细胞总RNA
提取细胞RNA程需参考 Omega RNA 提取说明书
17实时荧光定量分析
提取RNA需测定浓度进行电泳检测目检测质量否合格合格状态应提取RNA仅两条带分28S18S18S亮度应28S亮度半进行反转录操作（参考：Thermo Scientific反转录试剂盒）
18 Western Blot实验步骤
（1）首先提取蛋白
（2）SDSPAGE试剂进行电泳
（3）进行转模
（4）观察抗原抗体发生免疫反应
19ELISA
17βEstradiol EIA kit试剂盒收集细胞清进行ELISA分析
110免疫组化程
1101石蜡切片免疫组化实验步骤
（1）石蜡切片脱蜡水
（2）进行抗原修复
（3）切断源性氧化物酶
（4）血清BSA处封闭
（5）加入抗
（6）加入二抗
（7）DAB显色
（8）细胞核复染
（9）封片进行脱水处理
（10）显微镜进行镜检图数收集分析
111 活体实验实施方案
（1）首先试验分5组包括：PFTμ 组LPS 组PFTμLPS 组DMSO组PBS组
注意：DMSOPB分属PFTμLPS溶剂实验中需采两组
（2）雄性鼠雌性鼠放入笼子第二天带阴道栓雌鼠妊娠天数记录0机分组组放入6
雌鼠妊娠15天时分进行DMSOPFTμLPS PBS注射妊娠 15 天时PFTμLPS组首先注射 PFTμ约1 h注射 LPS两次量分：DMSO 100 μL PFTμ 1 mg浓度 10 mgmL PFTμ 注射 100 μL LPS 50 μg浓度05 mgmL LPS 注射 100 μL PBS 100 μL
雌鼠腹腔注射试剂6h第胎鼠分娩时需收集组胎膜
112统计学分析
实验通建立试验组组进行探究SPSS160SAS进行单素方差进行分析时带显著性检验产生结果均已均值±标准误表示中差异显著*表示p＜005差异极显著**表示p＜001
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