阴茎海绵体滑肌细胞分离：
1 次取SD鼠断颈椎处死
2 菌条件快速切开包皮分离阴茎海绵体阴茎海绵体脚然横行切取阴茎海绵体迅速移入含300u／ml青霉素300ug／ml链霉素PBS缓液中浸泡中阴茎软骨尿道背侧血组织
3 仔细剥阴茎海绵体外周纤维脂肪层海绵体组织剪成约0．5×1×lmm3块含100u／ml青霉素100ug／ml链霉素PBS液中漂沈2次
酶法：
1 放预先盛含0．1％I型胶原酶2ml37℃ CO2孵箱静置40分钟
2 块组织完全消化溶解1000r／min离心5分钟
3 弃清液细胞沉淀中加入新鲜配制20％优等胎牛血清高糖DMEM培养基3ml吹均匀转移培养瓶中培养记录观察细胞形态生长情况
传代培养：
1 细胞培养80％融合时倒培养瓶培养液含025％胰蛋白酶细胞壁缓缓加入细胞培养孔轻轻转动培养瓶细胞组织块培养瓶壁脱落
2 37℃消化lmin显微镜观察细胞质回缩变圆细胞间隙增细胞重叠起成块脱落时加含I0％FBSDMEM细胞培养液5ml终止酶消化
3 吸吸取液体反复轻轻吹瓶壁细胞脱离瓶壁形成细胞悬液1000 r／min离心5分钟弃溶液2×104／ml密度加入足量I0％FBSDMEM细胞培养液
4 吸取少量细胞悬液相差显微镜检查细胞形态分细胞悬液加入25cm2细胞培养瓶继续置入37℃5％C0295％空气细胞培养箱中培养
5 23天换1次培养液旦细胞成团次传代固定
细胞纯化：
1．差异贴壁法阴茎海绵体组织中含少量成纤维细胞传代时消化吹形成细胞悬液静置20min部分细胞贴壁
2．转移培养液培养瓶中次静置贴壁重复述步骤2次
3．原代培养中成纤维细胞根成纤维细胞贴壁速度快特点进行次贴壁转瓶方法
冻存复苏 ：
1 选择生长良阴茎海绵体滑肌细胞胰蛋白酶消化离心浓缩细胞
2 加DMEM液(含30％FBSIO％DMSO冷冻剂)次4℃20℃70℃温度冷冻置液氮中冻存
3 根实验需液氮中取出冻存立置40℃水浴中快速融化然液体吸出补加DMEM液(含20％FBS)吹细胞制成悬液移入培养瓶中37℃培养箱中静置培养
附：
1．组织块法分离滑肌细胞
1 组织块0．5cm间隔放置涂20％胎牛血清25ml菌培养瓶固定
2 然翻转培养瓶组织块面加入2ml已配制DMEM培养液(含20％胎牛血清100u／ml青毒素100ug／ml链霉素)注意勿培养液组织块接触拧紧瓶塞组织块面放入
3 心置入37℃5％C0295％空气细胞培养箱静置5时轻轻翻转培养瓶培养液组织块接触勿晃动
4 3天置倒置显微镜观察记录观察细胞形态生长情况组织块清继续培养细胞传代时清组织块
二改良组织块法
组织块法培养3天置倒置显微镜观察发现少许细胞种植物里游出细胞爬出第二天时组织块补加培养液记录观察细胞形态生长情况
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1 次取SD鼠断颈椎处死
2 菌条件快速切开包皮分离阴茎海绵体阴茎海绵体脚然横行切取阴茎海绵体迅速移入含300u／ml青霉素300ug／ml链霉素PBS缓液中浸泡中阴茎软骨尿道背侧血组织
3 仔细剥阴茎海绵体外周纤维脂肪层海绵体组织剪成约0．5×1×lmm3块含100u／ml青霉素100ug／ml链霉素PBS液中漂沈2次
酶法：
1 放预先盛含0．1％I型胶原酶2ml37℃ CO2孵箱静置40分钟
2 块组织完全消化溶解1000r／min离心5分钟
3 弃清液细胞沉淀中加入新鲜配制20％优等胎牛血清高糖DMEM培养基3ml吹均匀转移培养瓶中培养记录观察细胞形态生长情况
传代培养：
1 细胞培养80％融合时倒培养瓶培养液含025％胰蛋白酶细胞壁缓缓加入细胞培养孔轻轻转动培养瓶细胞组织块培养瓶壁脱落
2 37℃消化lmin显微镜观察细胞质回缩变圆细胞间隙增细胞重叠起成块脱落时加含I0％FBSDMEM细胞培养液5ml终止酶消化
3 吸吸取液体反复轻轻吹瓶壁细胞脱离瓶壁形成细胞悬液1000 r／min离心5分钟弃溶液2×104／ml密度加入足量I0％FBSDMEM细胞培养液
4 吸取少量细胞悬液相差显微镜检查细胞形态分细胞悬液加入25cm2细胞培养瓶继续置入37℃5％C0295％空气细胞培养箱中培养
5 23天换1次培养液旦细胞成团次传代固定
细胞纯化：
1．差异贴壁法阴茎海绵体组织中含少量成纤维细胞传代时消化吹形成细胞悬液静置20min部分细胞贴壁
2．转移培养液培养瓶中次静置贴壁重复述步骤2次
3．原代培养中成纤维细胞根成纤维细胞贴壁速度快特点进行次贴壁转瓶方法
冻存复苏 ：
1 选择生长良阴茎海绵体滑肌细胞胰蛋白酶消化离心浓缩细胞
2 加DMEM液(含30％FBSIO％DMSO冷冻剂)次4℃20℃70℃温度冷冻置液氮中冻存
3 根实验需液氮中取出冻存立置40℃水浴中快速融化然液体吸出补加DMEM液(含20％FBS)吹细胞制成悬液移入培养瓶中37℃培养箱中静置培养
附：
1．组织块法分离滑肌细胞
1 组织块0．5cm间隔放置涂20％胎牛血清25ml菌培养瓶固定
2 然翻转培养瓶组织块面加入2ml已配制DMEM培养液(含20％胎牛血清100u／ml青毒素100ug／ml链霉素)注意勿培养液组织块接触拧紧瓶塞组织块面放入
3 心置入37℃5％C0295％空气细胞培养箱静置5时轻轻翻转培养瓶培养液组织块接触勿晃动
4 3天置倒置显微镜观察记录观察细胞形态生长情况组织块清继续培养细胞传代时清组织块
二改良组织块法
组织块法培养3天置倒置显微镜观察发现少许细胞种植物里游出细胞爬出第二天时组织块补加培养液记录观察细胞形态生长情况
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