重组粒细胞刺激子原液车间设计
重组粒细胞刺激子原液车间设计
摘
重组粒细胞刺激子（recombinant human granulocyte stimulating factorrhGCSF）具刺激中性粒细胞系增殖分化成熟激活血液中成熟中性粒细胞功目前床应抗肿瘤放疗化疗期间出现良反应先天天中性粒细胞减少症文重组粒细胞刺激子原液生产工艺流程容进行研究选取合适生产工艺根生产求确定相适应设备终根物料衡算确定设备参数进行设备选型结合GMP制药行业标准车间进行设计绘制车间面布置图
关键词：重组粒细胞刺激子物料衡算设备选型车间设计
Workshop design of recombinant human granulocyte stimulating factor stock solution
Abstract
Recombinant human granulocyte stimulating factor has the function of stimulating the proliferation differentiation and maturation of neutrophils and activating the mature neutrophils in blood At present it is mainly used in antitumor radiotherapy and chemotherapy as well as congenital and acquired neutropenia In this paper the production process and content of recombinant human granulocyte stimulating factor stock solution were studied the appropriate production process was selected the corresponding equipment was determined according to the production requirements and finally the equipment parameters were determined according to the material balance for equipment selection and the production workshop was designed in combination with GMP and pharmaceutical industry standards and the workshop layout was drawn
Keywords：recombinant human granulocyte stimulating factor material balance calculation equipment Selection workshop design
目录
1前言 1
11粒细胞刺激子作机制 1
12重组粒细胞刺激子应 1
121肿瘤放化疗中性粒细胞减少 1
122动员外周造血干细胞 1
123辅助AIDS治疗 2
13国外研究现状发展趋势 2
14重组肠杆菌高密度发酵 3
141培养基 3
142 pH值 3
143温度 4
144溶氧 4
145诱导方法 4
146补料方法 5
15层析技术 5
151离子交换层析 5
152疏水层析 5
153分子筛层析 5
16设计目意义 6
2工艺路线 7
21重组粒细胞刺激子原液生产工艺 7
22重组粒细胞刺激子生产流程简述 7
221种子扩培养工程菌发酵 7
222重组粒细胞刺激子原液提纯 8
223原液保存 9
23结 10
3工艺计算 12
31基础数 12
32生产程中物料衡算 12
321培养基物料衡算 12
322层析填料量计算 14
323缓液物料衡算 15
33蒸汽量 18
34生产水量 20
341培养基缓液配制水量 20
342发酵时水量 20
343注射水冷时水量 23
35工艺耗冷量 24
36菌空气 24
4设备选型 26
41种子培养间 26
42发酵间 27
43收获间 28
44粗制间 29
45精制间 30
46灭菌间 32
47结 33
5车间设计 35
51车间布置 35
52车间压差分布 37
6总结 38
参考文献 39
致谢 41
附录 42
1前言
11 粒细胞刺激子作机制
粒细胞刺激子（GCSF）种肽糖蛋白分子20kDaGCSF中性粒细胞系作机制表现：粒系祖细胞特异结合时促进粒系祖细胞增殖分化成熟中性粒细胞结合时增强中性粒细胞趋化性吞噬杀伤力中性粒细胞进行调节驱中性粒细胞血液释放作髓系造血细胞时促进增值分化成熟[1]正常情况体GCSF会维持稳定水应激情况仅激活巨噬细胞单核吞噬细胞产物作皮细胞产生GCSF成纤维细胞淋巴细胞白细胞介素Ⅰ(InterleukinⅠ ILⅠ)刺激会产生量GCSF中性粒细胞迅速骨髓等储存池中补充增强机体抗感染力[2]
重组粒细胞刺激子（rhGCSF）通基工程技术肠杆菌表达系统重组表达制备成分子19kDa糖基化蛋白质研究表明NSF60生物测定中糖基化糖基化GCSF具相生物学活性[3]重组粒细胞刺激子源性GCSF具等生物学活性
12 重组粒细胞刺激子应
121肿瘤放化疗中性粒细胞减少
放化疗程中药物通常通破坏DNA抑制细胞周期达抗肿瘤目会骨髓细胞造成影响通常情况化疗效果药物剂量成正相关药物剂量越骨髓抑制越严重导致中性粒细胞减少免疫力降感染发症概率提升感染种癌症死亡原外白细胞数目减少源性制热子肿瘤坏死子生成导致患者体温升高发生中性粒细胞缺乏发热（Febrile Neutropenia FN）FN患者感染发症概率远远高普通患者[4]
rhGCSF起预防中性粒细胞减少症发生[5]减轻中性粒细胞减少程度[6]缩短粒细胞缺乏症持续时间加速粒细胞恢复减少合感染发热危险性外rhGCSF先天性中性粒细胞缺乏患者作
122动员外周造血干细胞
干细胞移植医学应广泛治疗种疾病血液系统疾病神性疾病代谢性疾病身免疫病缺血性疾病中研究表明GCSF增加外周血中造血干细胞祖细胞数量骨髓细胞动员特异性[79]rhGCSF作动员剂床已广泛应取效果[10]
中性粒细胞减少动员造血干细胞rhGCSF外目前床新应例治疗急性脑梗死[11]肝脏干细胞移植[12] [13]
123辅助AIDS治疗
HIV感染特异性免疫系统中T细胞导致免疫功紊乱非特异性免疫系统细胞巨噬细胞树突细胞等受感染艾滋病病程中中性粒细胞单核细胞淋巴细胞数量功均发生病理改变外艾滋病患者免疫信号系统特细胞子介导系统出现重缺陷终会引起免疫系统崩溃GCSF免疫介质网络中关键细胞子国家中已证实治疗HIV感染者中性粒细胞减少症[14]中性粒细胞减少艾滋病晚期常见通常逆转录病毒感染药物治疗系统感染身免疫机制直接引起艾滋病患者中性粒细胞凋亡功损伤会进步加剧潜免疫缺陷增加继发性某感染风险反促炎细胞子水增加病毒血症病毒复制恶性循环关床中GCSF联合抗生素抗真菌治疗种单独治疗结果更HIV感染者中性粒功缺陷通体外注射GCSF改善纠正
13 国外研究现状发展趋势
1985年科学家成功精制提纯出GCSF1986年成功克隆出GCSF基1990年克隆出GCSF受体基重组粒细胞刺激子发展坚实基础
1991年．Amgen公司filgrastim（商品名：NeupogenGran）通FAD批准成功市Neupogen全球首通基重组技术生产肠杆菌表达（发生糖基化）rhGCSF国首市rhGCSF日麒麟鲲鹏（中国）公司开发CHO细胞中表达（发生糖基化）Lenograstim（商品名：NeutoginGrancyte）两款均短效GCSF药物止国国生产短效GCSF企业20家
2002年Amgen公司推出长效型GCSFNeulasta（培非格司亭）全球首PEG化长效rhGCSF短效GCSF相PEG修饰GCSF药物半衰期延长药频率化疗天12次药514天变成化疗周期注射次方便患者减轻患者痛苦效果明显优短效药目前国百克生物津优力®齐鲁制药新瑞白®恒瑞艾®
值注意键隆创新药F627第三代重组粒细胞刺激子药物F627重组粒细胞集落刺激子双分子（rhGCSFFc融合蛋白）长效型GCSF相更强效根公司公告该药品澳利亚完成Ⅰ期床试验中现实良安全性药代动力学特点国际中心Ⅱ期床试验显示该药治疗效果Neulasta相似半衰期Neulasta略长国III期床已取阶段性进展床结果符合预期成国第四市长效GCSF
Amgen公司1991年推出短效GCSF市20年里销售额稳定10亿美元年长效化代药生物类似药 Granix Zarxio 市击市场份额减少2017 年销售额 386 亿美元Amgen公司推出首长效GCSF市市场份额占路增2015年达4715亿美元峰值2017年市场占达892目前全球GCSF药物市场规模超50亿美元长效GCSF药物已成市场流占约70
国市场格局整GCSF市场销售额约40亿元着2017年医保目录调整聚乙二醇重组粒细胞刺激子进入国家医保乙类目录2019年医保局发布2019年国家医保药品目录调整工作方案国长效GCSF进入快速发展期短效GCSF导局面会破
14 重组肠杆菌高密度发酵
141培养基
培养基微生物提供生长繁殖需营养物质微量元素工配置养料般培养基包含碳源氮源机盐水根微生物会适添加微量元素维生素培养基会添加抗生素激素者血清规模发酵生产中重组肠杆菌发酵普遍半合成培养基LB培养基M9培养基
肠杆菌高密度发酵中常碳源葡萄糖外糖类油脂机酸低碳醇葡萄糖效应葡萄糖作碳源弊端会导致乙酸等代谢副产物产生[15]生产时需控制葡萄糖浓度
培养基添加碳源分机碳源机碳源机碳源相机碳源丰富机盐生长子机碳源时微生物会机氮源生长旺盛菌体浓度增长速度机氮源快工业常机氮源：黄豆粉酵母粉玉米浆酒糟等值注意酸水解酪蛋白含氮量高达80含量游离氨基酸微量元素应培养基中缩短发酵周期加快菌体繁殖增强蛋白质表达提高发酵中产出率
微生物生长代谢需机盐参机盐生理功[16]氯化钠调节渗透压镁离子酶激活剂磷酸参细胞代谢参细胞膜蛋白质核酸组成铁离子参电子传递种酶活性基团组成部分钾离子某酶辅子维持渗透压锌离子代生长子刺激细胞生长
142pH值
种微生物pH值会形成产物pH值会着菌体代谢活动产生规律变化例培养基中碳源菌体代谢产物酸性物质溶解氧足消泡剂添加量等会导致pH值降氮源菌体代谢产物碱性物质菌体发生溶时pH升
肠杆菌代谢副产物乙酸般说发酵液中乙酸浓度510gL时观测乙酸菌体生长速率产物抑制乙酸浓度1020gL时菌体停止生长生产实践中发酵液乙酸浓度高12gL时会抑制外源蛋白表达[17]规模工业生产中需减少乙酸产生常采方法控制生长速率移乙酸 控制葡萄糖浓度碱中pH规模发酵中常方法碱中法方法操作简单成低设备求低
143温度
肠杆菌适宜发酵温度37℃温度肠杆菌增长速率会增温度高菌体代谢加快副产物产生速率会加快导致代谢产物积累菌体生长繁殖产生抑制利目蛋白获取菌体生长快时重组质粒复制次数会增加变异率会达利质粒稳定温度低菌体营养物质获取会减慢新陈代谢减慢减少目蛋白合成工业生产中保证产量需获足量菌体进行目蛋白诱导
144溶氧
重组肠杆菌氧发酵条件合成目蛋白规模发酵中通搅拌方式菌体供菌空气维持菌体生长代谢肠杆菌代谢氧呼吸关数生长期中DO明显降时通DO降情况判断菌体生长情况菌体DO出现溶氧反弹降判断菌体开始利第二种基质二次生长中非常常见菌体发生溶DO会升实际生产中DO越高越利DO高时会形成超氧化物离子O22氧化物离子O2O22会H+结合生成H2O2O2会H2O2反应产生OH破坏细胞组分[18]工业通调节通气量搅拌速率间接调节菌体发酵周期代谢产物合成目前常调节溶氧方法改变通气速率改变搅拌速率改变发酵罐罐压改变发酵液理化性质等
145诱导方法
目前重组粒细胞刺激子生产中常诱导方法高温诱导法IPTG乳糖诱导剂法[19]高温诱导法根启动子较低温度（37℃）时抑制较高温度（42℃）时开放特点通升高环境温度目蛋白表达进行诱导高温菌体代谢速率加快会引起代谢副产物乙酸积累抑制目蛋白表达IPTG诱导剂启动子阻遏蛋白结合阻遏蛋白启动子解离启动转录IPTG种稳定诱导剂会细菌代谢外乳糖代IPTG作诱导剂细胞β半乳糖甘酶乳糖转化成异乳糖异乳糖具诱导作乳糖转化较复杂IPTG相乳糖诱导效率低IPTG外乳糖种肠杆菌利碳源乳糖会菌体代谢产生影响
146补料方法
防止高糖条件产生葡萄糖效应影响目蛋白合成工业通常会合理控制流加营养物肠杆菌高密度发酵中常补料方法分批补料法流加方式分反馈补料非反馈补料反馈补料通检测发酵液pH溶氧菌体浓度二氧化碳释放率等参数调节补料速度非反馈补料法恒速补料变速补料指数补料等技术恒速补料流加速度恒定菌体生长速率时间增长降变速补料高密度发酵促进细胞增长利产物表达指数流加减少代谢产物乙酸生成
15 层析技术
151离子交换层析
离子交换层析时利蛋白质表面带电荷蛋白质逆结合离子交换剂pH值离子强度缓液洗脱结合离子交换剂蛋白质缓液中离子发生交换脱离离子交换剂洗脱溶液中物质离子交换剂结合力洗脱序样达分离目离子交换层析般肽分离蛋白质分离核苷酸核苷种碱基分离
重组粒细胞子（pI5866）缓液（pH4）中带正电应选阳离子交换剂
152疏水层析
盐水体系中蛋白质分子疏水基团层析介质疏水配基间结合作力强弱疏水层析利两者差达分离目蛋白质变性高盐环境蛋白质水化层破坏疏水残基暴露表面样品变性高盐处理进行疏水层析离子强度高低洗脱液疏水作弱强组分分开蛋白质样品旧保留生物学活性疏水层析操作成低产物活性工业生产中广泛应般蛋白质初步分离盐析蛋白质进步提纯
153分子筛层析
分子筛层析凝胶滤层析排阻层析蛋白质分子形状进入特定孔径凝胶颗粒力分子量蛋白进入凝胶部首先洗脱分子越凝胶部滞留时间越长越晚洗脱完成分离般应分离纯化脱盐相分子量测定
16 设计目意义
2018年全球癌症年报统计数显示2018年全球预计1810万癌症新发病例亚洲占50全球死亡病例高达960万亚洲占60例2018年国癌症新发病例3804万例死亡病例2296万癌症发病率死亡率断升情况前中国癌症发病数死亡数均位居全球第[20]
第五届全国艾滋病学术会传出数2018年第2季度中国新发现艾滋病病毒感染者艾滋病40104例中性传播占931 艾滋病基数逐年增加年国年报告新发现HIV感染者AIDS病均超10万例年年2018年6月30日全国报告现存活艾滋病感染者超82万[21]
数表明国重组粒细胞刺激子注射液需求逐年升纳入医保范畴着技术发展研究深入重组粒细胞刺激子更方面应通分子修饰等手段逐渐改变原缺点重组粒细胞刺激子原液车间设计必国着成熟重组粒细胞刺激子原液生产工艺研发创新属产品增加重组粒细胞刺激子注射液产量提高产品质量等国医疗市场重意义
2工艺路线
21重组粒细胞刺激子原液生产工艺
目前市场重组粒细胞刺激子通液体培养基中规模发酵培养表达GCSF肠杆菌[22]含重组粒细胞刺激子溶性包涵体变性复性处理恢复生物学活性重组粒细胞刺激子原液[23]生产程分：种子扩培养工程菌发酵重组粒细胞刺激子原液提纯两阶段
22重组粒细胞刺激子生产流程简述
221种子扩培养工程菌发酵
2211级种子液获取
冻存种子液解冻（100μL）接种含160mlLB培养基250ml摇瓶中37℃±1℃pH68±02转速200rmin摇瓶进行级种子培养8时LB培养基配方：蛋白胨5gL酵母粉10gL氯化钠5gL
2212二级种子液获取
培养基进行实罐灭菌开启发酵罐搅拌装置采取然冷培养基冷50℃时开始通入菌压缩空气继续搅拌确保发酵开始时定氧含量
1接种量级种子液接种含16LLB培养基20L种子罐中37℃±1℃pH68±02转速500rmin通气13vvm种子罐进行二级种子培养8时种子液配方：蛋白胨5 gL酵母粉10 gL氯化钠5 gL
2213工程菌发酵
培养基进行实罐灭菌开启发酵罐搅拌装置采取然冷培养基冷50℃时开始通入菌压缩空气继续搅拌确保发酵开始时培养基定氧含量
二级种子液10接种量接种含104L培养基200L发酵罐中进行分批流加补料发酵发酵需空气空气滤器菌压缩机发酵温度37℃±1℃DO5060pH70±02转速700rmin通气13vvm发酵程中氨水调节pH值加入消泡剂消泡时取样测OD600进入数生长期隔1时分批流加补料液次10L流加40LOD60025时加入7mmolL IPTG诱导表达种子放进入发酵罐发酵时间约24h
发酵液配方：蛋白胨5 gL酵母粉10 gL氯化钠5 gL酸水解酪蛋白5 gL氯化铵1 gL磷酸二氢钾5 gLNa2HPO4·12H2O 18 gL硫酸镁05 gL氯化钙05 gL微量元素母液1mlL
微量元素母液：ZnCl2·4H2O 2 gLCoCl2·6H2O 6 gLFeSO4·16H2O 4 gLH2BO3 5 gLMnCl2·4H2O 16 gL
补料配方：蛋白胨25 gL酵母粉50 gL葡萄糖25 gL氯化钠5 gL
222重组粒细胞刺激子原液提纯
工艺中10mmolL TrisHCl pH值855mmolL NaAcHAc pH值40层析操作中缓液量：衡预洗脱洗脱＝223倍柱体积
2221包涵体收集洗涤
发酵液离心（10000rmin 15min）收集沉淀菌体TrisHCl＝110（gml）例10mM TrisHCl溶液重悬沉淀充分搅匀次离心收集沉淀完成菌体洗涤相例加入10mM TrisHCl菌悬液进行破碎匀浆离心（10000rmin 15min）收集沉淀该沉淀粗包涵体
粗包涵体包涵体缓液＝115（gmL）例成分5mM EDTA 4M脲10mM TrisHCl缓液充分搅匀离心（10000rmin 15min）收集沉淀沉淀TrisHCl＝115（gmL）例沉淀中加入10mM TrisHCl溶液充分搅匀离心（10000rmin 15min）收集沉淀沉淀洗涤包涵体
2222包涵体变性复性
包涵体重悬（菌体：缓液115（gmL））10mM TrisHCl5M脲5mM EDTA缓液中边搅拌边加入10mM β疏基乙醇密封充分搅拌2时离心（13000rmin 15min）收集清液清：TrisHCl＝16(VV)例边搅拌边加入10mM TrisHCl缓液完成清稀释稀释清需045μm滤器进行滤
10mM TrisHCl缓液滤稀释清进行恒体积超滤跨膜压力50psig2倍体积稀释3倍体积浓缩工艺求3时完成操作离心（10000rmin 15min）收集清液
2223离子交换层析
超滤离心收集清液5mM NaAcHAc等倍稀释制成离子交换层析样液045μm滤器滤填料CM Sepharose FF5mM NaAcHAc缓液衡层析柱样5mM NaAcHAc02M NaCl缓液洗脱收集洗脱峰
2224疏水层析
5mM NaAcHAc稀释蛋白溶液加入10mM TrisHCl1M (NH4)2SO4(NH4)2SO4终浓度03M作疏水层析样液045μm滤器滤填料Pheny1 sepharose High performance05M NaOH处理10mM TrisHCl溶液洗层析柱流出液电导洗液致10mM TrisHCl03 M (NH4)2SO4 溶液衡层析柱样10mM TrisHCl03 M (NH4)2SO4 溶液衡层析柱20mM TrisHCl 02M (NH4)2SO4 预洗脱10mM TrisHCl001 M (NH4)2SO4 溶液洗脱收集洗脱峰
2225超滤脱盐
疏水层析蛋白溶液进行045μm滤操作5mM NaAcHAc作缓液蛋白溶液进行3倍体积透析超滤脱盐电导率≤1500μscm脱盐完成需2时完成工艺操作
2226离子交换层析Ⅱ
5mM NaAcHAc缓液稀释脱盐完成蛋白溶液045μm滤填料CM Sepharose FF5mM NaAcHAc缓液衡层析柱样5mM NaAcHAc05M NaCl缓液洗脱收集洗脱峰
2227分子筛层析
离子交换层析蛋白溶液进行045μm滤操作填料Sephacryl S1005mM NaAcHAc缓液衡层析柱样5mM NaAcHAc缓液洗脱收集洗脱峰
223原液保存
分子筛层析蛋白溶液022μm滤器滤菌重组粒细胞刺激子原液（pH40）加入聚山梨酯80（避免容颗粒产生）甘露醇（等渗剂）配制次进行022μ滤器滤菌重组粒细胞刺激子保存原液
23结
图重组粒细胞刺激子原液工艺流程图
（接图）
（接图）
图21 重组粒细胞刺激子原液工艺流程图
3工艺计算
31基础数
生产天数：210天
生产周期：3天
种子液发酵时间：8时
种子液放进入发酵罐发酵时间：24时
倒罐率：1
发酵罐装液系数：80
发酵罐通气：13vvm
二级种子液接种量：1
发酵液接种量：10
蛋白表达量：20mgL
发酵菌体重量：20gL
包涵体产率：30
第次离子交换层析收率：49
疏水层析收率：573
第二次离子交换层析收率：637
分子筛层析收率：679
二级种子液接种量：1
发酵液接种量：10
32生产程中物料衡算
3天批量计算生产批重组粒细胞刺激子需物料量年生产批数：210÷3＝70(批)
321培养基物料衡算
选容量200L发酵罐1装料系数08：
1发酵液量：
V＝200×08＝160 L
批产量：
m＝160×20×（1－1）＝3168 mg
2二级种子液量：
V＝160×10＝16 L
3级种子液量：
V＝16 L×1＝160 mL
补料取40 L实际生产中需配制发酵培养基量：
V＝160－16－016－40＝10384 L
实际生产中溶液配制需富余现发酵液105L种子液18L补料液43L配制量计算需成分
4蛋白胨：
m＝10×18＋5×105＋25×43＝1780g
5酵母粉：
m＝10×18＋10×105＋50×43＝3380g
6葡萄糖：
m＝5×105＋25×43＝1600g
7氯化钠：
m＝5×18＋5×105＋25×43＝1690g
8酸水解酪蛋白：
m＝5×105＋25×43＝1600g
9 Na2HPO4·12H2O：
m＝18×105＝1890g
10磷酸二氢钾：
m＝5×105＝525g
11氯化铵：
m＝1×105＝105g
12硫酸镁：
m＝05×105＝525g
13氯化钙：
m＝05×105＝525g
14 ZnCl2·4H2O：
m＝2×105÷1000＝021g
15 CoCl2·6H2O：
m＝6×105÷1000＝063g
16 FeSO4·16H2O：
m＝4×105÷1000＝042g
17H2BO3：
m＝5×105÷1000＝0525g
18MnCl2·4H2O：
m＝16×105÷1000＝0168g
19TPTG：
m＝160×0007×2383＝2669 g
20消泡剂：
V＝1×40＝40 mL
表31发酵车间物料衡算
物料名称
g批
kg年
蛋白胨
1780
1246
酵母粉
3380
2366
葡萄糖
1600
122
氯化钠
1690
1183
酸水解酪蛋白
1600
112
Na2HPO4·12H2O
1890
1323
磷酸二氢钾
525
3675
氯化铵
105
735
硫酸镁
525
3675
氯化钙
525
3675
ZnCl2·4H2O
021
00147
CoCl2·6H2O
063
00441
FeSO4·16H2O
042
00294
H2BO3
0525
00368
MnCl2·4H2O
0168
00118
TPTG
2669
18683
消泡剂
40
2800
322层析填料量计算
根生产数中重组粒细胞刺激子终产量20mgL知批发酵液重组粒细胞刺激子160 L×20 mg＝3200 mg
进行分子筛层析前蛋白含量：3200÷679＝4712 mg
进行离子交换层析前蛋白含量：4712÷637＝7397 mg
进行疏水层析前蛋白含量：7397÷573＝12909 mg
进行第次离子交换层析前蛋白含量：12909÷49＝26344mg
28第次离子交换层析填料CM Sepharose FF（动态载量105mgml）量：
V＝26344 mg÷105 mgmL÷50＝717mL取750mL
29疏水层析填料Phenyl sepharose High performance（动态载量45mgml）量：
V＝12909 mg÷45 mgmL÷40＝502mL取550mL
30第二次离子交换层析填料CM Sepharose FF（动态载量105mgml）量：
V＝7397 mg÷105 mgmL÷50＝141mL取170mL
31分子筛层析填料Sephacryl S100（样量占柱体积4）量：
V＝V样量÷4＝510mL÷4＝12750mL取15700mL
生产中保证填料载量满足生产需求生产14批产品换次填料年需5份填料
表3 3层析填料量
填料名称
mL批
La
CM Sepharose FF
920
46
Phenyl sepharose High performance
550
275
Sephacryl S100
15700
785
323缓液物料衡算
工艺中10mmolL TrisHCl pH值855mmolL NaAcHAc pH值40
发酵液中离心收集菌体量：
m＝160 L×20 gL＝3200 g
菌体洗涤（菌体10mmolL TrisHCl＝110）：
V＝10×3200＝32000 mL
菌体重悬（菌体10mmolL TrisHCl＝110）：
V＝10×3200＝32000 mL
破菌操作中菌体破碎率95离心收集沉淀重量：
m＝3200×95＝3040 g
粗包涵体获（包涵体缓液＝115（gmL））缓液配方：10mmolL TrisHCl5mmolL EDTA4molL脲：
V＝15×3040＝45600 mL取46000 mL
包涵体产率30收集包涵体重量：
m＝3040×30＝912 g
包涵体洗涤（包涵体10mmolL TrisHCl＝115（gmL））：
V＝15×912＝13680 mL
包涵体重悬变性（包涵体缓液＝115）缓液配方：10mmolL TrisHCl5molL脲5mmolL EDTA10mmolL β疏基乙醇：
V＝15×912＝13680 mL取14000 mL
清液稀释（清液10mmolL TrisHCl＝16）：
V＝6×13680＝82080 mL
超滤复性先进行2倍透析进行3倍浓缩（稀释液10mmolL TrisHCl＝12）：
V＝2×82080＝164160 mL
恒体积超滤终体积：
V＝82080÷3＝27360 mL
离子交换层析样液制备（5mmolL NaAcHAc等倍稀释）：
V＝1×27360＝27360 mL
层析操作中缓液量：衡预洗脱洗脱＝223倍柱体积
离子交换层析（衡液：5mmolL NaAcHAc洗脱液：5mmolL NaAcHAc02molL NaCl）：
衡V＝2×550＝1100 mL
洗脱V＝3×550＝1650 mL取2000 mL
疏水层析样液制备（样品缓液等倍稀释）缓液配方：5mmolL NaAcHAc10mmolL TrisHCl1molL (NH4)2SO4：
V＝1×1650＝1650 mL取2000 mL
疏水层析（衡液：10mmolL TrisHCl03molL (NH4)2SO4预洗脱液：20mmolL TrisHCl02molL (NH4)2SO4洗脱液：10mmolL TrisHCl001molL (NH4)2SO4）：
衡V＝2×750＝1500 mL
预洗脱V＝2×750＝1500 mL
洗脱V＝3×750＝2250 mL取2500 mL
超滤脱盐（缓液：5mmolL NaAcHAc3倍体积透析）：
V＝3×2250＝6750 mL
离子交换层析样液制备（样品缓液等倍稀释）缓液：5mmolL NaAcHAc：
V＝1×2250＝2250 mL
离子交换层析（缓液：5mmolL NaAcHAc洗脱液：5mmolL NaAcHAc05molL NaCl）：
衡V＝2×170＝340mL
洗脱V＝3×170＝510mL取1000 mL
分子筛层析（缓液：5mmolL NaAcHAc）：
衡V＝2×15700＝31400mL
洗脱V＝3×15700＝47100mL
10mmolL TrisHCl量：
V＝32000＋32000＋13680＋82020＋164160＝323920 mL取330000 mL
5mmolL NaAcHAc量：
V＝27360＋1100＋5750＋2250＋340＋31400＋47100＝116300取120000 mL
21TrisHCl量：
m＝（330000＋14000＋46000＋2000＋2500）÷1000×001×1576＋1500÷1000×002×1576＝62646 g
22脲量：
m＝46000÷1000×4×6006＋14000÷1000×5×6006＝1525524g
23EDTA量：
m＝（46000＋14000）÷1000×0005×292248＝876744 g
24氯化钠量：
m＝2000÷1000×02×585＋1000÷1000×05×585＝5265 g
25硫酸铵量：
m＝2000÷1000×1×13214＋1500÷1000×03×13214＋2500÷1000×001×13214＋1500÷1000×02×13214＝3666885g
26β疏基乙醇量：
m＝13680÷1000×001×7813＝1069 g
pH40醋酸钠醋酸缓液中成分配：
pH＝pKa－lg([HAc] [Ac])
4＝476－lg([HAc] [Ac]）
Lg([HAc] [Ac])＝076
[HAc] [Ac]＝5621
5mmolL NaAcHAc中成分含量：
NaAc＝0005÷662×82＝00619 g
HAc＝0005÷562×60＝02547 g
27生产批重组粒细胞刺激子原液需水醋酸钠冰醋酸：
水醋酸钠＝00619×（120000＋2000＋2000＋1000）÷1000＝77375 g
冰醋酸＝02547×（120000＋2000＋2000＋1000）÷1000＝318375g
28注射水量：
V＝330000＋120000＋46000＋14000＋2000＋2000＋1500＋1500＋2500＋1000＝520500 mL5205 kg
表32缓液配置物料量
物料名称
g批
kga
TrisHCl
62646
4386
脲
1525524
106787
EDTA
876744
614
氯化钠
5265
369
硫酸铵
3666885
2569
β疏基乙醇
1069
075
水醋酸钠
77375
055
冰醋酸
318375
223
菌注射水
520500
36435
33蒸汽量
单发酵罐蒸汽混合加热蒸汽消耗量计算公式：
DGCt2t1ιt2⋅C1+η （式31）
式中：D——蒸汽消耗量（kg）
G——加热料液量（kg）
C——料液热[kJ(kg·°C)]
t2——加热结束时料液温度（℃）
t1——加热开始时料液温度（℃）
ι——饱蒸汽热焓27253kJkg03MPa
η——加热程中热损失增加蒸汽消耗量η取510
料液热
c037×418x＋4 18× (1－x)
x——固形物质量百分
批加热料液量（忽略种子液）：
G发酵液＝998＋（499＋998＋499＋499＋499＋17964＋499＋998＋
499＋499＋0196＋0599＋0399＋0499＋016）÷1000
＝10529kg
G补料液＝40+（1000＋2000＋1000＋1000＋1000）÷1000
＝46kg
固形物质量百分：
X发酵液＝（499＋998＋499＋499＋499＋17964＋499＋998＋499＋ 499＋0196＋0599＋0399＋0499＋016）÷1000÷10524
＝522
X补料液＝（1000＋2000＋1000＋1000＋1000）÷1000÷46
＝130
料液热容：
C发酵液＝037×418×522＋4 18× (1－522)＝404kJ(kg·℃)
C补料液＝037×418×130＋4 18× (1－130)＝415kJ(kg·℃)
选取10℃液料年中低温度t110℃η取10
加热料液蒸汽消耗量：
D发酵液＝10524×404×（121－10）×（1＋10）÷（27253－121×404）＝2335kg
D补料液＝46×415×（121－10）×（1＋10）÷（27253－121×415）＝1048 kg
发酵罐空罐灭菌时消耗蒸汽量：
D5VFρs （式32）
式中：VF——发酵罐全容积（m3）
ρS——发酵罐灭菌时罐压饱蒸汽密度（kgm3）
压力03MPa时水蒸汽密度ρS1627 kgm3发酵罐全容积02m3补料罐全容积005m3空罐灭菌消耗蒸汽量：
D`发酵罐＝5VFρS＝5×02×1627＝1627kg
D`补料罐＝5VFρS＝5×005×1627＝01627kg
般情况灭菌时保温消耗蒸汽量实罐灭菌发酵液加热时消耗蒸汽量30－50估算实罐灭菌保温消耗蒸汽量：
D``发酵罐＝50D发酵液＝1168kg
D``补料罐＝50D补料液＝524kg
总消耗蒸汽量：D总发酵罐＝D发酵液＋D`发酵罐＋D``发酵罐
＝2335＋1627＋116836657kg
D总补料罐＝D补料＋D`补料罐＋D``补料罐
＝1048＋01627＋524＝158827kg
D总＝D总发酵罐＋D总补料罐＝76258kg
表3 4蒸汽消耗量
工段
发酵罐kg批
补料罐kg批
总计kg批
ta
培养基加热
2335
1048
3383
75695
空罐灭菌
1627
01627
17897
13016
保温
1168
524
1692
37848
总计
36657
158827
525397
3677779
34生产水量
341培养基缓液配制水量
培养基配置需纯水量：
W＝105＋18＋43＝166 kg
配置缓液需注射水量：
V＝（330000＋120000＋46000＋14000＋2000＋2000＋1500＋1500＋2500＋1000）÷1000＝5205 kg
342发酵时水量
发酵温度37℃高室温需发酵程中热量变化进行计算确定发酵程中需加热冷
发酵程中热量衡算式：
ΣQ入＝ΣQ出＋ΣQ损 （式33）
ΣQ入＝Q1＋Q2＋Q3 （式34）
ΣQ出＝Q4＋Q5＋Q6＋Q7 （式35）
ΣQ损＝Q8 （式36）
式中：∑Q入——输入热量总（kJ）
∑Q出——输出热量总（kJ）
∑Q损——损失热量总（kJ）
Q1——物料带入热量（kJ）
Q2——加热剂（冷剂）传设备处理物料热量（kJ）
Q3——程热效应包括生物反应热搅拌热（kJ）
Q4——加热物料带出热量（kJ）
Q5——加热设备需热量（kJ）
Q6——加热物料需热量（kJ）
Q7——气体蒸汽带出热量
（式34）（式35）（式36）代入（式33）：
Q1＋Q2＋Q3＝Q4＋Q5＋Q6＋Q7＋Q8
（1）物料带入量Q1物料带出量Q4
Q＝∑mct （式37）
式中：m——物料质量（kg）
c——物料热容[kJ(kg·K)]
t——物料进入离开设备时温度（℃）
工艺中恒温37℃发酵t进＝t出37℃Q1＝Q4
（2）程热效应Q3
Q3＝QB＋QS （式38）
QS＝3600Pη（kJ） （式39）
式中：QB ——呼吸热（kJ）
P ——搅拌功率（kW）
η——搅拌程功热转化率通常92
（3）空气者蒸汽带出热量Q7
Q7＝∑m（ct＋r） （式310）
式中：m——离开设备气态物料量（kg）
c——液态物料0℃升温蒸发温度均热容[kJ(kg·K)]
t——气态物料温度（℃）
r——蒸发潜热（kJkg）
根生产验Q 7＝Qε＝02 Qb
根理分析发酵热计算公式：
Q发酵热＝Qb＋Qst－Qε （式311）
Qst＝3600ηPst
式中：Qb——生物合成热查肠杆菌生物合成热112298kJkg（葡萄糖）
Qst——机械搅拌热
η——搅拌功率热转换系数092
Pst——搅拌轴功率（kW）
Qε——排气发酵液水分汽化带出热焓Qε＝02 Qb
方便计算假设固形物均葡萄糖根前面计算知发酵液固形物含量522计算： Qb＝112298×522×160＝937913kJ
Qst＝3600×092×06＝19872kJ
Qε＝02×937913＝187583kJ
Q发酵热＝937913＋19872－187583＝55161kJ
Q发酵热＝Q3－Q7
（4）加热设备耗热量Q5 计算方便假设设备处温度致
Q5＝mc（t1－t2） （式312）
式中：m——设备总质量（kg）
c——设备材料热容[kJ(kg·K)]
t1t2——设备加热前均温度（℃）
恒温发酵假设设备温度发酵液致37℃Q5＝0
（5）设备环境散热Q8 方便计算假定设备壁面温度处处相：
Q8＝AαT（tw－ta）τ （式313）
A＝S侧＋2S底 （式314）
S侧＝πDH （式315）
S底＝πRR2＋h2 （式316）
式中：A——设备总表面积（m2）
αT——壁面空气传热系数[W(m2·℃)]然流αT＝8＋005 tw
tw——壁面温度（℃）
ta——环境空气温度（℃）
τ——操作程时间（h）
D——罐径（m）
H——圆柱高（m）
R——罐半径（m）
h——封头高（m）
设备选型知D＝5H＝10R＝25h＝15壁面温度37℃环境空气温度28℃操作时间24时算：
A＝314×5×10＋2×314×25252＋152＝202773
αT＝8＋005×37＝985
Q8＝202773×985×9×24＝431419835kJ
（6）加热物料需热量Q6
Q6＝mc（t2－t1） （式317）
式中：m——物料质量（kg）
c——物料热容[kJ(kg·K)]
t1t2——物料加热前温度（℃）
恒温发酵假设位置发酵液温度致37℃Q6＝0
综述Q1＝Q4Q发酵热＝Q3－Q7Q5＝0Q6＝0整理：
Q2＋Q发酵热＝Q8
Q2＝425903735 kJ
Q2正值发酵程中需加热现选热水做加热剂取进水温度80℃出水温度45℃发酵程中需热水量：
W＝Q2Cw(t2－t1) （式318）
W＝425903735418×（60－45）＝29112 kg
343注射水冷时水量
注射水80℃保温配置溶液时冷水冷室温28℃耗水量计算公式：
WGCT1T2Cwt2t1 （式319）
式中：W——冷水量（kg）
G——需冷物料量（k）g
C——冷物料热容[kJ(kg·°C)]
CW——水热容[418 kJ(kg·°C)]
T1T2——物料冷前温度分80℃28℃
t1t2——冷水初温终温分7℃20℃
注射水冷室温耗水量：
w5205×418×（80－28）418×（20－7）＝2082 kg
表35生产耗水量
工段
规格
kg批
ta
培养基配制
纯水
166
1162
缓液配制
菌水
5205
36435
发酵中保温
80℃热水
29112
203784
注射水冷
冷水
2082
145749
35工艺耗冷量
工艺耗冷量计算公式：
Q＝mc（t2－t1）τ （式320）
式中：Q——工艺耗冷量（kJh）
C——物料热容[kJ(kg·°C)]
t1t2——物料冷前温度（℃）
τ——冷操作程时间（h）
注射水80℃循环保温工艺求注射水2时冷28℃注射水冷耗冷量：
Q＝5205×418（80－28）2＝5656794(kJh)
冷水水28℃冷7℃2时完成水冷耗冷量：
Q＝2082×418（28－7）2＝9137898(kJh)
设备道散失冷量取该工艺耗冷量12非工艺耗冷量：
Q发酵＝12×(5656794＋9137898)＝1775363(kJh)
表36工艺耗冷量
工段
时耗冷量(kJh)
批次耗冷量kJ
年耗冷量kJ
菌水冷
5656794
11313588
7920×106
水冷
9137898
18275796
12793×106
非工艺耗冷量
1775363
3550726
2486×106
总计
16570055
3314011
23198×106
36菌空气
发酵罐消耗菌空气量：
V＝发酵罐体积×通气×装料系数
V＝02×13×08＝0208（m3h）
种子罐消耗菌空气量：
V＝002×13×08＝00208（m3h）
表37菌空气消耗量
设备
时气量（m3h）
生产批产品气量（m3批）
年气量（m3a）
种子罐
00208
0224
1568
发酵罐
0208
4992
34944
总计
02288
5216
36512
4设备选型
41种子培养间
种子操作间需完成种子活化种子液制备需二级生物安全柜进行接种操作选择苏州泰安BSC1000IIA2生物安全柜技术参数：
表41 BSC1000IIA2生物安全柜技术参数
技术参数
洁净等级
HEPA：ISO 5级（100级 Class 100）
ULPA：ISO 4级（10级 Class 10）
滤效率
HEPA：≥9999503µm
ULPA：≥99999012µm
降风速
035ms
流入风速
035ms
工作尺寸
970×600×620mm
外型尺寸
1200×790×2050mm
荧光灯规格数量
36×2
紫外灯规格数量
20×1
度
≥800
外级种子液制备需恒温震荡培养箱培养箱选华美生化HZQF100恒温振荡培养箱技术参数：
表42 HZQF100恒温振荡培养箱技术参数
技术参数
振荡频率
40280rpm
振幅
φ26mm
控温范围
460℃
功率
800W
外型尺寸
630×530×1300mm
二发酵罐接种量10需16L二级种子液φ80装料系数计算批需容量20L种子罐
选择北京满仓科技限公司生产20L搅拌通风锈钢发酵罐MCJSF20L技术参数：
表43 MCJSF20L搅拌通风锈钢发酵罐技术参数
技术参数
公称容积
20L
装液系数
80
筒体高度
1500mm
筒体直径
800mm
实际装液量
24L
搅拌轴转速
150900rpm
搅拌轴功率
025W
42发酵间
工艺求批发酵液160L装料系数φ80需发酵罐容量200L搅拌通风锈钢发酵罐
选择海百伦生物科技200L锈钢全动发酵罐技术参数：
表44 百伦200L锈钢全动发酵罐
技术参数
公称容积
200L
罐径
500mm
罐体高
1300mm
封头高
150mm
全容积
239L
搅拌轴转速
2001200rpm
搅拌轴功率
06kW
发酵程中需通热水确保发酵温度维持37℃选夹套加热部通80℃热水出水口温度45℃现计算需传热面积：
FQK·Δt （式41）
式中：F——传热面积（m2）
K——总传热系数夹套传热系数120180 kJ(m2·℃)间
△t——数均温差恒温传热时△t＝T－t
Q——传热总量kJ
F425903735120×35＝10141m2
加热夹套面积10141m2
43收获间
工艺求发酵液需进行离心收集菌体发酵液体积160L设备选择CARR powerfuge连续工业离心系统该系统全动化流程拥式离心机高速碟片式离心机批量动化优点夹套控温系统外表面电抛光锈钢高压灭菌符合GMP求技术参数：
表45 CARR powerfuge连续工业离心系统技术参数
技术参数
离心力
20000G
高转速
15325rpm
流速范围
601700Lh
沉淀容量
1L32L
夹套温度控制
低18℃
级联放
量高1700升时
菌体收集需进行破菌处理设备选择AST流量细胞破碎机该设备破碎率高次破碎肠杆菌破碎率95酵母菌破碎率90设备压力达1800ar27000psi超高压进料阀特殊设计需进行排气操作直接进料拥位冷系统吸收细胞破碎时产生热量保护胞物质活性受高温影响技术参数：
表46 AST流量细胞破碎机技术参数
技术参数
产品程粘度
< 2000 cPs
进料颗粒尺寸
< 100微米
产量
1540Lh
批次处理量
200ml 200L
温度控制
低20度
均质级数
两级
均质压力
1500bar
功率
30kW
续菌体破菌包涵体获洗涤包涵体裂解超滤离心操作工段继续CARR powerfuge连续工业离心系统中包涵体裂解液超滤工段离心需低温进行
44粗制间
包涵体变性离心清液需045μm滤器滤较杂质免损坏超滤装置滤膜根滤芯材质特点选聚醚砜（PES）滤芯该材质滤芯孔径均匀孔隙率高高流率低溶出物低蛋白质吸附属亲水性滤膜医药工业广泛[24]工艺求需滤液体体积82L1时滤完选取海信步公司型号SHXB1L10精密滤芯式滤器具体参数：
表47 SHXB1L10精密滤芯式滤器技术参数
技术参数
滤量
005th
压力
0106MPa
滤精度
045μm
效滤面积
≤065m 2
滤芯材质
聚醚砜
滤芯长度
013m
滤机蕊数
1
进出径
25mm
设备尺寸(L×W×H)
220×100×600mm
超滤复性选Cogent M1半动超滤系统该系统够进行终点控制恒截留体积控制数记录操作程中进料压力（80psi）压力波动（≤3psi）置10L储液罐满足生产求该系统装配15pellicon2 01m2膜包pellicon3 011m2膜包进行蛋白质肽超滤蛋白质肽洗滤细胞裂解液微滤
膜包选择配套Biomax10P3（pellicon3 011m2 10kDa 聚醚砜膜）该膜包适应较高操作压力温度苛刻清洗求重组蛋白超滤典型应湍流网选择适合重组蛋白超滤粗糙湍流网CScreen膜包技术参数：
表48 Biomax10P3膜包参数
技术参数
高度
23 cm
宽度
56 cm
滤面积
011 m2
保持体积
365mL
长度
206cm
处理量
100mL10L
推荐进料流量
46 Lminm²
材质
聚醚砜
截留分子量
10kDa
浓缩流量
50mlmin
透析流量
80mlmin
工艺求需3时82L清稀释液进行2倍体积透析3倍体积浓缩计算：
透析通量：80×60÷011÷1000＝436 LMH
浓缩通量：50×60÷011÷1000＝273 LMH
透析透量：2×82＝164 L
浓缩透量：164－164÷3＝109 L
透析需面积：164÷436÷3＝013 m2
浓缩需面积：109÷273÷3＝013 m2
透析浓缩工艺需面积026 m2产品批次间差异需配置1215安全系数处选取安全系数126需面积033 m2需3膜包
超滤液体离心收集清液进行045μm滤设备述滤设备
45精制间
层析缓液需045μm滤操作选滤器粗制间相海信步公司型号SHXB1L10045μm精密滤芯式滤器聚醚砜（PES）滤芯
层析ÄKTA pilot 600R层析系统该系统符合GMP工艺求快速识偏差涵盖种规格层析柱该系统较宽流速压力范围兼容径范围26mm200mm层析柱UNICORN软件动装柱快速实现稳固柱床线检测针时层析柱柱体积(CVh)工艺流速UV信号标准化进行编程技术参数：
表49 ÄKTA pilot 600R层析系统技术参数
技术参数
系统泵
两
系统占面积
575×440mm
控制系统
UNICORN软件启开放式通信台（OPC）
环境温度范围
4℃35℃
储存温度
25℃60℃
流速范围
12000mLmin
粘度
0710cP
连续梯度流量范围
4600mLmin
温度传感器
2℃50℃（±2℃）
压力传感器
00200bar（±2001bar）
pH传感器
212pH（±015pH）
电导传感器
01300mScm（±302mScm）
紫外吸光度
06AU（02AU范围线性度2）
紫外波长
190nm700nm（±2nm）
根工艺计算选武汉汇研生物工业层析柱HK1650EK201000润联科技RL7530层析柱技术参数：
表410 层析柱技术参数
产品名称
规格（径mm高度mm）
横截面积cm2
装填体积
装填高度mm
RL7530
75300
441
022088L
50200
HK16100
161000
2
164194ml
820970
EK201000
2001000
314
1572355L
500700
装柱高度：
第次离子交换层析：0 55 L×104÷441cm2＝125mm
疏水层析：075 L×104÷441cm2＝170mm
第二次离子交换层析：017 L×104 cm2÷2＝850mm
分子筛层析：157 L×104÷314 cm2＝500mm
超滤脱盐继续选Cogent M1半动超滤系统膜包选择粗制间超滤系统相工艺求需2时完成225L洗脱峰脱盐根验需3倍体积缓液计算：
透析通量：80×60÷011÷1000＝436 LMH
透析透量：3×225＝675L
透析需面积：675÷436÷2＝0077 m2
安全系数取126实际需膜面积：0077×126＝0097＜011 m2
需1张Biomax10P3膜包满足工艺需求
选取海信步公司型号SHXB1L10精密滤芯式滤器滤芯聚醚砜材质具体参数：
表411SHXB1L10精密滤芯式滤器
技术参数
滤量
004th
压力
0106mpa
滤精度
022μm
效滤面积
≤065m2
滤芯材质
聚醚砜
滤芯长度
015m
滤机蕊数
1
进出径
25mm
设备尺寸(L×W×H)
220×100×600mm
层析操作需低温环境进行生产中常层析柜提供合适低温环境工艺选择福意联公司型号FYLYS430L型层析冷柜技术参数：
表412 FYLYS430L型层析冷柜技术参数
技术参数
制冷剂量
R600a(55g)
效容积
430L
气候类型
85N
温控范围
248℃
温差范围
±2℃
箱体尺寸
(W×D×H)：595×680×1805mm
46灭菌间
需灭菌溶液运输罐玻璃仪器等灭菌器进行灭菌方式已灭菌物品未灭菌物品混杂现选海环宇型号MQS15双扉湿热灭菌柜湖北恒丰型号JGM15BS干热灭菌柜技术参数：
表413 MQS15灭菌柜技术参数
技术参数
容量m3
15
尺寸mm
1900×750×1050
外尺寸mm
2190×1450×1900
蒸汽消耗量kg
60
功率kw
4
工作温度℃
115132
压力MPa
011022MPa
灭菌效果
灭菌产品污染概率百万分
表414JGM15BS干热灭菌柜技术参数
技术参数
容量m3
15
尺寸mm
1900×1000×790
外尺寸mm
2200×1900×1550
温度（高）
热源300℃灭菌250℃干燥100℃
温度均匀度
≤±0025Tmax
温度波动
±1℃
47结
表413 重组粒细胞刺激子原液车间仪器览
车间
设备
数量
种子培养间
BSC1000IIA2生物安全柜
1
HZQF100恒温振荡培养箱
1
MCJSF20L搅拌通风锈钢发酵罐
1
发酵间
百伦200L锈钢全动发酵罐
1
夹套F10141m2
1
收获间
CARR powerfuge连续工业离心系统
1
AST流量细胞破碎机
1
粗制间
SHXB1L10045μm滤器
1
Cogent M1半动超滤系统
1
Biomax10P3膜包
3
精制间
SHXB1L10045μm滤器
1
ÄKTA pilot 600R层析系统
3
RL7530层析柱
2
HK1650层析柱
1
EK201000层析柱
1
Cogent M1半动超滤系统
1
Biomax10P3膜包
1
11SHXB1L10022μm滤器
1
灭菌间
MQS15双扉湿热灭菌柜
1
JGM15BS干热灭菌柜
1
5车间设计
51车间布置
生物制品生产中物料特殊性牛肉膏培养基发酵液等含量营养成分微生物良培养基容易受污染生物制品车间设计需严格GMP规范医药工业洁净厂房设计规范做防治污染交叉污染做布置合理利生产操作开展
重组粒细胞刺激子原液生产车间中生产操作工序种子扩培养工程发酵菌体收获粗纯精纯图51示满足生产工艺求GMP规定重组粒细胞刺激子原液车间设计中种子培养间安排里流物流出入口远方然次发酵车间粗制间精制间种布置方式洁净等级高房间布置车间部洁净等级低车间外围做级净化区域成阶梯级保护[25]外满足菌求单独设立灭菌车间生产中需灭菌仪器等进行灭菌操作灭菌车间设车间外围方便进出物料品时灭菌降低交叉污染防止空调系统交叉污染接种发酵纯化空调系统
图52示流出入口需设置换衣间二更进入C级洁净走廊进入操作岗位物流通外清气锁进入洁净走廊通车间气闸进入相应车间
图53示GMP规定生物制品生产操作应符合相应洁净等级[26]种子细胞接种敞口环境进行需超净工作台背景环境求高[27]种子培养间中准备间摆放超净台属C级背景局部A级洁净区域C+A级属A级[28]需更换洁净工作服求更高菌工作服种子培养间进出口设置更衣室缓间重组细胞发酵密闭系统中进行污染概率车间样安排C级洁净区域
图51车间布置图
图52 流物流图
图53 车间洁净等级区域图
表51 洁净区标准
级
空气悬浮粒子
A级
B级
C级
D级
静态
≥05μm
3520
3520
352000
3520000
≥5μm
20
29
2900
29000
动态
≥05μm
3520
352000
3520000
29000
≥5μm
20
2900
－
－
微生物检测动态标准
浮游菌CFU·m3
＜1
10
100
200
沉降菌（φ90mm）CFU·（4h）1
＜1
5
50
100
表面微生物
接触碟（φ55mm）CFU
＜1
5
25
50
5指手套CFU
＜1
5
－
－
52车间压差分布
生产活动中气锁室作阻隔外界污染气流控制压差般作缓间设置洁净室出入口压力气流方三种气锁室类型分正压气锁室负压气锁室梯度式气锁室梯度气锁室日常生产中常见洁净区间隔离正负压气锁室梯度气锁室阻止含产品高级空气扩散正负压气锁室分隔洁净等级区域外限度阻止含产品空气高级区域低级区域扩散根三种气锁室特点种子培养间洁净等级局部A级走廊洁净等级C级处采梯度气锁室隔离两生产区域保证工艺车间洁净级分隔区域气流避免操作间中含产品空气外扩散洁净走廊工艺车间间采正压气锁室时洁净走廊车间外皆正压满足生产洁净求
洁净厂房设计规范GB500732013中规定洁净区周围空间必须维持定压差等级洁净室间压差宜5Pa洁净区非洁净区间压差应5Pa洁净区室外压差应10Pa[29]根规定物料出入口外清气锁分外界差10Pa20Pa气锁洁净走廊直接差5Pa洁净走廊25Pa种子培养间梯度气锁洁净走廊区分求种子培养间更衣室35Pa缓间40Pa培养间部45Pa物料进出口35Pa
图54车间压差分布级气流方图
6总结
设计重组粒细胞刺激子原液车间设计重组粒细胞刺激子原液生产工艺研究终确定级种子液→二级种子液→发酵→菌体获破菌→包涵体获→包涵体变性→包涵体超滤复性→第次离子交换层析→疏水层析→超滤脱盐→第二次离子交换层析→分子筛层析生产工艺路线条路线山东科兴生物制药限公司专利发明路线该公司重组粒细胞刺激子注射液白喜特售工艺路线实际生产应
根工艺路线进行物料衡算基础完成设备选型根工艺条件选定生物安全柜恒温震荡培养箱连续离心系统细胞破碎机精密滤器超滤系统层析系统灭菌柜等设备需培养基体积选出20L种子罐200L发酵罐发酵程中热量变化确定夹套换热面积F10141m2工艺条件设备参数确定超滤需膜包材质聚醚砜需数量根层析时蛋白质含量结合填料载量确定需填料体积进选定需层析柱
车间设计工艺需条件基础严格洁净厂房设计规范新版GMP等国家标准进行设计力求做防止污染交叉污染工艺需划分种子培养间发酵间收获间粗制间精制间灭菌间根生产操作确定洁净背景C级接种操作特殊性超净工作台创造C级背景局部A级压差维持菌车间洁净手段效防止污染空气低级高级扩散根规定确定车间更衣室压差5Pa20Pa物流通道外清气锁分10Pa20Pa确定洁净区走廊压差25Pa操作房间15Pa种子间特殊性该房间压差高45Pa房间门口设更衣缓等设置
参考文献
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[29] GB500732013洁净厂房设计规范[S]
致谢
毕业设计王莹老师悉心指导完成选题具体写作程老师渊博专业知识严谨治学态度提供非常帮助整写作程中节假日深夜老师提出问题老师会时详回复帮助开拓思路正老师认真负责辞辛苦指导毕业设计利完成
时感谢学期间指导老师做毕业设计时重新捡起已模糊知识想起老师传道受业解惑样子正老师认真教学做毕业设计时少走弯路
感谢学做毕设时互相交流启发提出建设性意见感谢舍友然疫情原屋檐然会互相帮助互相答疑互相分享
百忙中抽时间文进行审阅评议参文答辩位老师表示诚挚谢意
附录
附录 重组粒细胞刺激子原液车间设计图
附录二 重组粒细胞刺激子原液车间流物流图
附录三 重组粒细胞刺激子原液车间气压气流图
附录四 重组粒细胞刺激子原液车间洁净区域图
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重组粒细胞刺激子原液车间设计
摘
重组粒细胞刺激子（recombinant human granulocyte stimulating factorrhGCSF）具刺激中性粒细胞系增殖分化成熟激活血液中成熟中性粒细胞功目前床应抗肿瘤放疗化疗期间出现良反应先天天中性粒细胞减少症文重组粒细胞刺激子原液生产工艺流程容进行研究选取合适生产工艺根生产求确定相适应设备终根物料衡算确定设备参数进行设备选型结合GMP制药行业标准车间进行设计绘制车间面布置图
关键词：重组粒细胞刺激子物料衡算设备选型车间设计
Workshop design of recombinant human granulocyte stimulating factor stock solution
Abstract
Recombinant human granulocyte stimulating factor has the function of stimulating the proliferation differentiation and maturation of neutrophils and activating the mature neutrophils in blood At present it is mainly used in antitumor radiotherapy and chemotherapy as well as congenital and acquired neutropenia In this paper the production process and content of recombinant human granulocyte stimulating factor stock solution were studied the appropriate production process was selected the corresponding equipment was determined according to the production requirements and finally the equipment parameters were determined according to the material balance for equipment selection and the production workshop was designed in combination with GMP and pharmaceutical industry standards and the workshop layout was drawn
Keywords：recombinant human granulocyte stimulating factor material balance calculation equipment Selection workshop design
目录
1前言 1
11粒细胞刺激子作机制 1
12重组粒细胞刺激子应 1
121肿瘤放化疗中性粒细胞减少 1
122动员外周造血干细胞 1
123辅助AIDS治疗 2
13国外研究现状发展趋势 2
14重组肠杆菌高密度发酵 3
141培养基 3
142 pH值 3
143温度 4
144溶氧 4
145诱导方法 4
146补料方法 5
15层析技术 5
151离子交换层析 5
152疏水层析 5
153分子筛层析 5
16设计目意义 6
2工艺路线 7
21重组粒细胞刺激子原液生产工艺 7
22重组粒细胞刺激子生产流程简述 7
221种子扩培养工程菌发酵 7
222重组粒细胞刺激子原液提纯 8
223原液保存 9
23结 10
3工艺计算 12
31基础数 12
32生产程中物料衡算 12
321培养基物料衡算 12
322层析填料量计算 14
323缓液物料衡算 15
33蒸汽量 18
34生产水量 20
341培养基缓液配制水量 20
342发酵时水量 20
343注射水冷时水量 23
35工艺耗冷量 24
36菌空气 24
4设备选型 26
41种子培养间 26
42发酵间 27
43收获间 28
44粗制间 29
45精制间 30
46灭菌间 32
47结 33
5车间设计 35
51车间布置 35
52车间压差分布 37
6总结 38
参考文献 39
致谢 41
附录 42
1前言
11 粒细胞刺激子作机制
粒细胞刺激子（GCSF）种肽糖蛋白分子20kDaGCSF中性粒细胞系作机制表现：粒系祖细胞特异结合时促进粒系祖细胞增殖分化成熟中性粒细胞结合时增强中性粒细胞趋化性吞噬杀伤力中性粒细胞进行调节驱中性粒细胞血液释放作髓系造血细胞时促进增值分化成熟[1]正常情况体GCSF会维持稳定水应激情况仅激活巨噬细胞单核吞噬细胞产物作皮细胞产生GCSF成纤维细胞淋巴细胞白细胞介素Ⅰ(InterleukinⅠ ILⅠ)刺激会产生量GCSF中性粒细胞迅速骨髓等储存池中补充增强机体抗感染力[2]
重组粒细胞刺激子（rhGCSF）通基工程技术肠杆菌表达系统重组表达制备成分子19kDa糖基化蛋白质研究表明NSF60生物测定中糖基化糖基化GCSF具相生物学活性[3]重组粒细胞刺激子源性GCSF具等生物学活性
12 重组粒细胞刺激子应
121肿瘤放化疗中性粒细胞减少
放化疗程中药物通常通破坏DNA抑制细胞周期达抗肿瘤目会骨髓细胞造成影响通常情况化疗效果药物剂量成正相关药物剂量越骨髓抑制越严重导致中性粒细胞减少免疫力降感染发症概率提升感染种癌症死亡原外白细胞数目减少源性制热子肿瘤坏死子生成导致患者体温升高发生中性粒细胞缺乏发热（Febrile Neutropenia FN）FN患者感染发症概率远远高普通患者[4]
rhGCSF起预防中性粒细胞减少症发生[5]减轻中性粒细胞减少程度[6]缩短粒细胞缺乏症持续时间加速粒细胞恢复减少合感染发热危险性外rhGCSF先天性中性粒细胞缺乏患者作
122动员外周造血干细胞
干细胞移植医学应广泛治疗种疾病血液系统疾病神性疾病代谢性疾病身免疫病缺血性疾病中研究表明GCSF增加外周血中造血干细胞祖细胞数量骨髓细胞动员特异性[79]rhGCSF作动员剂床已广泛应取效果[10]
中性粒细胞减少动员造血干细胞rhGCSF外目前床新应例治疗急性脑梗死[11]肝脏干细胞移植[12] [13]
123辅助AIDS治疗
HIV感染特异性免疫系统中T细胞导致免疫功紊乱非特异性免疫系统细胞巨噬细胞树突细胞等受感染艾滋病病程中中性粒细胞单核细胞淋巴细胞数量功均发生病理改变外艾滋病患者免疫信号系统特细胞子介导系统出现重缺陷终会引起免疫系统崩溃GCSF免疫介质网络中关键细胞子国家中已证实治疗HIV感染者中性粒细胞减少症[14]中性粒细胞减少艾滋病晚期常见通常逆转录病毒感染药物治疗系统感染身免疫机制直接引起艾滋病患者中性粒细胞凋亡功损伤会进步加剧潜免疫缺陷增加继发性某感染风险反促炎细胞子水增加病毒血症病毒复制恶性循环关床中GCSF联合抗生素抗真菌治疗种单独治疗结果更HIV感染者中性粒功缺陷通体外注射GCSF改善纠正
13 国外研究现状发展趋势
1985年科学家成功精制提纯出GCSF1986年成功克隆出GCSF基1990年克隆出GCSF受体基重组粒细胞刺激子发展坚实基础
1991年．Amgen公司filgrastim（商品名：NeupogenGran）通FAD批准成功市Neupogen全球首通基重组技术生产肠杆菌表达（发生糖基化）rhGCSF国首市rhGCSF日麒麟鲲鹏（中国）公司开发CHO细胞中表达（发生糖基化）Lenograstim（商品名：NeutoginGrancyte）两款均短效GCSF药物止国国生产短效GCSF企业20家
2002年Amgen公司推出长效型GCSFNeulasta（培非格司亭）全球首PEG化长效rhGCSF短效GCSF相PEG修饰GCSF药物半衰期延长药频率化疗天12次药514天变成化疗周期注射次方便患者减轻患者痛苦效果明显优短效药目前国百克生物津优力®齐鲁制药新瑞白®恒瑞艾®
值注意键隆创新药F627第三代重组粒细胞刺激子药物F627重组粒细胞集落刺激子双分子（rhGCSFFc融合蛋白）长效型GCSF相更强效根公司公告该药品澳利亚完成Ⅰ期床试验中现实良安全性药代动力学特点国际中心Ⅱ期床试验显示该药治疗效果Neulasta相似半衰期Neulasta略长国III期床已取阶段性进展床结果符合预期成国第四市长效GCSF
Amgen公司1991年推出短效GCSF市20年里销售额稳定10亿美元年长效化代药生物类似药 Granix Zarxio 市击市场份额减少2017 年销售额 386 亿美元Amgen公司推出首长效GCSF市市场份额占路增2015年达4715亿美元峰值2017年市场占达892目前全球GCSF药物市场规模超50亿美元长效GCSF药物已成市场流占约70
国市场格局整GCSF市场销售额约40亿元着2017年医保目录调整聚乙二醇重组粒细胞刺激子进入国家医保乙类目录2019年医保局发布2019年国家医保药品目录调整工作方案国长效GCSF进入快速发展期短效GCSF导局面会破
14 重组肠杆菌高密度发酵
141培养基
培养基微生物提供生长繁殖需营养物质微量元素工配置养料般培养基包含碳源氮源机盐水根微生物会适添加微量元素维生素培养基会添加抗生素激素者血清规模发酵生产中重组肠杆菌发酵普遍半合成培养基LB培养基M9培养基
肠杆菌高密度发酵中常碳源葡萄糖外糖类油脂机酸低碳醇葡萄糖效应葡萄糖作碳源弊端会导致乙酸等代谢副产物产生[15]生产时需控制葡萄糖浓度
培养基添加碳源分机碳源机碳源机碳源相机碳源丰富机盐生长子机碳源时微生物会机氮源生长旺盛菌体浓度增长速度机氮源快工业常机氮源：黄豆粉酵母粉玉米浆酒糟等值注意酸水解酪蛋白含氮量高达80含量游离氨基酸微量元素应培养基中缩短发酵周期加快菌体繁殖增强蛋白质表达提高发酵中产出率
微生物生长代谢需机盐参机盐生理功[16]氯化钠调节渗透压镁离子酶激活剂磷酸参细胞代谢参细胞膜蛋白质核酸组成铁离子参电子传递种酶活性基团组成部分钾离子某酶辅子维持渗透压锌离子代生长子刺激细胞生长
142pH值
种微生物pH值会形成产物pH值会着菌体代谢活动产生规律变化例培养基中碳源菌体代谢产物酸性物质溶解氧足消泡剂添加量等会导致pH值降氮源菌体代谢产物碱性物质菌体发生溶时pH升
肠杆菌代谢副产物乙酸般说发酵液中乙酸浓度510gL时观测乙酸菌体生长速率产物抑制乙酸浓度1020gL时菌体停止生长生产实践中发酵液乙酸浓度高12gL时会抑制外源蛋白表达[17]规模工业生产中需减少乙酸产生常采方法控制生长速率移乙酸 控制葡萄糖浓度碱中pH规模发酵中常方法碱中法方法操作简单成低设备求低
143温度
肠杆菌适宜发酵温度37℃温度肠杆菌增长速率会增温度高菌体代谢加快副产物产生速率会加快导致代谢产物积累菌体生长繁殖产生抑制利目蛋白获取菌体生长快时重组质粒复制次数会增加变异率会达利质粒稳定温度低菌体营养物质获取会减慢新陈代谢减慢减少目蛋白合成工业生产中保证产量需获足量菌体进行目蛋白诱导
144溶氧
重组肠杆菌氧发酵条件合成目蛋白规模发酵中通搅拌方式菌体供菌空气维持菌体生长代谢肠杆菌代谢氧呼吸关数生长期中DO明显降时通DO降情况判断菌体生长情况菌体DO出现溶氧反弹降判断菌体开始利第二种基质二次生长中非常常见菌体发生溶DO会升实际生产中DO越高越利DO高时会形成超氧化物离子O22氧化物离子O2O22会H+结合生成H2O2O2会H2O2反应产生OH破坏细胞组分[18]工业通调节通气量搅拌速率间接调节菌体发酵周期代谢产物合成目前常调节溶氧方法改变通气速率改变搅拌速率改变发酵罐罐压改变发酵液理化性质等
145诱导方法
目前重组粒细胞刺激子生产中常诱导方法高温诱导法IPTG乳糖诱导剂法[19]高温诱导法根启动子较低温度（37℃）时抑制较高温度（42℃）时开放特点通升高环境温度目蛋白表达进行诱导高温菌体代谢速率加快会引起代谢副产物乙酸积累抑制目蛋白表达IPTG诱导剂启动子阻遏蛋白结合阻遏蛋白启动子解离启动转录IPTG种稳定诱导剂会细菌代谢外乳糖代IPTG作诱导剂细胞β半乳糖甘酶乳糖转化成异乳糖异乳糖具诱导作乳糖转化较复杂IPTG相乳糖诱导效率低IPTG外乳糖种肠杆菌利碳源乳糖会菌体代谢产生影响
146补料方法
防止高糖条件产生葡萄糖效应影响目蛋白合成工业通常会合理控制流加营养物肠杆菌高密度发酵中常补料方法分批补料法流加方式分反馈补料非反馈补料反馈补料通检测发酵液pH溶氧菌体浓度二氧化碳释放率等参数调节补料速度非反馈补料法恒速补料变速补料指数补料等技术恒速补料流加速度恒定菌体生长速率时间增长降变速补料高密度发酵促进细胞增长利产物表达指数流加减少代谢产物乙酸生成
15 层析技术
151离子交换层析
离子交换层析时利蛋白质表面带电荷蛋白质逆结合离子交换剂pH值离子强度缓液洗脱结合离子交换剂蛋白质缓液中离子发生交换脱离离子交换剂洗脱溶液中物质离子交换剂结合力洗脱序样达分离目离子交换层析般肽分离蛋白质分离核苷酸核苷种碱基分离
重组粒细胞子（pI5866）缓液（pH4）中带正电应选阳离子交换剂
152疏水层析
盐水体系中蛋白质分子疏水基团层析介质疏水配基间结合作力强弱疏水层析利两者差达分离目蛋白质变性高盐环境蛋白质水化层破坏疏水残基暴露表面样品变性高盐处理进行疏水层析离子强度高低洗脱液疏水作弱强组分分开蛋白质样品旧保留生物学活性疏水层析操作成低产物活性工业生产中广泛应般蛋白质初步分离盐析蛋白质进步提纯
153分子筛层析
分子筛层析凝胶滤层析排阻层析蛋白质分子形状进入特定孔径凝胶颗粒力分子量蛋白进入凝胶部首先洗脱分子越凝胶部滞留时间越长越晚洗脱完成分离般应分离纯化脱盐相分子量测定
16 设计目意义
2018年全球癌症年报统计数显示2018年全球预计1810万癌症新发病例亚洲占50全球死亡病例高达960万亚洲占60例2018年国癌症新发病例3804万例死亡病例2296万癌症发病率死亡率断升情况前中国癌症发病数死亡数均位居全球第[20]
第五届全国艾滋病学术会传出数2018年第2季度中国新发现艾滋病病毒感染者艾滋病40104例中性传播占931 艾滋病基数逐年增加年国年报告新发现HIV感染者AIDS病均超10万例年年2018年6月30日全国报告现存活艾滋病感染者超82万[21]
数表明国重组粒细胞刺激子注射液需求逐年升纳入医保范畴着技术发展研究深入重组粒细胞刺激子更方面应通分子修饰等手段逐渐改变原缺点重组粒细胞刺激子原液车间设计必国着成熟重组粒细胞刺激子原液生产工艺研发创新属产品增加重组粒细胞刺激子注射液产量提高产品质量等国医疗市场重意义
2工艺路线
21重组粒细胞刺激子原液生产工艺
目前市场重组粒细胞刺激子通液体培养基中规模发酵培养表达GCSF肠杆菌[22]含重组粒细胞刺激子溶性包涵体变性复性处理恢复生物学活性重组粒细胞刺激子原液[23]生产程分：种子扩培养工程菌发酵重组粒细胞刺激子原液提纯两阶段
22重组粒细胞刺激子生产流程简述
221种子扩培养工程菌发酵
2211级种子液获取
冻存种子液解冻（100μL）接种含160mlLB培养基250ml摇瓶中37℃±1℃pH68±02转速200rmin摇瓶进行级种子培养8时LB培养基配方：蛋白胨5gL酵母粉10gL氯化钠5gL
2212二级种子液获取
培养基进行实罐灭菌开启发酵罐搅拌装置采取然冷培养基冷50℃时开始通入菌压缩空气继续搅拌确保发酵开始时定氧含量
1接种量级种子液接种含16LLB培养基20L种子罐中37℃±1℃pH68±02转速500rmin通气13vvm种子罐进行二级种子培养8时种子液配方：蛋白胨5 gL酵母粉10 gL氯化钠5 gL
2213工程菌发酵
培养基进行实罐灭菌开启发酵罐搅拌装置采取然冷培养基冷50℃时开始通入菌压缩空气继续搅拌确保发酵开始时培养基定氧含量
二级种子液10接种量接种含104L培养基200L发酵罐中进行分批流加补料发酵发酵需空气空气滤器菌压缩机发酵温度37℃±1℃DO5060pH70±02转速700rmin通气13vvm发酵程中氨水调节pH值加入消泡剂消泡时取样测OD600进入数生长期隔1时分批流加补料液次10L流加40LOD60025时加入7mmolL IPTG诱导表达种子放进入发酵罐发酵时间约24h
发酵液配方：蛋白胨5 gL酵母粉10 gL氯化钠5 gL酸水解酪蛋白5 gL氯化铵1 gL磷酸二氢钾5 gLNa2HPO4·12H2O 18 gL硫酸镁05 gL氯化钙05 gL微量元素母液1mlL
微量元素母液：ZnCl2·4H2O 2 gLCoCl2·6H2O 6 gLFeSO4·16H2O 4 gLH2BO3 5 gLMnCl2·4H2O 16 gL
补料配方：蛋白胨25 gL酵母粉50 gL葡萄糖25 gL氯化钠5 gL
222重组粒细胞刺激子原液提纯
工艺中10mmolL TrisHCl pH值855mmolL NaAcHAc pH值40层析操作中缓液量：衡预洗脱洗脱＝223倍柱体积
2221包涵体收集洗涤
发酵液离心（10000rmin 15min）收集沉淀菌体TrisHCl＝110（gml）例10mM TrisHCl溶液重悬沉淀充分搅匀次离心收集沉淀完成菌体洗涤相例加入10mM TrisHCl菌悬液进行破碎匀浆离心（10000rmin 15min）收集沉淀该沉淀粗包涵体
粗包涵体包涵体缓液＝115（gmL）例成分5mM EDTA 4M脲10mM TrisHCl缓液充分搅匀离心（10000rmin 15min）收集沉淀沉淀TrisHCl＝115（gmL）例沉淀中加入10mM TrisHCl溶液充分搅匀离心（10000rmin 15min）收集沉淀沉淀洗涤包涵体
2222包涵体变性复性
包涵体重悬（菌体：缓液115（gmL））10mM TrisHCl5M脲5mM EDTA缓液中边搅拌边加入10mM β疏基乙醇密封充分搅拌2时离心（13000rmin 15min）收集清液清：TrisHCl＝16(VV)例边搅拌边加入10mM TrisHCl缓液完成清稀释稀释清需045μm滤器进行滤
10mM TrisHCl缓液滤稀释清进行恒体积超滤跨膜压力50psig2倍体积稀释3倍体积浓缩工艺求3时完成操作离心（10000rmin 15min）收集清液
2223离子交换层析
超滤离心收集清液5mM NaAcHAc等倍稀释制成离子交换层析样液045μm滤器滤填料CM Sepharose FF5mM NaAcHAc缓液衡层析柱样5mM NaAcHAc02M NaCl缓液洗脱收集洗脱峰
2224疏水层析
5mM NaAcHAc稀释蛋白溶液加入10mM TrisHCl1M (NH4)2SO4(NH4)2SO4终浓度03M作疏水层析样液045μm滤器滤填料Pheny1 sepharose High performance05M NaOH处理10mM TrisHCl溶液洗层析柱流出液电导洗液致10mM TrisHCl03 M (NH4)2SO4 溶液衡层析柱样10mM TrisHCl03 M (NH4)2SO4 溶液衡层析柱20mM TrisHCl 02M (NH4)2SO4 预洗脱10mM TrisHCl001 M (NH4)2SO4 溶液洗脱收集洗脱峰
2225超滤脱盐
疏水层析蛋白溶液进行045μm滤操作5mM NaAcHAc作缓液蛋白溶液进行3倍体积透析超滤脱盐电导率≤1500μscm脱盐完成需2时完成工艺操作
2226离子交换层析Ⅱ
5mM NaAcHAc缓液稀释脱盐完成蛋白溶液045μm滤填料CM Sepharose FF5mM NaAcHAc缓液衡层析柱样5mM NaAcHAc05M NaCl缓液洗脱收集洗脱峰
2227分子筛层析
离子交换层析蛋白溶液进行045μm滤操作填料Sephacryl S1005mM NaAcHAc缓液衡层析柱样5mM NaAcHAc缓液洗脱收集洗脱峰
223原液保存
分子筛层析蛋白溶液022μm滤器滤菌重组粒细胞刺激子原液（pH40）加入聚山梨酯80（避免容颗粒产生）甘露醇（等渗剂）配制次进行022μ滤器滤菌重组粒细胞刺激子保存原液
23结
图重组粒细胞刺激子原液工艺流程图
（接图）
（接图）
图21 重组粒细胞刺激子原液工艺流程图
3工艺计算
31基础数
生产天数：210天
生产周期：3天
种子液发酵时间：8时
种子液放进入发酵罐发酵时间：24时
倒罐率：1
发酵罐装液系数：80
发酵罐通气：13vvm
二级种子液接种量：1
发酵液接种量：10
蛋白表达量：20mgL
发酵菌体重量：20gL
包涵体产率：30
第次离子交换层析收率：49
疏水层析收率：573
第二次离子交换层析收率：637
分子筛层析收率：679
二级种子液接种量：1
发酵液接种量：10
32生产程中物料衡算
3天批量计算生产批重组粒细胞刺激子需物料量年生产批数：210÷3＝70(批)
321培养基物料衡算
选容量200L发酵罐1装料系数08：
1发酵液量：
V＝200×08＝160 L
批产量：
m＝160×20×（1－1）＝3168 mg
2二级种子液量：
V＝160×10＝16 L
3级种子液量：
V＝16 L×1＝160 mL
补料取40 L实际生产中需配制发酵培养基量：
V＝160－16－016－40＝10384 L
实际生产中溶液配制需富余现发酵液105L种子液18L补料液43L配制量计算需成分
4蛋白胨：
m＝10×18＋5×105＋25×43＝1780g
5酵母粉：
m＝10×18＋10×105＋50×43＝3380g
6葡萄糖：
m＝5×105＋25×43＝1600g
7氯化钠：
m＝5×18＋5×105＋25×43＝1690g
8酸水解酪蛋白：
m＝5×105＋25×43＝1600g
9 Na2HPO4·12H2O：
m＝18×105＝1890g
10磷酸二氢钾：
m＝5×105＝525g
11氯化铵：
m＝1×105＝105g
12硫酸镁：
m＝05×105＝525g
13氯化钙：
m＝05×105＝525g
14 ZnCl2·4H2O：
m＝2×105÷1000＝021g
15 CoCl2·6H2O：
m＝6×105÷1000＝063g
16 FeSO4·16H2O：
m＝4×105÷1000＝042g
17H2BO3：
m＝5×105÷1000＝0525g
18MnCl2·4H2O：
m＝16×105÷1000＝0168g
19TPTG：
m＝160×0007×2383＝2669 g
20消泡剂：
V＝1×40＝40 mL
表31发酵车间物料衡算
物料名称
g批
kg年
蛋白胨
1780
1246
酵母粉
3380
2366
葡萄糖
1600
122
氯化钠
1690
1183
酸水解酪蛋白
1600
112
Na2HPO4·12H2O
1890
1323
磷酸二氢钾
525
3675
氯化铵
105
735
硫酸镁
525
3675
氯化钙
525
3675
ZnCl2·4H2O
021
00147
CoCl2·6H2O
063
00441
FeSO4·16H2O
042
00294
H2BO3
0525
00368
MnCl2·4H2O
0168
00118
TPTG
2669
18683
消泡剂
40
2800
322层析填料量计算
根生产数中重组粒细胞刺激子终产量20mgL知批发酵液重组粒细胞刺激子160 L×20 mg＝3200 mg
进行分子筛层析前蛋白含量：3200÷679＝4712 mg
进行离子交换层析前蛋白含量：4712÷637＝7397 mg
进行疏水层析前蛋白含量：7397÷573＝12909 mg
进行第次离子交换层析前蛋白含量：12909÷49＝26344mg
28第次离子交换层析填料CM Sepharose FF（动态载量105mgml）量：
V＝26344 mg÷105 mgmL÷50＝717mL取750mL
29疏水层析填料Phenyl sepharose High performance（动态载量45mgml）量：
V＝12909 mg÷45 mgmL÷40＝502mL取550mL
30第二次离子交换层析填料CM Sepharose FF（动态载量105mgml）量：
V＝7397 mg÷105 mgmL÷50＝141mL取170mL
31分子筛层析填料Sephacryl S100（样量占柱体积4）量：
V＝V样量÷4＝510mL÷4＝12750mL取15700mL
生产中保证填料载量满足生产需求生产14批产品换次填料年需5份填料
表3 3层析填料量
填料名称
mL批
La
CM Sepharose FF
920
46
Phenyl sepharose High performance
550
275
Sephacryl S100
15700
785
323缓液物料衡算
工艺中10mmolL TrisHCl pH值855mmolL NaAcHAc pH值40
发酵液中离心收集菌体量：
m＝160 L×20 gL＝3200 g
菌体洗涤（菌体10mmolL TrisHCl＝110）：
V＝10×3200＝32000 mL
菌体重悬（菌体10mmolL TrisHCl＝110）：
V＝10×3200＝32000 mL
破菌操作中菌体破碎率95离心收集沉淀重量：
m＝3200×95＝3040 g
粗包涵体获（包涵体缓液＝115（gmL））缓液配方：10mmolL TrisHCl5mmolL EDTA4molL脲：
V＝15×3040＝45600 mL取46000 mL
包涵体产率30收集包涵体重量：
m＝3040×30＝912 g
包涵体洗涤（包涵体10mmolL TrisHCl＝115（gmL））：
V＝15×912＝13680 mL
包涵体重悬变性（包涵体缓液＝115）缓液配方：10mmolL TrisHCl5molL脲5mmolL EDTA10mmolL β疏基乙醇：
V＝15×912＝13680 mL取14000 mL
清液稀释（清液10mmolL TrisHCl＝16）：
V＝6×13680＝82080 mL
超滤复性先进行2倍透析进行3倍浓缩（稀释液10mmolL TrisHCl＝12）：
V＝2×82080＝164160 mL
恒体积超滤终体积：
V＝82080÷3＝27360 mL
离子交换层析样液制备（5mmolL NaAcHAc等倍稀释）：
V＝1×27360＝27360 mL
层析操作中缓液量：衡预洗脱洗脱＝223倍柱体积
离子交换层析（衡液：5mmolL NaAcHAc洗脱液：5mmolL NaAcHAc02molL NaCl）：
衡V＝2×550＝1100 mL
洗脱V＝3×550＝1650 mL取2000 mL
疏水层析样液制备（样品缓液等倍稀释）缓液配方：5mmolL NaAcHAc10mmolL TrisHCl1molL (NH4)2SO4：
V＝1×1650＝1650 mL取2000 mL
疏水层析（衡液：10mmolL TrisHCl03molL (NH4)2SO4预洗脱液：20mmolL TrisHCl02molL (NH4)2SO4洗脱液：10mmolL TrisHCl001molL (NH4)2SO4）：
衡V＝2×750＝1500 mL
预洗脱V＝2×750＝1500 mL
洗脱V＝3×750＝2250 mL取2500 mL
超滤脱盐（缓液：5mmolL NaAcHAc3倍体积透析）：
V＝3×2250＝6750 mL
离子交换层析样液制备（样品缓液等倍稀释）缓液：5mmolL NaAcHAc：
V＝1×2250＝2250 mL
离子交换层析（缓液：5mmolL NaAcHAc洗脱液：5mmolL NaAcHAc05molL NaCl）：
衡V＝2×170＝340mL
洗脱V＝3×170＝510mL取1000 mL
分子筛层析（缓液：5mmolL NaAcHAc）：
衡V＝2×15700＝31400mL
洗脱V＝3×15700＝47100mL
10mmolL TrisHCl量：
V＝32000＋32000＋13680＋82020＋164160＝323920 mL取330000 mL
5mmolL NaAcHAc量：
V＝27360＋1100＋5750＋2250＋340＋31400＋47100＝116300取120000 mL
21TrisHCl量：
m＝（330000＋14000＋46000＋2000＋2500）÷1000×001×1576＋1500÷1000×002×1576＝62646 g
22脲量：
m＝46000÷1000×4×6006＋14000÷1000×5×6006＝1525524g
23EDTA量：
m＝（46000＋14000）÷1000×0005×292248＝876744 g
24氯化钠量：
m＝2000÷1000×02×585＋1000÷1000×05×585＝5265 g
25硫酸铵量：
m＝2000÷1000×1×13214＋1500÷1000×03×13214＋2500÷1000×001×13214＋1500÷1000×02×13214＝3666885g
26β疏基乙醇量：
m＝13680÷1000×001×7813＝1069 g
pH40醋酸钠醋酸缓液中成分配：
pH＝pKa－lg([HAc] [Ac])
4＝476－lg([HAc] [Ac]）
Lg([HAc] [Ac])＝076
[HAc] [Ac]＝5621
5mmolL NaAcHAc中成分含量：
NaAc＝0005÷662×82＝00619 g
HAc＝0005÷562×60＝02547 g
27生产批重组粒细胞刺激子原液需水醋酸钠冰醋酸：
水醋酸钠＝00619×（120000＋2000＋2000＋1000）÷1000＝77375 g
冰醋酸＝02547×（120000＋2000＋2000＋1000）÷1000＝318375g
28注射水量：
V＝330000＋120000＋46000＋14000＋2000＋2000＋1500＋1500＋2500＋1000＝520500 mL5205 kg
表32缓液配置物料量
物料名称
g批
kga
TrisHCl
62646
4386
脲
1525524
106787
EDTA
876744
614
氯化钠
5265
369
硫酸铵
3666885
2569
β疏基乙醇
1069
075
水醋酸钠
77375
055
冰醋酸
318375
223
菌注射水
520500
36435
33蒸汽量
单发酵罐蒸汽混合加热蒸汽消耗量计算公式：
DGCt2t1ιt2⋅C1+η （式31）
式中：D——蒸汽消耗量（kg）
G——加热料液量（kg）
C——料液热[kJ(kg·°C)]
t2——加热结束时料液温度（℃）
t1——加热开始时料液温度（℃）
ι——饱蒸汽热焓27253kJkg03MPa
η——加热程中热损失增加蒸汽消耗量η取510
料液热
c037×418x＋4 18× (1－x)
x——固形物质量百分
批加热料液量（忽略种子液）：
G发酵液＝998＋（499＋998＋499＋499＋499＋17964＋499＋998＋
499＋499＋0196＋0599＋0399＋0499＋016）÷1000
＝10529kg
G补料液＝40+（1000＋2000＋1000＋1000＋1000）÷1000
＝46kg
固形物质量百分：
X发酵液＝（499＋998＋499＋499＋499＋17964＋499＋998＋499＋ 499＋0196＋0599＋0399＋0499＋016）÷1000÷10524
＝522
X补料液＝（1000＋2000＋1000＋1000＋1000）÷1000÷46
＝130
料液热容：
C发酵液＝037×418×522＋4 18× (1－522)＝404kJ(kg·℃)
C补料液＝037×418×130＋4 18× (1－130)＝415kJ(kg·℃)
选取10℃液料年中低温度t110℃η取10
加热料液蒸汽消耗量：
D发酵液＝10524×404×（121－10）×（1＋10）÷（27253－121×404）＝2335kg
D补料液＝46×415×（121－10）×（1＋10）÷（27253－121×415）＝1048 kg
发酵罐空罐灭菌时消耗蒸汽量：
D5VFρs （式32）
式中：VF——发酵罐全容积（m3）
ρS——发酵罐灭菌时罐压饱蒸汽密度（kgm3）
压力03MPa时水蒸汽密度ρS1627 kgm3发酵罐全容积02m3补料罐全容积005m3空罐灭菌消耗蒸汽量：
D`发酵罐＝5VFρS＝5×02×1627＝1627kg
D`补料罐＝5VFρS＝5×005×1627＝01627kg
般情况灭菌时保温消耗蒸汽量实罐灭菌发酵液加热时消耗蒸汽量30－50估算实罐灭菌保温消耗蒸汽量：
D``发酵罐＝50D发酵液＝1168kg
D``补料罐＝50D补料液＝524kg
总消耗蒸汽量：D总发酵罐＝D发酵液＋D`发酵罐＋D``发酵罐
＝2335＋1627＋116836657kg
D总补料罐＝D补料＋D`补料罐＋D``补料罐
＝1048＋01627＋524＝158827kg
D总＝D总发酵罐＋D总补料罐＝76258kg
表3 4蒸汽消耗量
工段
发酵罐kg批
补料罐kg批
总计kg批
ta
培养基加热
2335
1048
3383
75695
空罐灭菌
1627
01627
17897
13016
保温
1168
524
1692
37848
总计
36657
158827
525397
3677779
34生产水量
341培养基缓液配制水量
培养基配置需纯水量：
W＝105＋18＋43＝166 kg
配置缓液需注射水量：
V＝（330000＋120000＋46000＋14000＋2000＋2000＋1500＋1500＋2500＋1000）÷1000＝5205 kg
342发酵时水量
发酵温度37℃高室温需发酵程中热量变化进行计算确定发酵程中需加热冷
发酵程中热量衡算式：
ΣQ入＝ΣQ出＋ΣQ损 （式33）
ΣQ入＝Q1＋Q2＋Q3 （式34）
ΣQ出＝Q4＋Q5＋Q6＋Q7 （式35）
ΣQ损＝Q8 （式36）
式中：∑Q入——输入热量总（kJ）
∑Q出——输出热量总（kJ）
∑Q损——损失热量总（kJ）
Q1——物料带入热量（kJ）
Q2——加热剂（冷剂）传设备处理物料热量（kJ）
Q3——程热效应包括生物反应热搅拌热（kJ）
Q4——加热物料带出热量（kJ）
Q5——加热设备需热量（kJ）
Q6——加热物料需热量（kJ）
Q7——气体蒸汽带出热量
（式34）（式35）（式36）代入（式33）：
Q1＋Q2＋Q3＝Q4＋Q5＋Q6＋Q7＋Q8
（1）物料带入量Q1物料带出量Q4
Q＝∑mct （式37）
式中：m——物料质量（kg）
c——物料热容[kJ(kg·K)]
t——物料进入离开设备时温度（℃）
工艺中恒温37℃发酵t进＝t出37℃Q1＝Q4
（2）程热效应Q3
Q3＝QB＋QS （式38）
QS＝3600Pη（kJ） （式39）
式中：QB ——呼吸热（kJ）
P ——搅拌功率（kW）
η——搅拌程功热转化率通常92
（3）空气者蒸汽带出热量Q7
Q7＝∑m（ct＋r） （式310）
式中：m——离开设备气态物料量（kg）
c——液态物料0℃升温蒸发温度均热容[kJ(kg·K)]
t——气态物料温度（℃）
r——蒸发潜热（kJkg）
根生产验Q 7＝Qε＝02 Qb
根理分析发酵热计算公式：
Q发酵热＝Qb＋Qst－Qε （式311）
Qst＝3600ηPst
式中：Qb——生物合成热查肠杆菌生物合成热112298kJkg（葡萄糖）
Qst——机械搅拌热
η——搅拌功率热转换系数092
Pst——搅拌轴功率（kW）
Qε——排气发酵液水分汽化带出热焓Qε＝02 Qb
方便计算假设固形物均葡萄糖根前面计算知发酵液固形物含量522计算： Qb＝112298×522×160＝937913kJ
Qst＝3600×092×06＝19872kJ
Qε＝02×937913＝187583kJ
Q发酵热＝937913＋19872－187583＝55161kJ
Q发酵热＝Q3－Q7
（4）加热设备耗热量Q5 计算方便假设设备处温度致
Q5＝mc（t1－t2） （式312）
式中：m——设备总质量（kg）
c——设备材料热容[kJ(kg·K)]
t1t2——设备加热前均温度（℃）
恒温发酵假设设备温度发酵液致37℃Q5＝0
（5）设备环境散热Q8 方便计算假定设备壁面温度处处相：
Q8＝AαT（tw－ta）τ （式313）
A＝S侧＋2S底 （式314）
S侧＝πDH （式315）
S底＝πRR2＋h2 （式316）
式中：A——设备总表面积（m2）
αT——壁面空气传热系数[W(m2·℃)]然流αT＝8＋005 tw
tw——壁面温度（℃）
ta——环境空气温度（℃）
τ——操作程时间（h）
D——罐径（m）
H——圆柱高（m）
R——罐半径（m）
h——封头高（m）
设备选型知D＝5H＝10R＝25h＝15壁面温度37℃环境空气温度28℃操作时间24时算：
A＝314×5×10＋2×314×25252＋152＝202773
αT＝8＋005×37＝985
Q8＝202773×985×9×24＝431419835kJ
（6）加热物料需热量Q6
Q6＝mc（t2－t1） （式317）
式中：m——物料质量（kg）
c——物料热容[kJ(kg·K)]
t1t2——物料加热前温度（℃）
恒温发酵假设位置发酵液温度致37℃Q6＝0
综述Q1＝Q4Q发酵热＝Q3－Q7Q5＝0Q6＝0整理：
Q2＋Q发酵热＝Q8
Q2＝425903735 kJ
Q2正值发酵程中需加热现选热水做加热剂取进水温度80℃出水温度45℃发酵程中需热水量：
W＝Q2Cw(t2－t1) （式318）
W＝425903735418×（60－45）＝29112 kg
343注射水冷时水量
注射水80℃保温配置溶液时冷水冷室温28℃耗水量计算公式：
WGCT1T2Cwt2t1 （式319）
式中：W——冷水量（kg）
G——需冷物料量（k）g
C——冷物料热容[kJ(kg·°C)]
CW——水热容[418 kJ(kg·°C)]
T1T2——物料冷前温度分80℃28℃
t1t2——冷水初温终温分7℃20℃
注射水冷室温耗水量：
w5205×418×（80－28）418×（20－7）＝2082 kg
表35生产耗水量
工段
规格
kg批
ta
培养基配制
纯水
166
1162
缓液配制
菌水
5205
36435
发酵中保温
80℃热水
29112
203784
注射水冷
冷水
2082
145749
35工艺耗冷量
工艺耗冷量计算公式：
Q＝mc（t2－t1）τ （式320）
式中：Q——工艺耗冷量（kJh）
C——物料热容[kJ(kg·°C)]
t1t2——物料冷前温度（℃）
τ——冷操作程时间（h）
注射水80℃循环保温工艺求注射水2时冷28℃注射水冷耗冷量：
Q＝5205×418（80－28）2＝5656794(kJh)
冷水水28℃冷7℃2时完成水冷耗冷量：
Q＝2082×418（28－7）2＝9137898(kJh)
设备道散失冷量取该工艺耗冷量12非工艺耗冷量：
Q发酵＝12×(5656794＋9137898)＝1775363(kJh)
表36工艺耗冷量
工段
时耗冷量(kJh)
批次耗冷量kJ
年耗冷量kJ
菌水冷
5656794
11313588
7920×106
水冷
9137898
18275796
12793×106
非工艺耗冷量
1775363
3550726
2486×106
总计
16570055
3314011
23198×106
36菌空气
发酵罐消耗菌空气量：
V＝发酵罐体积×通气×装料系数
V＝02×13×08＝0208（m3h）
种子罐消耗菌空气量：
V＝002×13×08＝00208（m3h）
表37菌空气消耗量
设备
时气量（m3h）
生产批产品气量（m3批）
年气量（m3a）
种子罐
00208
0224
1568
发酵罐
0208
4992
34944
总计
02288
5216
36512
4设备选型
41种子培养间
种子操作间需完成种子活化种子液制备需二级生物安全柜进行接种操作选择苏州泰安BSC1000IIA2生物安全柜技术参数：
表41 BSC1000IIA2生物安全柜技术参数
技术参数
洁净等级
HEPA：ISO 5级（100级 Class 100）
ULPA：ISO 4级（10级 Class 10）
滤效率
HEPA：≥9999503µm
ULPA：≥99999012µm
降风速
035ms
流入风速
035ms
工作尺寸
970×600×620mm
外型尺寸
1200×790×2050mm
荧光灯规格数量
36×2
紫外灯规格数量
20×1
度
≥800
外级种子液制备需恒温震荡培养箱培养箱选华美生化HZQF100恒温振荡培养箱技术参数：
表42 HZQF100恒温振荡培养箱技术参数
技术参数
振荡频率
40280rpm
振幅
φ26mm
控温范围
460℃
功率
800W
外型尺寸
630×530×1300mm
二发酵罐接种量10需16L二级种子液φ80装料系数计算批需容量20L种子罐
选择北京满仓科技限公司生产20L搅拌通风锈钢发酵罐MCJSF20L技术参数：
表43 MCJSF20L搅拌通风锈钢发酵罐技术参数
技术参数
公称容积
20L
装液系数
80
筒体高度
1500mm
筒体直径
800mm
实际装液量
24L
搅拌轴转速
150900rpm
搅拌轴功率
025W
42发酵间
工艺求批发酵液160L装料系数φ80需发酵罐容量200L搅拌通风锈钢发酵罐
选择海百伦生物科技200L锈钢全动发酵罐技术参数：
表44 百伦200L锈钢全动发酵罐
技术参数
公称容积
200L
罐径
500mm
罐体高
1300mm
封头高
150mm
全容积
239L
搅拌轴转速
2001200rpm
搅拌轴功率
06kW
发酵程中需通热水确保发酵温度维持37℃选夹套加热部通80℃热水出水口温度45℃现计算需传热面积：
FQK·Δt （式41）
式中：F——传热面积（m2）
K——总传热系数夹套传热系数120180 kJ(m2·℃)间
△t——数均温差恒温传热时△t＝T－t
Q——传热总量kJ
F425903735120×35＝10141m2
加热夹套面积10141m2
43收获间
工艺求发酵液需进行离心收集菌体发酵液体积160L设备选择CARR powerfuge连续工业离心系统该系统全动化流程拥式离心机高速碟片式离心机批量动化优点夹套控温系统外表面电抛光锈钢高压灭菌符合GMP求技术参数：
表45 CARR powerfuge连续工业离心系统技术参数
技术参数
离心力
20000G
高转速
15325rpm
流速范围
601700Lh
沉淀容量
1L32L
夹套温度控制
低18℃
级联放
量高1700升时
菌体收集需进行破菌处理设备选择AST流量细胞破碎机该设备破碎率高次破碎肠杆菌破碎率95酵母菌破碎率90设备压力达1800ar27000psi超高压进料阀特殊设计需进行排气操作直接进料拥位冷系统吸收细胞破碎时产生热量保护胞物质活性受高温影响技术参数：
表46 AST流量细胞破碎机技术参数
技术参数
产品程粘度
< 2000 cPs
进料颗粒尺寸
< 100微米
产量
1540Lh
批次处理量
200ml 200L
温度控制
低20度
均质级数
两级
均质压力
1500bar
功率
30kW
续菌体破菌包涵体获洗涤包涵体裂解超滤离心操作工段继续CARR powerfuge连续工业离心系统中包涵体裂解液超滤工段离心需低温进行
44粗制间
包涵体变性离心清液需045μm滤器滤较杂质免损坏超滤装置滤膜根滤芯材质特点选聚醚砜（PES）滤芯该材质滤芯孔径均匀孔隙率高高流率低溶出物低蛋白质吸附属亲水性滤膜医药工业广泛[24]工艺求需滤液体体积82L1时滤完选取海信步公司型号SHXB1L10精密滤芯式滤器具体参数：
表47 SHXB1L10精密滤芯式滤器技术参数
技术参数
滤量
005th
压力
0106MPa
滤精度
045μm
效滤面积
≤065m 2
滤芯材质
聚醚砜
滤芯长度
013m
滤机蕊数
1
进出径
25mm
设备尺寸(L×W×H)
220×100×600mm
超滤复性选Cogent M1半动超滤系统该系统够进行终点控制恒截留体积控制数记录操作程中进料压力（80psi）压力波动（≤3psi）置10L储液罐满足生产求该系统装配15pellicon2 01m2膜包pellicon3 011m2膜包进行蛋白质肽超滤蛋白质肽洗滤细胞裂解液微滤
膜包选择配套Biomax10P3（pellicon3 011m2 10kDa 聚醚砜膜）该膜包适应较高操作压力温度苛刻清洗求重组蛋白超滤典型应湍流网选择适合重组蛋白超滤粗糙湍流网CScreen膜包技术参数：
表48 Biomax10P3膜包参数
技术参数
高度
23 cm
宽度
56 cm
滤面积
011 m2
保持体积
365mL
长度
206cm
处理量
100mL10L
推荐进料流量
46 Lminm²
材质
聚醚砜
截留分子量
10kDa
浓缩流量
50mlmin
透析流量
80mlmin
工艺求需3时82L清稀释液进行2倍体积透析3倍体积浓缩计算：
透析通量：80×60÷011÷1000＝436 LMH
浓缩通量：50×60÷011÷1000＝273 LMH
透析透量：2×82＝164 L
浓缩透量：164－164÷3＝109 L
透析需面积：164÷436÷3＝013 m2
浓缩需面积：109÷273÷3＝013 m2
透析浓缩工艺需面积026 m2产品批次间差异需配置1215安全系数处选取安全系数126需面积033 m2需3膜包
超滤液体离心收集清液进行045μm滤设备述滤设备
45精制间
层析缓液需045μm滤操作选滤器粗制间相海信步公司型号SHXB1L10045μm精密滤芯式滤器聚醚砜（PES）滤芯
层析ÄKTA pilot 600R层析系统该系统符合GMP工艺求快速识偏差涵盖种规格层析柱该系统较宽流速压力范围兼容径范围26mm200mm层析柱UNICORN软件动装柱快速实现稳固柱床线检测针时层析柱柱体积(CVh)工艺流速UV信号标准化进行编程技术参数：
表49 ÄKTA pilot 600R层析系统技术参数
技术参数
系统泵
两
系统占面积
575×440mm
控制系统
UNICORN软件启开放式通信台（OPC）
环境温度范围
4℃35℃
储存温度
25℃60℃
流速范围
12000mLmin
粘度
0710cP
连续梯度流量范围
4600mLmin
温度传感器
2℃50℃（±2℃）
压力传感器
00200bar（±2001bar）
pH传感器
212pH（±015pH）
电导传感器
01300mScm（±302mScm）
紫外吸光度
06AU（02AU范围线性度2）
紫外波长
190nm700nm（±2nm）
根工艺计算选武汉汇研生物工业层析柱HK1650EK201000润联科技RL7530层析柱技术参数：
表410 层析柱技术参数
产品名称
规格（径mm高度mm）
横截面积cm2
装填体积
装填高度mm
RL7530
75300
441
022088L
50200
HK16100
161000
2
164194ml
820970
EK201000
2001000
314
1572355L
500700
装柱高度：
第次离子交换层析：0 55 L×104÷441cm2＝125mm
疏水层析：075 L×104÷441cm2＝170mm
第二次离子交换层析：017 L×104 cm2÷2＝850mm
分子筛层析：157 L×104÷314 cm2＝500mm
超滤脱盐继续选Cogent M1半动超滤系统膜包选择粗制间超滤系统相工艺求需2时完成225L洗脱峰脱盐根验需3倍体积缓液计算：
透析通量：80×60÷011÷1000＝436 LMH
透析透量：3×225＝675L
透析需面积：675÷436÷2＝0077 m2
安全系数取126实际需膜面积：0077×126＝0097＜011 m2
需1张Biomax10P3膜包满足工艺需求
选取海信步公司型号SHXB1L10精密滤芯式滤器滤芯聚醚砜材质具体参数：
表411SHXB1L10精密滤芯式滤器
技术参数
滤量
004th
压力
0106mpa
滤精度
022μm
效滤面积
≤065m2
滤芯材质
聚醚砜
滤芯长度
015m
滤机蕊数
1
进出径
25mm
设备尺寸(L×W×H)
220×100×600mm
层析操作需低温环境进行生产中常层析柜提供合适低温环境工艺选择福意联公司型号FYLYS430L型层析冷柜技术参数：
表412 FYLYS430L型层析冷柜技术参数
技术参数
制冷剂量
R600a(55g)
效容积
430L
气候类型
85N
温控范围
248℃
温差范围
±2℃
箱体尺寸
(W×D×H)：595×680×1805mm
46灭菌间
需灭菌溶液运输罐玻璃仪器等灭菌器进行灭菌方式已灭菌物品未灭菌物品混杂现选海环宇型号MQS15双扉湿热灭菌柜湖北恒丰型号JGM15BS干热灭菌柜技术参数：
表413 MQS15灭菌柜技术参数
技术参数
容量m3
15
尺寸mm
1900×750×1050
外尺寸mm
2190×1450×1900
蒸汽消耗量kg
60
功率kw
4
工作温度℃
115132
压力MPa
011022MPa
灭菌效果
灭菌产品污染概率百万分
表414JGM15BS干热灭菌柜技术参数
技术参数
容量m3
15
尺寸mm
1900×1000×790
外尺寸mm
2200×1900×1550
温度（高）
热源300℃灭菌250℃干燥100℃
温度均匀度
≤±0025Tmax
温度波动
±1℃
47结
表413 重组粒细胞刺激子原液车间仪器览
车间
设备
数量
种子培养间
BSC1000IIA2生物安全柜
1
HZQF100恒温振荡培养箱
1
MCJSF20L搅拌通风锈钢发酵罐
1
发酵间
百伦200L锈钢全动发酵罐
1
夹套F10141m2
1
收获间
CARR powerfuge连续工业离心系统
1
AST流量细胞破碎机
1
粗制间
SHXB1L10045μm滤器
1
Cogent M1半动超滤系统
1
Biomax10P3膜包
3
精制间
SHXB1L10045μm滤器
1
ÄKTA pilot 600R层析系统
3
RL7530层析柱
2
HK1650层析柱
1
EK201000层析柱
1
Cogent M1半动超滤系统
1
Biomax10P3膜包
1
11SHXB1L10022μm滤器
1
灭菌间
MQS15双扉湿热灭菌柜
1
JGM15BS干热灭菌柜
1
5车间设计
51车间布置
生物制品生产中物料特殊性牛肉膏培养基发酵液等含量营养成分微生物良培养基容易受污染生物制品车间设计需严格GMP规范医药工业洁净厂房设计规范做防治污染交叉污染做布置合理利生产操作开展
重组粒细胞刺激子原液生产车间中生产操作工序种子扩培养工程发酵菌体收获粗纯精纯图51示满足生产工艺求GMP规定重组粒细胞刺激子原液车间设计中种子培养间安排里流物流出入口远方然次发酵车间粗制间精制间种布置方式洁净等级高房间布置车间部洁净等级低车间外围做级净化区域成阶梯级保护[25]外满足菌求单独设立灭菌车间生产中需灭菌仪器等进行灭菌操作灭菌车间设车间外围方便进出物料品时灭菌降低交叉污染防止空调系统交叉污染接种发酵纯化空调系统
图52示流出入口需设置换衣间二更进入C级洁净走廊进入操作岗位物流通外清气锁进入洁净走廊通车间气闸进入相应车间
图53示GMP规定生物制品生产操作应符合相应洁净等级[26]种子细胞接种敞口环境进行需超净工作台背景环境求高[27]种子培养间中准备间摆放超净台属C级背景局部A级洁净区域C+A级属A级[28]需更换洁净工作服求更高菌工作服种子培养间进出口设置更衣室缓间重组细胞发酵密闭系统中进行污染概率车间样安排C级洁净区域
图51车间布置图
图52 流物流图
图53 车间洁净等级区域图
表51 洁净区标准
级
空气悬浮粒子
A级
B级
C级
D级
静态
≥05μm
3520
3520
352000
3520000
≥5μm
20
29
2900
29000
动态
≥05μm
3520
352000
3520000
29000
≥5μm
20
2900
－
－
微生物检测动态标准
浮游菌CFU·m3
＜1
10
100
200
沉降菌（φ90mm）CFU·（4h）1
＜1
5
50
100
表面微生物
接触碟（φ55mm）CFU
＜1
5
25
50
5指手套CFU
＜1
5
－
－
52车间压差分布
生产活动中气锁室作阻隔外界污染气流控制压差般作缓间设置洁净室出入口压力气流方三种气锁室类型分正压气锁室负压气锁室梯度式气锁室梯度气锁室日常生产中常见洁净区间隔离正负压气锁室梯度气锁室阻止含产品高级空气扩散正负压气锁室分隔洁净等级区域外限度阻止含产品空气高级区域低级区域扩散根三种气锁室特点种子培养间洁净等级局部A级走廊洁净等级C级处采梯度气锁室隔离两生产区域保证工艺车间洁净级分隔区域气流避免操作间中含产品空气外扩散洁净走廊工艺车间间采正压气锁室时洁净走廊车间外皆正压满足生产洁净求
洁净厂房设计规范GB500732013中规定洁净区周围空间必须维持定压差等级洁净室间压差宜5Pa洁净区非洁净区间压差应5Pa洁净区室外压差应10Pa[29]根规定物料出入口外清气锁分外界差10Pa20Pa气锁洁净走廊直接差5Pa洁净走廊25Pa种子培养间梯度气锁洁净走廊区分求种子培养间更衣室35Pa缓间40Pa培养间部45Pa物料进出口35Pa
图54车间压差分布级气流方图
6总结
设计重组粒细胞刺激子原液车间设计重组粒细胞刺激子原液生产工艺研究终确定级种子液→二级种子液→发酵→菌体获破菌→包涵体获→包涵体变性→包涵体超滤复性→第次离子交换层析→疏水层析→超滤脱盐→第二次离子交换层析→分子筛层析生产工艺路线条路线山东科兴生物制药限公司专利发明路线该公司重组粒细胞刺激子注射液白喜特售工艺路线实际生产应
根工艺路线进行物料衡算基础完成设备选型根工艺条件选定生物安全柜恒温震荡培养箱连续离心系统细胞破碎机精密滤器超滤系统层析系统灭菌柜等设备需培养基体积选出20L种子罐200L发酵罐发酵程中热量变化确定夹套换热面积F10141m2工艺条件设备参数确定超滤需膜包材质聚醚砜需数量根层析时蛋白质含量结合填料载量确定需填料体积进选定需层析柱
车间设计工艺需条件基础严格洁净厂房设计规范新版GMP等国家标准进行设计力求做防止污染交叉污染工艺需划分种子培养间发酵间收获间粗制间精制间灭菌间根生产操作确定洁净背景C级接种操作特殊性超净工作台创造C级背景局部A级压差维持菌车间洁净手段效防止污染空气低级高级扩散根规定确定车间更衣室压差5Pa20Pa物流通道外清气锁分10Pa20Pa确定洁净区走廊压差25Pa操作房间15Pa种子间特殊性该房间压差高45Pa房间门口设更衣缓等设置
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[29] GB500732013洁净厂房设计规范[S]
致谢
毕业设计王莹老师悉心指导完成选题具体写作程老师渊博专业知识严谨治学态度提供非常帮助整写作程中节假日深夜老师提出问题老师会时详回复帮助开拓思路正老师认真负责辞辛苦指导毕业设计利完成
时感谢学期间指导老师做毕业设计时重新捡起已模糊知识想起老师传道受业解惑样子正老师认真教学做毕业设计时少走弯路
感谢学做毕设时互相交流启发提出建设性意见感谢舍友然疫情原屋檐然会互相帮助互相答疑互相分享
百忙中抽时间文进行审阅评议参文答辩位老师表示诚挚谢意
附录
附录 重组粒细胞刺激子原液车间设计图
附录二 重组粒细胞刺激子原液车间流物流图
附录三 重组粒细胞刺激子原液车间气压气流图
附录四 重组粒细胞刺激子原液车间洁净区域图
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