微生物学通报 Nov 20 2016 43(11) 2521−2529
Microbiology China httpjournalsimaccnwswxtbcn
tongbao@imaccn DOI 1013344jmicrobiolchina151066
Foundation item Natural Science Foundation of Fujian Province (No 2015J01614) Marine Economy Innovation
Development Regional Demonstration Foundation of Xiamen (No13PZP002SF24)
*Corresponding author Tel 865926181487 Email chyizhou@163com
Received December 27 2015 Accepted May 23 2016 Published online (wwwcnkinet) May 24 2016
基金项目：福建省然科学基金项目(No 2015J01614)厦门市海洋济创新发展区域示范项目(No13PZP002SF24)
*通讯作者：Tel：865926181487Email：chyizhou@163com
收稿日期：20151227接受日期：20160523优先数字出版日期(wwwcnkinet)：20160524
生物实验室
四重 PCR 检测副溶血性弧菌毒力基方法建立
林佳琪 1 苏国成 12 黄建炜 3 陈泽辉 3 周常义 12*
(1 集美学食品生物工程学院 福建 厦门 361021)
(2 厦门市食品科技研发检测中心 福建 厦门 361021)
(3 厦门市疾病预防控制中心 福建 厦门 361021)
摘 ：目建立时检测副溶血性弧菌 toxRtdhtrhtlh 基四重 PCR 快速检测方
法方法分副溶血性弧菌 toxRtdhtrhtlh 4 基靶基设计 4 特异性引
物 4 引物浓度退火温度进行优化获佳引物例扩增条件建立快速检测致病
性副溶血性弧菌四重 PCR 体系通特异性验证灵敏度验证模拟样品检测进行方法
确认结果四重 PCR 体系扩增条带预期相符 115 bp (toxR)244 bp (tdh)418 bp (trh)
759 bp (tlh) 4 目条带 74 株副溶血性弧菌 37 株非目标菌测试结果表明建立
方法良特异性该方法模板 DNA 检测灵敏度 50 μgL纯培养物检测灵敏度
67×103 CFUmL副溶血性弧菌含量 136 CFUg 工模拟样品增菌 6 h toxRtlhtdh
trh 4 基时检出结该方法实现时检测携带 toxRtdhtrhtlh 4 种基
副溶血性弧菌开展致病性副溶血性弧菌检测研究具定现实意义
关键词：副溶血性弧菌四重 PCRtoxR 基tdh 基trh 基tlh 基
Establishment of a quadruple PCR method for detecting pathogenic
genes in Vibrio parahaemolyticus
LIN JiaQi1 SU GuoCheng12 HUANG JianWei3 CHEN ZeHui3 ZHOU ChangYi12*
(1 College of Food and Bioengineering Jimei University Xiamen Fujian 361021 China)
(2 Xiamen Food Research and Inspection Centre Xiamen Fujian 361021 China)
(3 Xiamen Centre for Disease Control and Prevention Xiamen Fujian 361021 China)
Abstract [Objective] This study aimed at establishment of a rapid specific quadruple PCR assay for
detecting Vibrio parahaemolyticus and its virulence genes [Methods] Four pairs of primers were
designed based on toxR tdh trh and tlh genes sequences of V parahaemolyticus Optimized the
concentration of four pairs of primers and the annealing temperature to obtain the best ratio of primer
and amplification conditions the rapid quadruple PCR detection of pathogenic V parahaemolyticus
was established The specificity and sensitivity of the quadruple PCR method were also evaluated 2522 微生物学通报 Microbiol China 2016 Vol43 No11
Tel 01064807511 Email tongbao@imaccn httpjournalsimaccnwswxtbcn
[Results] The expected sizes of amplification bands were 115 bp 244 bp 418 bp and 759 bp for
toxR tdh trh and tlh respectively The highly specificity of this method was evaluated by using 74 V
parahaemolyticus strains and 37 nontargeted bacteria The detection limits of the multiplex PCR for
DNA was 50 μgL Detection sensitivity of V parahaemolyticus in pure culture condition was
67×103 CFUmL Four targeted fragments were detected in artificially contaminated seafood with
136 CFUg V parahaemolyticus after 6 h enrichment [Conclusion] The multiplexPCR method can
simultaneously detect V parahaemolyticus with toxR tdh trh andor tlh It is of certain significance
to carry out the detection of pathogenic V parahaemolyticus
Keywords Vibrio parahaemolyticus Quadruple PCR toxR gene tdh gene trh gene tlh gene
副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticusVp)
海洋环境中然存种嗜盐革兰氏阴性细
菌够盐度温度环境中生存[12]
广泛存海口江口浮游生物鱼类虾
类贝类等水产品中[34]海国家普遍存食
源性致病菌[59]副溶血性弧菌通消费者
摄入生未煮熟海产品引起发热腹痛腹泻
恶心呕吐等急性胃肠炎症状严重时甚导致昏迷
休克死亡然界中存副溶血性弧菌部分
非致病仅 03−50携带致病子[1011]
国 2014 年 6 月 1 日开始采新版 GB
478972013该标准中检验程序然需采传
统培养法进行增菌分离培养生化鉴定神奈川
试验血清学试验整检测程存工作量
检测周期长工作繁琐操作判定容易成
高等缺陷行业标准 SNT 24242010 SNT
26412010SNT 25642010 SNT 275452011
采分子生物学技术进行副溶血性弧菌检测
判断携带致病基类型
重 PCR 技术(Multiplex PCR)常规 PCR
基础发展起种高效快速分子生物学技
术反应体系中加入引物够
时进行扩增目片段简化工
作流程降低实验成快速效达
量样分析鉴定研究前期床致病副
溶血性弧菌研究基础选取副溶血性弧菌
toxRtdhtrhtlh 基设计 4 特异性引物
通优化引物浓度例退火温度等条件建立
PCR 反应体系中时扩增 toxRtdhtrh
tlh 4 种目标基四重 PCR 方法
1 材料方法
11 实验菌株
32 株致病性副溶血性弧菌厦门市疾病预防
控制中心提供均食物中毒分离株菌株编号
VP1−VP8VP42VP60VP64VP67−VP71VP75
VP87−VP93 VP170 VP171 VP183−VP187
VP201102941 株副溶血性弧菌菌株实验室
食品环境中分离保存菌株菌株编号
VPS201306 VPS201307 VPZ1432−VPZ1444
VPZ1451−VPZ1465 VPZ1539 VPZ1550
VPZ1555VPH1602−VPH16091 株标准菌株副溶
血性弧菌(ATCC 17802)厦门市食品科技研发检
测中心提供
22 株非副溶血性弧菌分溶藻弧菌河弧
菌创伤弧菌拟态弧菌弗氏弧菌哈维弧菌
非 O1 型霍乱弧菌鳗弧菌嗜水气单胞菌发光
杆菌嗜盐单胞菌实验室保存菌株
15 株非副溶血性弧菌标准菌株分金黄色
葡萄球菌(ATCC 25923)肠埃希氏菌(ATCC
25922)肠埃希氏菌 O157：H7 (NCTC 12900)
乙型溶血性链球菌(ATCC 21059)产气肠杆菌
(ATCC 13048) 甲型副伤寒沙门菌
(CMCC(B)50093) 乙型副伤寒氏沙门菌
(CMCC(B)50094)鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 14028)
肠结肠炎耶尔森氏菌[CMCC(B)52204]单增李斯
特菌(ATCC 19115)伊氏李斯特菌(STCC 19119)
英诺克李斯特菌(ATCC 33090)阪崎肠杆菌(ATCC
29544)粪链球菌(ATCC 29212)宋志贺氏菌林佳琪等 四重 PCR 检测副溶血性弧菌毒力基方法建立 2523
Tel 01064807511 Email tongbao@imaccn httpjournalsimaccnwswxtbcn
[CMCC(B) 51592]厦门市食品科技研发检测中
心提供
12 试剂仪器
DNA 基组提取试剂盒DNA Marker购
天根生化科技(北京)限公司Multiplex PCR
Assay Kit Ver2购宝生物工程(连)限公司
琼脂糖 Biowest Agarose G10购西班牙 Biowest
公司GelStain 购北京全式金生物技术限公司
LifeEco 基扩增仪BIOER 公司微量紫外
分光光度计 Q5000Quawell 公司凝胶成仪
GenoSens1860海勤翔科学仪器限公司掌
离心机 D1008ESCILOGEX 公司水电泳
槽Power B 基础型电泳电源北京凯元信瑞仪器
限公司
13 培养基
弧菌培养基 3 NaClAPWTCBS参
GB478972013 配制菌培养基常规培养
基均购广东环凯微生物科技限公司
14 引物设计合成
利分子信息学方法根 NCBI GenBank
中已发表副溶血性弧菌跨膜调控蛋白 R 基
(Transmembrane regulatory protein RtoxR)耐热直
接溶血素毒素基(Thermostable direct hemolysin
tdh) 耐热直接溶血素毒素相关毒素基
(Thermostable direct haemolysinrelated haemolysin
trh) 耐热溶血毒素基(Thermolabile
hemolysintlh)序列采 DNAMAN 软件中
Alignment 进行序列确定序列保守片
段利 Primer Premier 50 设计引物利
MFEprimer20 线软件进行引物间二聚体验证
利 BLAST 进行引物特异性验证引物海英
潍捷基公司合成(表 1)
15 基组 DNA 制备
基组 DNA 提取试剂盒进行副溶血性弧
菌 DNA 提取测量 DNA 含量 TE 溶液稀释
50 mgL提取基组 DNA 置−20 °C
保存
16 纯菌悬液 DNA 模板提取
菌条件取副溶血性弧菌单菌落接种 3
表 1 引物序列扩增产物
Table 1 Primer sequence and amplicon size
Target
gene
Primer
name
Primer sequence
(5′→3′)
Amplicon
size (bp)
toxR vptoxR2f GTTCCAAAACGAGGCTATCA 115
vptoxR2r CAGAGGCGTCAATGTAATC
AG
tdh vptdh1f CTTCCATCTGTCCCTTTTCC 244
vptdh1r CCGCTGCCATTGTATAGTCT
trh vptrh3f TTTCCTTCTCCTGGTTCCG 418
vptrh3r TATGTCCATTGCCGCTCT
tlh vptlh4f CGAAGAGCCAACCTTATCA 759
vptlh4r TCCGTCAAACGAATCAGTG
NaClAPW 中37 °C200 rmin 条件培养 6 h
菌生理盐水菌液进行 10 倍梯度稀释选择
合适稀释度菌悬液 TCBS 板计数稀
释度菌悬液取 1 mL12 000 rmin 离心 5 min
清菌生理盐水重悬 110 原体积
100 °C 沸水水浴 10 min细菌细胞裂解然立
放入 4 °C 冷 5 min12 000 rmin 离心 3 min
取清备
17 四重 PCR 体系建立
通单重 PCR 体系退火温度优化
重 PCR 体系中引物浓度例退火温度优
化反应体系(50 μL PCR 体系)包括：2×Multiplex
PCR Buffer (Mg2+dNTP plus) 25 μLMultiplex PCR
Enzyme Mix 03 μL模板 5 μLvptrh3f3r
vptdh1f1rvptoxR2f2rvptlh4f4r 2 μL 菌
ddH2O 补足 50 μL中 4 游引物浓度
例通参数优化确定 trhtdhtoxRtlh
序次进行二重三重四重组合引物浓度分
：trh 引物终浓度 04 μmolLtdh 引物终浓度 02
010067005004003 μmolLtoxR 引物终
浓度 02016012008006004 μmolLtlh
引物终浓度 02016012008006004 μmolL
PCR 反应条件：94 °C 1 min94 °C 30 s46 °C
45 s72 °C 1 min35 循环72 °C 10 min4 °C
保存取 8 μL 扩增产物 15琼脂糖凝胶进2524 微生物学通报 Microbiol China 2016 Vol43 No11
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行电泳凝胶成仪进行观察拍
18 四重 PCR 体系灵敏度试验
181 基组 DNA 灵敏度检测： 15 获副溶
血性弧菌基组 DNA 溶液菌核酸水
DNA 溶液稀释 50×104 50×103 50×102
50×10150×10050×10−1 μgL稀释 DNA
溶液作模板进行四重 PCR 体系灵敏度检测
182 纯培养菌液灵敏度检测： 16 获纯副溶
血性弧菌稀释度菌悬液 DNA 模板菌悬
液进行板计数时 DNA 模板加入四重 PCR
体系根板计数结果应四重 PCR 检测结
果计算方法细菌灵敏度
19 四重 PCR 体系特异性试验
副溶血性弧菌非副溶血性弧菌菌株
增菌提取 DNA取 1 μL 进行四重 PCR 检测
110 工污染样品检测
取 GB 478972013 方法验证副溶血性
弧菌牡蛎虾鱿鱼带鱼等样品菌条件
称取 25 g 均质杯中加入 225 mL 3
NaClAPW 培养液均质器进行均质制匀浆
添加 136 CFUg 溶血性弧菌悬液时菌生
理盐水做空白添加副溶血性弧菌样品
基质制备模拟样品置 36 °C200 rmin 培
养 6 h 取 1 mL1 000 rmin 离心 10 min 取
清10 000 rmin 离心 10 min 清生理盐水
洗涤 2 遍提取菌液 DNA 进行四重 PCR 检测
2 结果
21 四重体系中单重PCR四重PCR实验
结果
目片段进行单重梯度 PCR 115244
418759 bp 处分扩增出 toxRtdhtrhtlh 基
相应目条带优化四重 PCR 体系引物
浓度退火温度终确定引物加入终
浓度：vptrh3f3r 终浓度 04 μmolLvptdh1f1r 终浓
度 004 μmolLvptoxR2f2r 终浓度 008 μmolL
vptlh4f4r 终浓度 004 μmolL (图 1)退火温度
45−574 °C 成功扩增出清晰目条带(图 2)
四重 PCR 体系 4 扩增条带单重 PCR
体系 4 扩增条带致
图 1 重 PCR 引物浓度优化结果
Figure 1 Optimization results of different primers concentrations for multiple PCR
注：A：trhtdh 基双重 PCR 引物优化结果(M：D2000 DNA marker1−6：trh 引物浓度均 04 μmolLtdh 引物浓度次 02
010067005004003 μmolL)B：trhtdhtoxR 基三重 PCR 引物浓度优化结果(M：D2000 DNA marker1−6：trh 引
物浓度均 04 μmolLtdh 引物浓度均 004 μmolLtoxR 引物浓度次 02016012008006004 μmolL)C：trh
tdhtoxRtlh 基四重 PCR 引物浓度优化结果(M：D2000 DNA marker1−6：trh 引物浓度均 04 μmolLtdh 引物浓度均
004 μmolLtoxR 引物浓度均 008 μmolLtlh 引物浓度次 02016012008006004 μmolL)D：引物进行单重
PCR 四重 PCR 扩增结果(M：D2000 DNA marker1：toxR 单重 PCR 结果2：tdh 单重 PCR 结果3：trh 单重 PCR 结果4：
tlh 单重 PCR 结果5：toxRtdhtrhtlh 四重 PCR 结果6：空白)
Note A Optimization results of primers concentration for duplex PCR (M D2000 DNA marker 1−6 trh (04 μmolL) and the
concentrations of tdh are 02010067005004003 μmolL) B Optimization results of primers concentration for triplex PCR (M
D2000 DNA marker 1−6 trh (04 μmolL) tdh (004 μmolL) and the concentrations of toxR are 02 016 012 008 006 004 μmolL) C
Optimization results of primers concentration for quadruple PCR (M D2000 DNA marker 1−6 trh (04 μmolL) tdh (004 μmolL) toxR
(008 μmolL) and the concentrations of tlh are 02 016 012 008 006 μmolL 004 μmolL) D Products of single PCR and
multiplexPCR (M D2000 DNA marker 1 Single PCR product of toxR 2 Single PCR product of tdh 3 Single PCR product of trh 4
Single PCR product of tlh 5 MultiplexPCR products of toxR tdh trh tlh 6 Blank control)
Enterobacter sakazakii Streptococcus faecalis Shigella sonnei + Positive – Negative
Salmonella paratyphi B Salmonella typhimurium Yersinia enterocolitica Listeria monocytogenes Listeria ivanovii Listeria innocua
H7 beta hemolytic streptococcus Enterobacter aerogenes Salmonella paratyphi A׃aureus Escherichia coli Escherichia coli O157
Vibrio harveyi nonO1 Vibrio cholerae Vibrio anguillarum Aeromonas hydrophila Photorhabdus spp Halomonas sp Staphylococcus
Note * NonVibrio parahaemolyticus including Vibrio alginolyticus Vibrio fluvialis Vibrio vulnificus Vibrio mimicus Vibrio furnissii
斯特菌阪崎肠杆菌粪链球菌宋志贺氏菌 +：阳性–：阴性
甲型副伤寒沙门氏菌乙型副伤寒沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌肠结肠炎耶尔森氏菌单增李斯特菌伊氏李斯特菌英诺克李
H7乙型溶血性链球菌产气肠杆菌׃水气单胞菌发光杆菌嗜盐单胞菌金黄色葡萄球菌肠埃希氏菌肠埃希氏菌 O157
注：*：非副溶血性弧菌包括：溶藻弧菌河弧菌创伤弧菌拟态弧菌弗氏弧菌哈维弧菌非 O1 型霍乱弧菌鳗弧菌嗜
NonVibrio parahaemolyticus* – – – –
Vibrio parahaemolyticus No Z1433 + – – –
+ – – +
H1603 H1605−H1609 Z1451−Z1465
Vibrio parahaemolyticus No Z1432 Z1434 Z1435 Z1437−Z1439 Z1441−Z1444 H1602
Vibrio parahaemolyticus No 186 187 S201306 S201307 ATCC 17802 + – + +
Vibrio parahaemolyticus No 87−93 64 170 171 Z1555 Z1436 Z1440 + + + +
Vibrio parahaemolyticus No 1−8 42 60 67−71 75 183−185 2011029 Z1539 Z1550 H1604 + + – +
toxR tdh trh tlh
Target gene
Bacterial specie and strain ID
Table 2 The specificity results of multiple PCR
表 2 四重 PCR 体系特异性试验结果
模板 DNA 浓度检测限 50 μgL
toxR 携带 tdhtrhtlh 致病子副溶血性弧菌
扩增产物(图 3)时检测副溶血性弧菌
明显扩增出模板 DNA 50 μgL 时未见
模板 DNA 稀释 50 μgL 时4 条目条带
231 基组 DNA 灵敏度试验结果：试验测定
23 四重 PCR 体系灵敏度试验结果
血性弧菌致病子
性基tdhtrhtlh 3 引物分鉴副溶
高度特异性toxR 作副溶血性弧菌种特异
条带研究证明该四重 PCR 体系中 4 引物具
血性弧菌均扩增出相应 toxRtdhtrhtlh
标 FDA 2004 标准[12]检测结果致非副溶
toxR扩增结果实验室荧光定量 PCR 验证国
VPZ1451–VPZ1465 携带 toxRtlhVPZ1433 携带
VPH1603 VPH1605−VPH1609
VPZ1437−PZ1439VPZ1441−VPZ1444VPH1602
trh tlh VPZ1432 VPZ1434 VPZ1435
VPS201306VPS201307 ATCC 17802 携带 toxR
Z1440 携带 toxRtdhtrhtlhVP67−71
VP87–93VP64VP170VP171PZ1555Z1436
VPZ1539VPZ1550 VPH1604 携带 toxtdhtlh
(表 2)VP1−22VP42VP60VP75VP2011029
非副溶血性弧菌进行重 PCR 扩增试验结果显示
特异性扩增致病性副溶血性弧菌
测序结果表明建立 4 基目片段均
扩增产物送英潍捷基(海)贸易限公司测序
4 基单重 PCR 重 PCR 产物电泳
22 四重 PCR 体系特异性试验结果
535 °C 5 574 °C 6 596 °C
Note M D2000 DNA marker 1 450 °C 2 460 °C 3 489 °C 4
for quadruple PCR
Figure 2 Optimization results of annealing temperature
图 2 四重 PCR 退火温度优化结果
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林佳琪等 四重 PCR 检测副溶血性弧菌毒力基方法建立 25252526 微生物学通报 Microbiol China 2016 Vol43 No11
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图 3 四重 PCR 基组 DNA 灵敏度试验结果
Figure 3 The sensitivity results of genome DNA template
concentration for quadruple PCR
注：M：D2000 DNA marker1−6：DNA 模板浓度次 50×104
50×10350×10250×10150×10050×10−1 μgL
Note M D2000 DNA marker 1−6 The concentrations of genome
DNA are 50×104 50×103 50×102 50×101 50×100
50×10−1 μgL
232 纯培养菌液灵敏度试验结果：副溶血性弧
菌培养液富集培养菌生理盐水
10 倍梯度稀释分进行菌落计数重 PCR 检
测检测结果表明副溶血性弧菌模板含量
67×103 CFUmL 时4 目片段够时检出
(图4)副溶血性弧菌模板含量67×102 CFUmL
时 tdhtrh 2目片段检出该方
法检出灵敏度 67×103 CFUmL
图 4 四重 PCR 副溶血性弧菌纯培养液灵敏度试验结果
Figure 4 The sensitivity results of pure culture for
quadruple PCR
注：M：D2000 DNA marker1−7：菌液浓度次 67×106
67×10567×10467×10367×10267×10167×100 CFUmL
Note M D2000 DNA marker 1−7 The cell concentrations of
pure culture are 67×106 67×105 67×104 67×103 67×102
67×101 67×100 CFUmL
24 模拟样品检测基携带判定
通副溶血性弧菌水产品样品中加入
副溶血性弧菌菌液液体培养基富集培养取
适量样品进行重 PCR 反应检测时做空白
副溶血性弧菌含量 136 CFUg 模拟样品
富集 6 h toxRtdhtrhtlh 4 目条带均成
功扩增出条带清晰方法判定样品
否含副溶血性弧菌时检测携带 tdhtrh
tlh 致病基情况
3 讨
31 关种特异基毒力基讨
tdhtrhtlh 基毒力调控基 toxR 致病
性副溶血性弧菌研究中重毒力子[1323]tdh
基 trh 基分表达耐热直接溶血素毒素耐
热直接溶血素毒素相关毒素tlh 基表达耐热溶
血毒素种非典型磷脂酶床分离株
环境分离株数副溶血弧菌均携带 tlh 基
床分离株携带 tdh 基环境分离株
水产品分离株极少携带 tdh 基[23]床株环
境株检出率 trh 基较低 tdh 基存
情况[24]目前鉴副溶血性弧菌目基
toxRpR72HtlhgyrB vpm[72527]tlh 基
副溶血性弧菌中出现频率高
部分研究员认副溶血性弧菌种特异性基
Klein 研究表明 tlh 基弧菌属中副溶
血性弧菌外占较高例相似性较高[28]
West 等赞成 tlh 基作副溶血性弧菌
种特异基[29]研究者发现toxR 基灵
敏度高分子方法鉴定副溶血性弧菌 tlh
gyrBpR72H 更[3031]团队 2005−2011 年
厦门市床致病副溶血性弧菌研究表明食物中
毒副溶血性弧菌分离株均携带toxR基tlh基
tdh 基携带率 8496−8520trh 基携
带率 796[3233]实现食品中致病性林佳琪等 四重 PCR 检测副溶血性弧菌毒力基方法建立 2527
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副溶血性弧菌快速筛查研究副溶血性弧菌
toxRtdhtrhtlh 4 基建立四重 PCR 方法
副溶血性弧菌毒力基检测
32 关重PCR重荧光定量 PCR讨
重 PCR 实现时检测重致病菌
实现时检测种菌基提高通
量节省样品提高成国外研究员针
副溶血性弧菌检测研究中关
重 PCR 应陈丽萍等建立时检测副溶血性弧
菌 gyrasetdhtrh 基三重 PCR 快速检测方法
动毛细电泳分析系统进行分析 PCR 产
物基组 DNA 浓度 136 μgL纯培养条
件菌浓度 66×102 CFUmL 时3 目基
时检出[13]Hossain 等 groELtdh trh 建
立三重 PCR实现总副溶血性弧菌携带致病子
副溶血性弧菌快速检测研究低检出
200 pg DNA[14]张捷等 F0F1ATPase 核心构建
分子马达分进行副溶血性弧菌 tdhtrhtlh
toxR 分子分型方法研究检测限达 10 pg反应
需分逐进行分型[34]研究建立副溶血性
弧菌四重 PCR 快速检测方法实现反应
体系中 4 种分子分型检验四重体系含
较组分目片段扩增反应相互受定
影响检出限进步降低
重荧光定量 PCR 检测灵敏度普通重
PCR 检测灵敏度高 1−2 数量级许龙岩等建立
副溶血性弧菌特异性检测 toxR 基 tdh 毒力基
Taqman 探针荧光 PCR 检测方法[15]低检测
浓度达 36×102 CFUmL张红芝等针 toxR
tlh 基建立添加标 PCR成功排假阴性
干扰[16] DNA 灵敏度检测限 05 μgL
Garrido 等 tdhtrh 基建立双重荧光定量 PCR
方法该方法 tdhtrh1trh2 检测限分
6 CFU25 g11 CFU25 g8 CFU25 g[17]He 等
toxRtdhtrh 基建立副溶血性弧菌致病子
三重荧光定量 PCR 方法该方法低检测
14 pg反应[18]重荧光定量 PCR 特异
性探针加入体系中引物探针设计更
复杂外荧光定量 PCR 试验耗材试剂
实验设备相 PCR 试验言均较昂贵难
基层实验室推广
国外少研究种致病菌建立
重 PCR 检测方法[3541]江迎鸿等[35]针扩增
霍乱弧菌副溶血性弧菌单核细胞增生李斯特氏
菌建立三重 PCR 检测方法Lee 等[36]肠杆菌
蜡样芽胞杆菌副溶血性弧菌沙门氏菌单增李
斯特菌金黄色葡萄球菌 6 种食源性致病菌建立
重 PCR 方法Zhang 等[37]生鲜虾中副溶血性
弧菌单增李斯特菌沙门氏菌建立重实时荧光
定量 PCR 方法等等水产品进行副溶血性弧
菌检测时发现海产品中副溶血性弧菌
外携带致病菌研究建立副
溶血性弧菌四重 PCR 快速检测方法具成低易
操作等优点 PCR 反应体系中时检
测副溶血性弧菌 4 毒力基种特异基
致病性副溶血性弧菌快速筛查
4 结
通优化引物浓度退火温度研究建立
副溶血性弧菌四重 PCR 体系中引物终浓度
分：trh 04tdh 004toxR 008tlh 004 μmolL
副溶血性弧菌模板 DNA 检测灵敏度
50 μgL纯培养条件tdhtrhtlhtoxR 4
基时检测灵敏度 67×103 CFUmLtdhtrh
2 基时检测灵敏度 67×102 CFUmL副
溶血性弧菌含量 136 CFUg 工模拟样品增
菌6 h该体系检出副溶血性弧菌携带tdh
trhtlhtoxR 基
研究建立副溶血性弧菌四重 PCR 快速2528 微生物学通报 Microbiol China 2016 Vol43 No11
Tel 01064807511 Email tongbao@imaccn httpjournalsimaccnwswxtbcn
检测方法相传统培养方法具耗时短工
作量等优点基层实验室开展副溶血性弧菌
毒力基携带情况检测提供快速效方
法规模样品检测食源性致病菌风险评估
中具定潜应价值
参 考 文 献
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Microbiology China httpjournalsimaccnwswxtbcn
tongbao@imaccn DOI 1013344jmicrobiolchina151066
Foundation item Natural Science Foundation of Fujian Province (No 2015J01614) Marine Economy Innovation
Development Regional Demonstration Foundation of Xiamen (No13PZP002SF24)
*Corresponding author Tel 865926181487 Email chyizhou@163com
Received December 27 2015 Accepted May 23 2016 Published online (wwwcnkinet) May 24 2016
基金项目：福建省然科学基金项目(No 2015J01614)厦门市海洋济创新发展区域示范项目(No13PZP002SF24)
*通讯作者：Tel：865926181487Email：chyizhou@163com
收稿日期：20151227接受日期：20160523优先数字出版日期(wwwcnkinet)：20160524
生物实验室
四重 PCR 检测副溶血性弧菌毒力基方法建立
林佳琪 1 苏国成 12 黄建炜 3 陈泽辉 3 周常义 12*
(1 集美学食品生物工程学院 福建 厦门 361021)
(2 厦门市食品科技研发检测中心 福建 厦门 361021)
(3 厦门市疾病预防控制中心 福建 厦门 361021)
摘 ：目建立时检测副溶血性弧菌 toxRtdhtrhtlh 基四重 PCR 快速检测方
法方法分副溶血性弧菌 toxRtdhtrhtlh 4 基靶基设计 4 特异性引
物 4 引物浓度退火温度进行优化获佳引物例扩增条件建立快速检测致病
性副溶血性弧菌四重 PCR 体系通特异性验证灵敏度验证模拟样品检测进行方法
确认结果四重 PCR 体系扩增条带预期相符 115 bp (toxR)244 bp (tdh)418 bp (trh)
759 bp (tlh) 4 目条带 74 株副溶血性弧菌 37 株非目标菌测试结果表明建立
方法良特异性该方法模板 DNA 检测灵敏度 50 μgL纯培养物检测灵敏度
67×103 CFUmL副溶血性弧菌含量 136 CFUg 工模拟样品增菌 6 h toxRtlhtdh
trh 4 基时检出结该方法实现时检测携带 toxRtdhtrhtlh 4 种基
副溶血性弧菌开展致病性副溶血性弧菌检测研究具定现实意义
关键词：副溶血性弧菌四重 PCRtoxR 基tdh 基trh 基tlh 基
Establishment of a quadruple PCR method for detecting pathogenic
genes in Vibrio parahaemolyticus
LIN JiaQi1 SU GuoCheng12 HUANG JianWei3 CHEN ZeHui3 ZHOU ChangYi12*
(1 College of Food and Bioengineering Jimei University Xiamen Fujian 361021 China)
(2 Xiamen Food Research and Inspection Centre Xiamen Fujian 361021 China)
(3 Xiamen Centre for Disease Control and Prevention Xiamen Fujian 361021 China)
Abstract [Objective] This study aimed at establishment of a rapid specific quadruple PCR assay for
detecting Vibrio parahaemolyticus and its virulence genes [Methods] Four pairs of primers were
designed based on toxR tdh trh and tlh genes sequences of V parahaemolyticus Optimized the
concentration of four pairs of primers and the annealing temperature to obtain the best ratio of primer
and amplification conditions the rapid quadruple PCR detection of pathogenic V parahaemolyticus
was established The specificity and sensitivity of the quadruple PCR method were also evaluated 2522 微生物学通报 Microbiol China 2016 Vol43 No11
Tel 01064807511 Email tongbao@imaccn httpjournalsimaccnwswxtbcn
[Results] The expected sizes of amplification bands were 115 bp 244 bp 418 bp and 759 bp for
toxR tdh trh and tlh respectively The highly specificity of this method was evaluated by using 74 V
parahaemolyticus strains and 37 nontargeted bacteria The detection limits of the multiplex PCR for
DNA was 50 μgL Detection sensitivity of V parahaemolyticus in pure culture condition was
67×103 CFUmL Four targeted fragments were detected in artificially contaminated seafood with
136 CFUg V parahaemolyticus after 6 h enrichment [Conclusion] The multiplexPCR method can
simultaneously detect V parahaemolyticus with toxR tdh trh andor tlh It is of certain significance
to carry out the detection of pathogenic V parahaemolyticus
Keywords Vibrio parahaemolyticus Quadruple PCR toxR gene tdh gene trh gene tlh gene
副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticusVp)
海洋环境中然存种嗜盐革兰氏阴性细
菌够盐度温度环境中生存[12]
广泛存海口江口浮游生物鱼类虾
类贝类等水产品中[34]海国家普遍存食
源性致病菌[59]副溶血性弧菌通消费者
摄入生未煮熟海产品引起发热腹痛腹泻
恶心呕吐等急性胃肠炎症状严重时甚导致昏迷
休克死亡然界中存副溶血性弧菌部分
非致病仅 03−50携带致病子[1011]
国 2014 年 6 月 1 日开始采新版 GB
478972013该标准中检验程序然需采传
统培养法进行增菌分离培养生化鉴定神奈川
试验血清学试验整检测程存工作量
检测周期长工作繁琐操作判定容易成
高等缺陷行业标准 SNT 24242010 SNT
26412010SNT 25642010 SNT 275452011
采分子生物学技术进行副溶血性弧菌检测
判断携带致病基类型
重 PCR 技术(Multiplex PCR)常规 PCR
基础发展起种高效快速分子生物学技
术反应体系中加入引物够
时进行扩增目片段简化工
作流程降低实验成快速效达
量样分析鉴定研究前期床致病副
溶血性弧菌研究基础选取副溶血性弧菌
toxRtdhtrhtlh 基设计 4 特异性引物
通优化引物浓度例退火温度等条件建立
PCR 反应体系中时扩增 toxRtdhtrh
tlh 4 种目标基四重 PCR 方法
1 材料方法
11 实验菌株
32 株致病性副溶血性弧菌厦门市疾病预防
控制中心提供均食物中毒分离株菌株编号
VP1−VP8VP42VP60VP64VP67−VP71VP75
VP87−VP93 VP170 VP171 VP183−VP187
VP201102941 株副溶血性弧菌菌株实验室
食品环境中分离保存菌株菌株编号
VPS201306 VPS201307 VPZ1432−VPZ1444
VPZ1451−VPZ1465 VPZ1539 VPZ1550
VPZ1555VPH1602−VPH16091 株标准菌株副溶
血性弧菌(ATCC 17802)厦门市食品科技研发检
测中心提供
22 株非副溶血性弧菌分溶藻弧菌河弧
菌创伤弧菌拟态弧菌弗氏弧菌哈维弧菌
非 O1 型霍乱弧菌鳗弧菌嗜水气单胞菌发光
杆菌嗜盐单胞菌实验室保存菌株
15 株非副溶血性弧菌标准菌株分金黄色
葡萄球菌(ATCC 25923)肠埃希氏菌(ATCC
25922)肠埃希氏菌 O157：H7 (NCTC 12900)
乙型溶血性链球菌(ATCC 21059)产气肠杆菌
(ATCC 13048) 甲型副伤寒沙门菌
(CMCC(B)50093) 乙型副伤寒氏沙门菌
(CMCC(B)50094)鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 14028)
肠结肠炎耶尔森氏菌[CMCC(B)52204]单增李斯
特菌(ATCC 19115)伊氏李斯特菌(STCC 19119)
英诺克李斯特菌(ATCC 33090)阪崎肠杆菌(ATCC
29544)粪链球菌(ATCC 29212)宋志贺氏菌林佳琪等 四重 PCR 检测副溶血性弧菌毒力基方法建立 2523
Tel 01064807511 Email tongbao@imaccn httpjournalsimaccnwswxtbcn
[CMCC(B) 51592]厦门市食品科技研发检测中
心提供
12 试剂仪器
DNA 基组提取试剂盒DNA Marker购
天根生化科技(北京)限公司Multiplex PCR
Assay Kit Ver2购宝生物工程(连)限公司
琼脂糖 Biowest Agarose G10购西班牙 Biowest
公司GelStain 购北京全式金生物技术限公司
LifeEco 基扩增仪BIOER 公司微量紫外
分光光度计 Q5000Quawell 公司凝胶成仪
GenoSens1860海勤翔科学仪器限公司掌
离心机 D1008ESCILOGEX 公司水电泳
槽Power B 基础型电泳电源北京凯元信瑞仪器
限公司
13 培养基
弧菌培养基 3 NaClAPWTCBS参
GB478972013 配制菌培养基常规培养
基均购广东环凯微生物科技限公司
14 引物设计合成
利分子信息学方法根 NCBI GenBank
中已发表副溶血性弧菌跨膜调控蛋白 R 基
(Transmembrane regulatory protein RtoxR)耐热直
接溶血素毒素基(Thermostable direct hemolysin
tdh) 耐热直接溶血素毒素相关毒素基
(Thermostable direct haemolysinrelated haemolysin
trh) 耐热溶血毒素基(Thermolabile
hemolysintlh)序列采 DNAMAN 软件中
Alignment 进行序列确定序列保守片
段利 Primer Premier 50 设计引物利
MFEprimer20 线软件进行引物间二聚体验证
利 BLAST 进行引物特异性验证引物海英
潍捷基公司合成(表 1)
15 基组 DNA 制备
基组 DNA 提取试剂盒进行副溶血性弧
菌 DNA 提取测量 DNA 含量 TE 溶液稀释
50 mgL提取基组 DNA 置−20 °C
保存
16 纯菌悬液 DNA 模板提取
菌条件取副溶血性弧菌单菌落接种 3
表 1 引物序列扩增产物
Table 1 Primer sequence and amplicon size
Target
gene
Primer
name
Primer sequence
(5′→3′)
Amplicon
size (bp)
toxR vptoxR2f GTTCCAAAACGAGGCTATCA 115
vptoxR2r CAGAGGCGTCAATGTAATC
AG
tdh vptdh1f CTTCCATCTGTCCCTTTTCC 244
vptdh1r CCGCTGCCATTGTATAGTCT
trh vptrh3f TTTCCTTCTCCTGGTTCCG 418
vptrh3r TATGTCCATTGCCGCTCT
tlh vptlh4f CGAAGAGCCAACCTTATCA 759
vptlh4r TCCGTCAAACGAATCAGTG
NaClAPW 中37 °C200 rmin 条件培养 6 h
菌生理盐水菌液进行 10 倍梯度稀释选择
合适稀释度菌悬液 TCBS 板计数稀
释度菌悬液取 1 mL12 000 rmin 离心 5 min
清菌生理盐水重悬 110 原体积
100 °C 沸水水浴 10 min细菌细胞裂解然立
放入 4 °C 冷 5 min12 000 rmin 离心 3 min
取清备
17 四重 PCR 体系建立
通单重 PCR 体系退火温度优化
重 PCR 体系中引物浓度例退火温度优
化反应体系(50 μL PCR 体系)包括：2×Multiplex
PCR Buffer (Mg2+dNTP plus) 25 μLMultiplex PCR
Enzyme Mix 03 μL模板 5 μLvptrh3f3r
vptdh1f1rvptoxR2f2rvptlh4f4r 2 μL 菌
ddH2O 补足 50 μL中 4 游引物浓度
例通参数优化确定 trhtdhtoxRtlh
序次进行二重三重四重组合引物浓度分
：trh 引物终浓度 04 μmolLtdh 引物终浓度 02
010067005004003 μmolLtoxR 引物终
浓度 02016012008006004 μmolLtlh
引物终浓度 02016012008006004 μmolL
PCR 反应条件：94 °C 1 min94 °C 30 s46 °C
45 s72 °C 1 min35 循环72 °C 10 min4 °C
保存取 8 μL 扩增产物 15琼脂糖凝胶进2524 微生物学通报 Microbiol China 2016 Vol43 No11
Tel 01064807511 Email tongbao@imaccn httpjournalsimaccnwswxtbcn
行电泳凝胶成仪进行观察拍
18 四重 PCR 体系灵敏度试验
181 基组 DNA 灵敏度检测： 15 获副溶
血性弧菌基组 DNA 溶液菌核酸水
DNA 溶液稀释 50×104 50×103 50×102
50×10150×10050×10−1 μgL稀释 DNA
溶液作模板进行四重 PCR 体系灵敏度检测
182 纯培养菌液灵敏度检测： 16 获纯副溶
血性弧菌稀释度菌悬液 DNA 模板菌悬
液进行板计数时 DNA 模板加入四重 PCR
体系根板计数结果应四重 PCR 检测结
果计算方法细菌灵敏度
19 四重 PCR 体系特异性试验
副溶血性弧菌非副溶血性弧菌菌株
增菌提取 DNA取 1 μL 进行四重 PCR 检测
110 工污染样品检测
取 GB 478972013 方法验证副溶血性
弧菌牡蛎虾鱿鱼带鱼等样品菌条件
称取 25 g 均质杯中加入 225 mL 3
NaClAPW 培养液均质器进行均质制匀浆
添加 136 CFUg 溶血性弧菌悬液时菌生
理盐水做空白添加副溶血性弧菌样品
基质制备模拟样品置 36 °C200 rmin 培
养 6 h 取 1 mL1 000 rmin 离心 10 min 取
清10 000 rmin 离心 10 min 清生理盐水
洗涤 2 遍提取菌液 DNA 进行四重 PCR 检测
2 结果
21 四重体系中单重PCR四重PCR实验
结果
目片段进行单重梯度 PCR 115244
418759 bp 处分扩增出 toxRtdhtrhtlh 基
相应目条带优化四重 PCR 体系引物
浓度退火温度终确定引物加入终
浓度：vptrh3f3r 终浓度 04 μmolLvptdh1f1r 终浓
度 004 μmolLvptoxR2f2r 终浓度 008 μmolL
vptlh4f4r 终浓度 004 μmolL (图 1)退火温度
45−574 °C 成功扩增出清晰目条带(图 2)
四重 PCR 体系 4 扩增条带单重 PCR
体系 4 扩增条带致
图 1 重 PCR 引物浓度优化结果
Figure 1 Optimization results of different primers concentrations for multiple PCR
注：A：trhtdh 基双重 PCR 引物优化结果(M：D2000 DNA marker1−6：trh 引物浓度均 04 μmolLtdh 引物浓度次 02
010067005004003 μmolL)B：trhtdhtoxR 基三重 PCR 引物浓度优化结果(M：D2000 DNA marker1−6：trh 引
物浓度均 04 μmolLtdh 引物浓度均 004 μmolLtoxR 引物浓度次 02016012008006004 μmolL)C：trh
tdhtoxRtlh 基四重 PCR 引物浓度优化结果(M：D2000 DNA marker1−6：trh 引物浓度均 04 μmolLtdh 引物浓度均
004 μmolLtoxR 引物浓度均 008 μmolLtlh 引物浓度次 02016012008006004 μmolL)D：引物进行单重
PCR 四重 PCR 扩增结果(M：D2000 DNA marker1：toxR 单重 PCR 结果2：tdh 单重 PCR 结果3：trh 单重 PCR 结果4：
tlh 单重 PCR 结果5：toxRtdhtrhtlh 四重 PCR 结果6：空白)
Note A Optimization results of primers concentration for duplex PCR (M D2000 DNA marker 1−6 trh (04 μmolL) and the
concentrations of tdh are 02010067005004003 μmolL) B Optimization results of primers concentration for triplex PCR (M
D2000 DNA marker 1−6 trh (04 μmolL) tdh (004 μmolL) and the concentrations of toxR are 02 016 012 008 006 004 μmolL) C
Optimization results of primers concentration for quadruple PCR (M D2000 DNA marker 1−6 trh (04 μmolL) tdh (004 μmolL) toxR
(008 μmolL) and the concentrations of tlh are 02 016 012 008 006 μmolL 004 μmolL) D Products of single PCR and
multiplexPCR (M D2000 DNA marker 1 Single PCR product of toxR 2 Single PCR product of tdh 3 Single PCR product of trh 4
Single PCR product of tlh 5 MultiplexPCR products of toxR tdh trh tlh 6 Blank control)
Enterobacter sakazakii Streptococcus faecalis Shigella sonnei + Positive – Negative
Salmonella paratyphi B Salmonella typhimurium Yersinia enterocolitica Listeria monocytogenes Listeria ivanovii Listeria innocua
H7 beta hemolytic streptococcus Enterobacter aerogenes Salmonella paratyphi A׃aureus Escherichia coli Escherichia coli O157
Vibrio harveyi nonO1 Vibrio cholerae Vibrio anguillarum Aeromonas hydrophila Photorhabdus spp Halomonas sp Staphylococcus
Note * NonVibrio parahaemolyticus including Vibrio alginolyticus Vibrio fluvialis Vibrio vulnificus Vibrio mimicus Vibrio furnissii
斯特菌阪崎肠杆菌粪链球菌宋志贺氏菌 +：阳性–：阴性
甲型副伤寒沙门氏菌乙型副伤寒沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌肠结肠炎耶尔森氏菌单增李斯特菌伊氏李斯特菌英诺克李
H7乙型溶血性链球菌产气肠杆菌׃水气单胞菌发光杆菌嗜盐单胞菌金黄色葡萄球菌肠埃希氏菌肠埃希氏菌 O157
注：*：非副溶血性弧菌包括：溶藻弧菌河弧菌创伤弧菌拟态弧菌弗氏弧菌哈维弧菌非 O1 型霍乱弧菌鳗弧菌嗜
NonVibrio parahaemolyticus* – – – –
Vibrio parahaemolyticus No Z1433 + – – –
+ – – +
H1603 H1605−H1609 Z1451−Z1465
Vibrio parahaemolyticus No Z1432 Z1434 Z1435 Z1437−Z1439 Z1441−Z1444 H1602
Vibrio parahaemolyticus No 186 187 S201306 S201307 ATCC 17802 + – + +
Vibrio parahaemolyticus No 87−93 64 170 171 Z1555 Z1436 Z1440 + + + +
Vibrio parahaemolyticus No 1−8 42 60 67−71 75 183−185 2011029 Z1539 Z1550 H1604 + + – +
toxR tdh trh tlh
Target gene
Bacterial specie and strain ID
Table 2 The specificity results of multiple PCR
表 2 四重 PCR 体系特异性试验结果
模板 DNA 浓度检测限 50 μgL
toxR 携带 tdhtrhtlh 致病子副溶血性弧菌
扩增产物(图 3)时检测副溶血性弧菌
明显扩增出模板 DNA 50 μgL 时未见
模板 DNA 稀释 50 μgL 时4 条目条带
231 基组 DNA 灵敏度试验结果：试验测定
23 四重 PCR 体系灵敏度试验结果
血性弧菌致病子
性基tdhtrhtlh 3 引物分鉴副溶
高度特异性toxR 作副溶血性弧菌种特异
条带研究证明该四重 PCR 体系中 4 引物具
血性弧菌均扩增出相应 toxRtdhtrhtlh
标 FDA 2004 标准[12]检测结果致非副溶
toxR扩增结果实验室荧光定量 PCR 验证国
VPZ1451–VPZ1465 携带 toxRtlhVPZ1433 携带
VPH1603 VPH1605−VPH1609
VPZ1437−PZ1439VPZ1441−VPZ1444VPH1602
trh tlh VPZ1432 VPZ1434 VPZ1435
VPS201306VPS201307 ATCC 17802 携带 toxR
Z1440 携带 toxRtdhtrhtlhVP67−71
VP87–93VP64VP170VP171PZ1555Z1436
VPZ1539VPZ1550 VPH1604 携带 toxtdhtlh
(表 2)VP1−22VP42VP60VP75VP2011029
非副溶血性弧菌进行重 PCR 扩增试验结果显示
特异性扩增致病性副溶血性弧菌
测序结果表明建立 4 基目片段均
扩增产物送英潍捷基(海)贸易限公司测序
4 基单重 PCR 重 PCR 产物电泳
22 四重 PCR 体系特异性试验结果
535 °C 5 574 °C 6 596 °C
Note M D2000 DNA marker 1 450 °C 2 460 °C 3 489 °C 4
for quadruple PCR
Figure 2 Optimization results of annealing temperature
图 2 四重 PCR 退火温度优化结果
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林佳琪等 四重 PCR 检测副溶血性弧菌毒力基方法建立 25252526 微生物学通报 Microbiol China 2016 Vol43 No11
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图 3 四重 PCR 基组 DNA 灵敏度试验结果
Figure 3 The sensitivity results of genome DNA template
concentration for quadruple PCR
注：M：D2000 DNA marker1−6：DNA 模板浓度次 50×104
50×10350×10250×10150×10050×10−1 μgL
Note M D2000 DNA marker 1−6 The concentrations of genome
DNA are 50×104 50×103 50×102 50×101 50×100
50×10−1 μgL
232 纯培养菌液灵敏度试验结果：副溶血性弧
菌培养液富集培养菌生理盐水
10 倍梯度稀释分进行菌落计数重 PCR 检
测检测结果表明副溶血性弧菌模板含量
67×103 CFUmL 时4 目片段够时检出
(图4)副溶血性弧菌模板含量67×102 CFUmL
时 tdhtrh 2目片段检出该方
法检出灵敏度 67×103 CFUmL
图 4 四重 PCR 副溶血性弧菌纯培养液灵敏度试验结果
Figure 4 The sensitivity results of pure culture for
quadruple PCR
注：M：D2000 DNA marker1−7：菌液浓度次 67×106
67×10567×10467×10367×10267×10167×100 CFUmL
Note M D2000 DNA marker 1−7 The cell concentrations of
pure culture are 67×106 67×105 67×104 67×103 67×102
67×101 67×100 CFUmL
24 模拟样品检测基携带判定
通副溶血性弧菌水产品样品中加入
副溶血性弧菌菌液液体培养基富集培养取
适量样品进行重 PCR 反应检测时做空白
副溶血性弧菌含量 136 CFUg 模拟样品
富集 6 h toxRtdhtrhtlh 4 目条带均成
功扩增出条带清晰方法判定样品
否含副溶血性弧菌时检测携带 tdhtrh
tlh 致病基情况
3 讨
31 关种特异基毒力基讨
tdhtrhtlh 基毒力调控基 toxR 致病
性副溶血性弧菌研究中重毒力子[1323]tdh
基 trh 基分表达耐热直接溶血素毒素耐
热直接溶血素毒素相关毒素tlh 基表达耐热溶
血毒素种非典型磷脂酶床分离株
环境分离株数副溶血弧菌均携带 tlh 基
床分离株携带 tdh 基环境分离株
水产品分离株极少携带 tdh 基[23]床株环
境株检出率 trh 基较低 tdh 基存
情况[24]目前鉴副溶血性弧菌目基
toxRpR72HtlhgyrB vpm[72527]tlh 基
副溶血性弧菌中出现频率高
部分研究员认副溶血性弧菌种特异性基
Klein 研究表明 tlh 基弧菌属中副溶
血性弧菌外占较高例相似性较高[28]
West 等赞成 tlh 基作副溶血性弧菌
种特异基[29]研究者发现toxR 基灵
敏度高分子方法鉴定副溶血性弧菌 tlh
gyrBpR72H 更[3031]团队 2005−2011 年
厦门市床致病副溶血性弧菌研究表明食物中
毒副溶血性弧菌分离株均携带toxR基tlh基
tdh 基携带率 8496−8520trh 基携
带率 796[3233]实现食品中致病性林佳琪等 四重 PCR 检测副溶血性弧菌毒力基方法建立 2527
Tel 01064807511 Email tongbao@imaccn httpjournalsimaccnwswxtbcn
副溶血性弧菌快速筛查研究副溶血性弧菌
toxRtdhtrhtlh 4 基建立四重 PCR 方法
副溶血性弧菌毒力基检测
32 关重PCR重荧光定量 PCR讨
重 PCR 实现时检测重致病菌
实现时检测种菌基提高通
量节省样品提高成国外研究员针
副溶血性弧菌检测研究中关
重 PCR 应陈丽萍等建立时检测副溶血性弧
菌 gyrasetdhtrh 基三重 PCR 快速检测方法
动毛细电泳分析系统进行分析 PCR 产
物基组 DNA 浓度 136 μgL纯培养条
件菌浓度 66×102 CFUmL 时3 目基
时检出[13]Hossain 等 groELtdh trh 建
立三重 PCR实现总副溶血性弧菌携带致病子
副溶血性弧菌快速检测研究低检出
200 pg DNA[14]张捷等 F0F1ATPase 核心构建
分子马达分进行副溶血性弧菌 tdhtrhtlh
toxR 分子分型方法研究检测限达 10 pg反应
需分逐进行分型[34]研究建立副溶血性
弧菌四重 PCR 快速检测方法实现反应
体系中 4 种分子分型检验四重体系含
较组分目片段扩增反应相互受定
影响检出限进步降低
重荧光定量 PCR 检测灵敏度普通重
PCR 检测灵敏度高 1−2 数量级许龙岩等建立
副溶血性弧菌特异性检测 toxR 基 tdh 毒力基
Taqman 探针荧光 PCR 检测方法[15]低检测
浓度达 36×102 CFUmL张红芝等针 toxR
tlh 基建立添加标 PCR成功排假阴性
干扰[16] DNA 灵敏度检测限 05 μgL
Garrido 等 tdhtrh 基建立双重荧光定量 PCR
方法该方法 tdhtrh1trh2 检测限分
6 CFU25 g11 CFU25 g8 CFU25 g[17]He 等
toxRtdhtrh 基建立副溶血性弧菌致病子
三重荧光定量 PCR 方法该方法低检测
14 pg反应[18]重荧光定量 PCR 特异
性探针加入体系中引物探针设计更
复杂外荧光定量 PCR 试验耗材试剂
实验设备相 PCR 试验言均较昂贵难
基层实验室推广
国外少研究种致病菌建立
重 PCR 检测方法[3541]江迎鸿等[35]针扩增
霍乱弧菌副溶血性弧菌单核细胞增生李斯特氏
菌建立三重 PCR 检测方法Lee 等[36]肠杆菌
蜡样芽胞杆菌副溶血性弧菌沙门氏菌单增李
斯特菌金黄色葡萄球菌 6 种食源性致病菌建立
重 PCR 方法Zhang 等[37]生鲜虾中副溶血性
弧菌单增李斯特菌沙门氏菌建立重实时荧光
定量 PCR 方法等等水产品进行副溶血性弧
菌检测时发现海产品中副溶血性弧菌
外携带致病菌研究建立副
溶血性弧菌四重 PCR 快速检测方法具成低易
操作等优点 PCR 反应体系中时检
测副溶血性弧菌 4 毒力基种特异基
致病性副溶血性弧菌快速筛查
4 结
通优化引物浓度退火温度研究建立
副溶血性弧菌四重 PCR 体系中引物终浓度
分：trh 04tdh 004toxR 008tlh 004 μmolL
副溶血性弧菌模板 DNA 检测灵敏度
50 μgL纯培养条件tdhtrhtlhtoxR 4
基时检测灵敏度 67×103 CFUmLtdhtrh
2 基时检测灵敏度 67×102 CFUmL副
溶血性弧菌含量 136 CFUg 工模拟样品增
菌6 h该体系检出副溶血性弧菌携带tdh
trhtlhtoxR 基
研究建立副溶血性弧菌四重 PCR 快速2528 微生物学通报 Microbiol China 2016 Vol43 No11
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检测方法相传统培养方法具耗时短工
作量等优点基层实验室开展副溶血性弧菌
毒力基携带情况检测提供快速效方
法规模样品检测食源性致病菌风险评估
中具定潜应价值
参 考 文 献
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