摘
构建鸽毛滴虫粘附蛋白基真核表达系统根
pcDNA6His™ A载体求实验室获Tg ap基行
设计引物已构建pMD18ap质粒模板扩增目基
目片段pcDNA6His™ A空载体EcoRⅠXbaⅠ双酶
切酶切目基pcDNA6His™ A载体T4连接酶
连接转化肠杆菌DH5α中构建重组真核表达载体
然PCR双酶切鉴定鉴定阳性克隆送测序公司测
序结果：PCR扩增目片段电泳检测条长约930 bp
目基片段双酶切目基pcDNA6His™ A载体连
接获重组质粒PCR酶切鉴定鉴定阳性克隆送
测序公司测序获基序列进行分析该基片段含
长约930bp阅读框Tg ap基序列完全致说明Tg ap
基成功克隆pcDNA6His™ A真核表达载体中研制鸽毛
滴虫基工程疫苗奠定基础
关键词：鸽毛滴虫 粘附蛋白基 真核表达
文常缩写词
缩写词 英文全称 中文全称
AMP Ampicillin 氨苄青霉素
bp Base pair 碱基
DNA Deoxyrubonucleic acid 脱氧核糖核酸
g gram 克
h hour 时
L Liter 升
LB Lauria broth LB肉汤培养基
mg Milligram 毫克
min Minite 分钟
mL Milliliter 毫升
mol Mole 摩尔
PCR Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应
pH power of hydrogen pH值
rpm Revolutions per minite 分钟转数
s second 秒
Tg Trichomonas gallinae 鸽毛滴虫
μL Microlitre
微升
目 录
1前言 1
2 材料方法 3
21 材料 3
211质粒 3
212 酶类试剂 4
213培养基常溶液 4
214仪器 5
22方法 5
221引物设计合成 5
222 Tg ap基序列扩增 6
223 PCR产物回收纯化 6
224 PCR产物酶切 7
225 酶切产物回收 7
226 pcDNA6His™ A质粒量制备 8
227质粒pcDNA6His™ A酶切 8
228质粒酶切产物回收 8
229 PCR产物pcDNA6His™ A质粒载体连接 8
2210连接产物转化Ecoli DH5α感受态细胞 9
2211 克隆菌落PCR鉴定 9
3 结果 10
31 TG AP基扩增 10
32 PCR产物酶切PCDNA6HIS™ A质粒酶切电泳鉴定
11
33 TG AP基PCDNA6HIS™ A表达质粒构建 11
34 克隆菌落PCR鉴**果 12
35 重组质粒PCDNA6AP酶切鉴定 13
36重组质粒PCDNA6AP序列测定 14
4 讨 14
41 TG AP基序列扩增 14
42 质粒PCDNA6HIS™ A载体表达系统 14
5 结 15
致谢 16
参考文献 17
英文摘………………………………………………………………
………………………18
1前言
着国济发展民生活水日益提高民商品乳鸽
消费成倍增长特猪肉涨价许更乐购买鸽子
养鸽业发展前景观市场潜力国际市场
欧美东南亚等国家市场相广阔素鸽胜九鸡称
鸽代鸡鸽成宴趋势[1] 年**省养鸽业发展
迅速出现许万鸽场出现10万型鸽
场年存栏量达2000万商品乳鸽3~4亿国
养鸽省份外鸽子温驯易饲养适合散养
许许农户繁养
鸽子量养殖衍生许许问题鸽毛滴虫病首
该病鸽毛滴虫引起鸽毛滴虫Rirolta1878年首次
鸽肠中发现病原属原生动物门Protozoa鞭毛纲
Mastigophora动鞭亚纲Zoomastigina鞭毛目
Polymastigida毛滴虫科Trichomonadidae（Wenyon1926）毛
滴虫属（Trichomonas Donne1837）鸽毛滴虫（Trichomonas
gallinae）（Rivolta1878Stabler1938）鸽毛滴虫病种
侵害消化道段原虫病发生虫体量繁殖
破坏消化道粘膜表层等引起系列疾病问题鸽毛滴
虫局限口咽粘膜表面分泌物中繁殖病鸽口咽粘膜溃疡
发生干酪样坏死脓性炎症病理组织学变化[2]
目前约20野鸽60家鸽病带虫者正常
情况鸽子表现明显床症状断感染新鸽群
样病鸽群中连绵断许成鸽症状
带虫者常鸽子特乳鸽传染源消灭成
鸽体病原预防控制病重途径
病发生春夏两季传播途径消化道消化道病
病原虫通常寄生损害部位病鸽口腔溃疡病灶虫体聚
集点唾液量虫体 病鸽带虫鸽传染源
鸽群间通成年鸽接吻嗉囊乳哺育幼鸽途径直接感
染种特禽类疾病传染途径通饮水创伤感
染[3]
防治方面目前传统做法例病鸽隔离饲养
加强饲养理环境消毒药物治疗等效
达防治效果研制鸽毛滴虫疫苗防治鸽毛滴虫病
新思路希研制出种新型价廉量生产
范围防治鸽毛滴虫病疫苗
核酸疫苗(nucleic vaccine)年新兴种疫苗
编码某种抗原蛋白外源基(DNARNA)直接导入动物体细胞
宿细胞中通宿细胞转录系统合成抗原蛋白诱导
宿产生该抗原蛋白免疫应答获相应免疫保护
预防治疗疫病称基疫苗[4]
核酸疫苗独特优点吸引着：(1)抗原合成递呈程
病原然感染相似通MHC Ⅰ类Ⅱ类分子直接递呈免疫
系统特特异性CD8＋淋巴细胞(CTL)免疫反应灭活
疫苗亚单位疫苗拟(2)免疫原单性编码
需抗原基导入细胞表达载体身没抗原性重组
病毒活载体疫苗目基表达外庞复杂免疫
蛋白(3)易构建制备核酸疫苗涉基方面操作
象第1 代减毒活疫苗样需放射线防护设施 象第
2 代蛋白肽疫苗样需细胞培养蛋白纯化等复杂程
稳定性贮存方便成低廉适规模化生产(4) 免疫具
持续性 次接种获长期免疫力 避免灭活疫苗重组
亚单位疫苗等需次加强免疫繁琐（5）种异株交叉保
护作 采种株间保守DNA 序列作核酸疫苗
免疫作突破理株限制 甲型流感病毒中已证
实[5]
实验通扩增鸽毛滴虫粘附蛋白基插入
pcDNA6His™ A载体中构建重组真核表达载体进步研
制核酸疫苗奠定基础
2 材料方法
21 材料
211质粒
pcDNA6His™ AInvitrogen产品**省农科院兽医研究
寄生虫研究室购买提供pcDNA6His™ A 载体长52 kb
PCMV (Human cytomegalovirus immediateearly promoter)启
动子数哺乳动物细胞高水瞬时表达重组蛋白N
末端肽编码Xpress™ 抗原决定簇组氨酸(6xHis) 限制性
标签(见图12)
图 1 pcDNA6His™ A 克隆位点
图2 pcDNA6His™ A结构示意图
212 酶类试剂
限制性切酶EcoRⅠXbaⅠ相应缓液EXTaq DNA聚合酶
缓液dNTPsT4DNA连接酶2000bp分子量标记总RNA
抽提试剂盒RNAiso ReagentMiniBEST Plasmid Purification
Kit Ver20DNA胶回收试剂盒质粒DNA抽提试剂盒均**
TaKaRa产品酚氯仿异戊醇（25241）溶液购**生工生
物工程公司DEPCXgalIPTG**脂糖溴化乙锭（EB）购
宝泰克生物科技限公司
Ecoli DH5α感受态细胞**兽医学院寄生虫实验室
刘霞硕士生提供
213培养基常溶液
LB液体培养基：Tryptone 10gYeast Extract 5gNaCl 10g
加双蒸水定容1000mL高压灭菌20 min4℃保存
LB固体培养基：LB液体培养基中加入**脂粉终浓度16（
wv）高压灭菌分装灭菌皿凝固4℃保存
含氨苄青霉素（100µgmL）**脂板：灭菌LB固体培养
基温度降50℃左右时加入氨苄青霉素终浓度100µgmL
分装灭菌皿凝固4℃保存
氨苄青霉素贮存液：三蒸水配成浓度100mgmL022µm滤
膜滤菌分装20℃保存
双蒸水：Millipore超纯水仪制备成
电泳缓液TBE(10×)配制：称取Trisbase 108g硼酸55g
加入05molL EDTA(pH80) 20mL加离子水定溶1000mL
10**脂糖凝胶配制：称取10 g**脂糖三角瓶中加入
10mL 10×TBE缓液加水定容100mL加热溶解加入5μ
L EB(10mgmL)锡纸封住瓶口常温保存
214仪器
PCR Express Gradient PCR仪：HYBAID公司产品
REVCO超低温冰箱(80℃)：美国REVCO
Orbital Shaker：USA Thermo forma
LRH250A生化培养箱：**省医疗仪器厂
CS101AB型电热鼓风干燥箱：**试验设备厂
Eppendorf5804R低温高速离心机：Germany Eppendorf
Eppendorf centrifuge5415D台式高速离心机：Germany
Eppendorf
Eppendorf BiopHotometer：Germany Eppendorf
METTLER TOLEDO AB204E分析天：**思尔达科学仪器限公
司
SWCJ1FD超净工作台：**净化设备厂
HSGⅡC4电热恒温水浴锅：**市**仪器厂
全封闭紫外透射仪（WFH201B）：**市深华生物技术限公
司产品
凝胶成象分析系统：英国UVITEC公司产品
BioRAD电泳系统：美国BioRad公司产品
SHZ88型水浴恒温振荡器：**省**市医疗仪器厂
22方法
221引物设计合成
根已克隆Tg ap基序列重新设计引物扩增Tg
ap基游引物5’端引入EcoRⅠ 酶切位点游引物
5’端引入XbaⅠ酶切位点带终止密码子拟扩增长度约
930bpDNA片段
游引物：5'ATGGAATTCTGATGCTCTCCTCTTCCTTCG 3'
游引物：5'ATGCTAGAGGATCTTGCCCATTCTCTTCAT3'
222 Tg ap基序列扩增
测序含插入目基pMD18T载体JM108菌液
质粒分模板新设计引物进行PCR扩增反应程序
：94℃预变性3min94℃ 45s55℃ 45s72℃ 60s30循
环72℃ 延伸10min反应体系：
试剂 体积（μL）
10×EX Tap buffer 5
模板 05
dNTPs 4
游引物 1
游引物 1
EX Taq 025
ddH2O 补50
述反应体系混匀离心PCR仪进行扩增述程序执
行完毕10**脂糖凝胶（含05μgmL溴化乙锭EB）电
泳检测PCR产物130V电压进行电泳15min紫外灯
观察电泳结果
223 PCR产物回收纯化
具体操作步骤：
1) TBE缓液制作**脂糖凝胶然PCR产物进行**脂糖
凝胶电泳
2) 电泳紫外灯切凝胶中含目条带胶块纸巾吸
胶块表面液体放入预先称重量空15mL Ep中
3) 切碎胶块切碎加快胶块融化时间提高DNA回收
率
4) 装胶块Ep放电子天次称重计算胶块重
量1mg1uL 计算胶块体积
5) 胶块中加入胶块融化液DRI Buffer体积胶块体积3
倍
6) 均匀混合75℃加热融化胶块间摇动Ep2－3次
胶粒完全融化
7) 述胶块溶化液中加入DRI Buffer量12体积量DRII
Buffer均匀混合
8) 试剂盒中 Spin column 安置Collection Tube
9) 述步骤7溶液转移Spin column12000rpm离心1min
弃滤液
10) 500uLRinse A 加入Spin column中12000rpm离心30s
弃滤液
11) 700uLRinse B 加入Spin column中12000rpm离心30s
弃滤液
12) 重复步骤11)
13) Spin column安置新15mL离心Spin
column膜中央处加入25uLElution Buffer室温静置1min
14) 12000rpm离心1min收集滤液（滤液回收DNA）
置4℃冰箱保存备
224 PCR产物酶切
EcoRⅠXbaⅠ双酶切纯化PCR产物反应体系：
试剂 体积（μL）
10×M buffer 10
01％BSA 10
XbaⅠ 5
EcoRⅠ 5
PCR产物 30
ddH2O 补100
混匀离心37℃酶切4h
225 酶切产物回收
具体操作步骤223
226 pcDNA6His™ A质粒量制备
取pcDNA6His™ A质粒转化E coli DH5α感受态细胞菌液涂
布含氨苄青霉素（100µgmL）**脂板37℃培养箱中夜
次日挑取单菌落接种10 mL含氨苄青霉素（25µgmL）LB
液体培养基中37℃200rpm振荡培养12～16 h取10 mL菌液
TaKaRa Plasmid Minipreps Kit说明书抽提质粒
pcDNA6His™ A
227质粒pcDNA6His™ A酶切
EcoRⅠXbaⅠ双酶切质粒pcDNA6His™ A反应体系：
试剂
体积（μL）
10×M buffer 10
01％BSA 10
XbaⅠ 5
EcoRⅠ 5
pcDNA6His™ A质粒 30
ddH2O 补100
混匀离心37℃酶切4h
228质粒酶切产物回收
操作步骤223
229 PCR产物pcDNA6His™ A质粒载体连接
XbaⅠEcoRⅠ酶切回收PCR产物pcDNA6His™ A质粒载
体T4 DNA连接酶作4℃连接夜反应体系：
试剂 体积（μL）
10×Ligation buffer 1
PCR酶切回收产物 2
pcDNA6His™ A质粒酶切回收产物 5
T4 DNA连接酶 1
ddH2O 补10
2210连接产物转化Ecoli DH5α感受态细胞
取229中连接产物转化Ecoli DH5α感受态细胞步骤
1）取70℃冻存感受态细胞冰融化加入连接产物5µL
轻轻混匀冰浴30min
2）42℃水浴热激90s迅速放回冰2min
3）加入800µL LB液体培养基37℃ 200rpm220rpm振荡培养
45min恢复质粒抗性
4）4℃4000rpm离心5min弃清液600µL剩余200µL
菌液混匀涂布氨苄板37℃培养30min培养皿正放菌
液吸收完全皿倒置培养约12~16h单菌落出现
2211 克隆菌落PCR鉴定
挑取2单菌落接种3mL含氨苄青霉素（25µgmL）LB培养
液中37℃振荡培养12h取菌液进行PCR检测时设立空白
反应体系：
试剂 体积（μL）
10×EX Taq buffer 2
菌液 05
dNTPs 2
游引物 05
游引物 05
EX Taq 01
ddH2O 补20
PCR扩增反应程序：94℃预变性3min94℃ 45s55℃ 45s
72℃ 60s30循环72℃ 延伸10min产物10**脂糖
凝胶（含05 μgmL EB）电泳进行检测
3 结果
31 Tg ap基扩增
测序含插入目基pMD18T载体JM108菌液
质粒分模板重新设计引物扩增Tg ap基阅读框扩
增结果见图3**脂糖凝胶点样孔13出现约930bp
片段条带清晰非特异性条带预期（930bp）相
致表明已扩增Tg ap基样品2没扩增成功
图 3 Tg ap基编码序列PCR扩增电泳图
M：Marker DL2000 1：样品1 2：样品2 3：样品3
32 PCR产物酶切pcDNA6His™ A质粒酶切电泳鉴定
分取PCR产物酶切产物pcDNA6His™ A质粒酶切产物
10**脂糖凝胶进行电泳电泳结果图4
图4双酶切鉴定
M：Marker DL2000 1：PCR产物双酶切产物 2 ：质粒
双酶切产物
33 Tg ap基pcDNA6His™ A表达质粒构建
表达质粒pcDNA6ap构建示意图见图5示Tg ap基PCR
扩增纯化回收然EcoRⅠXba I双酶切质粒
pcDNA6His™ A样EcoRⅠXba I双酶切酶切PCR产
物酶切质粒T4 DNA连接酶4℃夜连接连接产物转
化肠杆菌感受态细胞DH5α含氨苄青霉素（100µgmL）
**脂板筛选37℃培养箱中夜获重组阳性肠杆菌菌
落挑取阳性转化子含氨苄青霉素（25µgmL）LB液体培
养基中夜培养菌液模板进行PCR鉴定抽提质粒作酶切
鉴定构建重组质粒命名pcDNA6ap
图5 表达质粒pcDNA6ap构建示意图
34 克隆菌落PCR鉴**果
Tg ap基PCR产物pcDNA6His™ A质粒相酶切连接
转化肠杆菌DH5α感受态细胞含氨苄青霉素（100µgmL
）**脂板筛选37℃培养箱中夜获重组阳性肠杆菌
菌落机挑取2菌落菌液进行PCR扩增均条
约930bp特异性条带预期致空白DNA
片段初步鉴定2菌落阳性克隆图6
图6克隆菌落PCR结果
M：Marker DL2000 1～2：菌落12号PCR结果 3：空白
35 重组质粒pcDNA6ap酶切鉴定
测序插入目基pMD18T载体质粒模板PCR
产物pPIczαC质粒分EcoRⅠXbaⅠ两酶双酶切
回收分连接酶试剂盒T4连接酶连接转入肠杆菌
DH5α感受态细胞挑取单菌落挑选PCR鉴定阳性菌
落量扩增提取质粒pCDNA6ap质粒模板进行PCR鉴定
时pCDNA6ap质粒EcoRⅠXbaⅠ两酶进行双酶切
EcoRⅠ单酶切未酶切pCDNA6ap质粒作结果：
pCDNA6ap质粒模板进行PCR扩增1条约
1000bp特异条带EcoRⅠ单酶切重组质粒仅1条
2000bp特异条带EcoRⅠXbaⅠ双酶切pCDNA6ap质粒
获1条约930bp片段1条2000bp片段表明Tg
ap基已插入表达质粒pcDNA6His™ A中图7
图7重组质粒pCDNA6ap酶切鉴定
Marker：Marker DL2000 1双酶切 2单酶切 3没酶切
pCDNA6ap质粒
36重组质粒pCDNA6ap序列测定
挑选PCR限制性切酶分析均正确阳性克隆送**博尚
生物技术限公司进行核苷酸序列测定结果证实：pCDNA6
ap质粒中目基核苷酸序列阅读框架均正确
4 讨
41 Tg ap基序列扩增
确保插入目片段序列正确阅读框完整根已
克隆Tg ap基序列游引物5’端引入EcoRⅠ 酶切位
点时加入两保护性碱基保证错位游引物5’
端引入XbaⅠ酶切位点带终止密码子利pcDNA6His™ A
身终止密码子
42 质粒pcDNA6His™ A载体表达系统
试验中采pcDNA6His™ A质粒表达系统含PCMV启动子
增强子够数哺乳动物细胞中高水表达含牛
生长激素（BGH）基转录终止序列聚腺苷酸化信号肽
转录目基mRNA含聚腺苷酸尾巴助维
持mRNA稳定性外带组氨酸(6xHis) 限制性标签
利蛋白纯化检测该载体非常核算
疫苗载体
谓核酸疫苗DNA疫苗编码病原生物保护性抗原基
重组真核表达质粒中通皮肤肌肉注射等途径接种动物
细胞表达编码目蛋白组织相容性MHC
Ⅰ结合呈递细胞表面刺激机体产生免疫应答目蛋白免
疫动物细胞表达助形成天然空间构相保持抗原
性诱导高水特异性抗体体液免疫细胞免疫应答重
组蛋白疫苗相具优势：1制备容易成低储
存运输方便简单2易制备价疫苗诱导针种
抗原表位抗病原体免疫3天然抗原形式体
长期表达持续刺激免疫系统效提呈产生持久免疫
应答4病毒载体相质粒载体免疫原性低5表达
源性抗原短肽形式递呈MHCⅠ时抗原释放细胞
外MHCⅡ类分子抗原提呈利诱导产生细胞免疫体
液免疫应答实验成功构建鸽毛滴虫核酸表达重组质粒
pcDNA6ap
5 结
Tg ap基片段插入真核表达载体质粒pcDNA6His™ A
获表达Tg ap重组质粒pcDNA6ap利pcDNA6His™ A
质粒进步研制核酸疫苗提供研制鸽毛滴虫基工程
疫苗奠定基础
致 谢
文够利完成离开许支持帮助首先感谢
导师李国清教授李教授文设计实验开展予全面
指导支持李教授严谨治学作风渊博学术知识积极
探索精神终身受益导师学生活中予指导
关怀顾学生终生忘导师致衷心感谢
博士生罗锋师兄徐前明师兄杨建伟师兄刘霞师姐仅
文设计技术方面予全面细致指导学
生活予微关心顾致
真诚感谢兽医寄生虫学研究室莫细师姐**光辉师兄等
指导表示感谢
班陈建新教授学五年里帮助时常
关心生活学谨文报答陈老师谢谢老师关爱
感谢父亲母亲姐姐等家学年默默支
持帮助学生活丰富彩
谨提未提予关心支持帮助老师
学朋友表示诚挚谢意
参 考 文 献
[1] 师俊 逐鸽**(J) **科技199923435
[3] 麦麦提吐尔逊•阿布热合曼 鸽毛滴虫病诊断治疗(J)
**畜牧业 2007163
[4] 胡保丰钱达清陈建新等核酸疫苗特点畜禽疫病
防制应前景(J) **畜牧兽医20072910
[5] Donnelly JJ F riedman A M artinez D et al P
reclinical efficacy of a p ro to type DNA vaccine
enhanced p ro tection against antigenic drift in
influenza virus [ J ] N at M ed 1995 1 (6) 583～
587
J．萨姆布鲁克E．F．弗里奇T．曼尼阿蒂斯 著．1992．分
子克隆：实验指南（第二版）[M]．金冬雁黎孟枫等 译．北
京：科学出版社 p891893
王春凤**泽荣孙哲等 2001 thyA基选择压力非抗性
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马静云曹永长毕英佐等2004 FMDV 免疫活性串联片段FA
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周光前Hazrimarstmm SDNA疫苗接种免疫学机理优越性
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刘晓辉梁述文王伟等 1999 截短型胰岛素样生长子
É肠杆菌中表达纯化鉴定（J） 中国生物化学分子
生物学报15(5)738741
The Establishment of Cloning Expression System of the
Adhesion Protein Gene AP of Trichomonas Gallinae from
Pigeon
Chen Rui
(College of Veterinary Medicine South China
Agricultural University Guangzhou 510642China)
Abstract
To construct and identify the Tg adhesion protein ( ap)
gene eukaryotic expression plasmid Based on the
requirement of pcDNA6His™ A vector and the gene Tg ap
which was got from our laboratory two pairs of primers
were disigned The ap gene was amplified by PCR with
pMD18ap plasmid then ap gene and pcDNA6His™ A vector
were digested by XbaⅠand EcoRⅠfinaly ap gene was
cloned to pcDNA6His™ A vector using T4 DNA connection
enzyme and the recombinant was translated into Ecoli
DH5α After the recombinant was confirmed by PCR and
double enzymatical digestionthe one which was
identified as masculine was send to restriction analysis
by gene company The electrophoresis result showed that
the size of the ap gene amplified by PCR technique was
930bp Ap gene and pcDNA6His™ A vector were recombined
after they were both digested by XbaⅠand EcoRⅠ The
recombinant plasmid pcDNA6ap was confirmed by PCR and
double enzymatical digestionthe one which was
identified as masculine was send to sequence the
result indicated that its size was 930bp exactly the
same as Tg apThus it could conclude that the ap gene
was cloned into pcDNA6His™ A successfully this will
provides basis for gene engineering vaccine of Tg from
pigeon
Key words Trichomonas gallinae adhesion protein gene
eukaryotic expression
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构建鸽毛滴虫粘附蛋白基真核表达系统根
pcDNA6His™ A载体求实验室获Tg ap基行
设计引物已构建pMD18ap质粒模板扩增目基
目片段pcDNA6His™ A空载体EcoRⅠXbaⅠ双酶
切酶切目基pcDNA6His™ A载体T4连接酶
连接转化肠杆菌DH5α中构建重组真核表达载体
然PCR双酶切鉴定鉴定阳性克隆送测序公司测
序结果：PCR扩增目片段电泳检测条长约930 bp
目基片段双酶切目基pcDNA6His™ A载体连
接获重组质粒PCR酶切鉴定鉴定阳性克隆送
测序公司测序获基序列进行分析该基片段含
长约930bp阅读框Tg ap基序列完全致说明Tg ap
基成功克隆pcDNA6His™ A真核表达载体中研制鸽毛
滴虫基工程疫苗奠定基础
关键词：鸽毛滴虫 粘附蛋白基 真核表达
文常缩写词
缩写词 英文全称 中文全称
AMP Ampicillin 氨苄青霉素
bp Base pair 碱基
DNA Deoxyrubonucleic acid 脱氧核糖核酸
g gram 克
h hour 时
L Liter 升
LB Lauria broth LB肉汤培养基
mg Milligram 毫克
min Minite 分钟
mL Milliliter 毫升
mol Mole 摩尔
PCR Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应
pH power of hydrogen pH值
rpm Revolutions per minite 分钟转数
s second 秒
Tg Trichomonas gallinae 鸽毛滴虫
μL Microlitre
微升
目 录
1前言 1
2 材料方法 3
21 材料 3
211质粒 3
212 酶类试剂 4
213培养基常溶液 4
214仪器 5
22方法 5
221引物设计合成 5
222 Tg ap基序列扩增 6
223 PCR产物回收纯化 6
224 PCR产物酶切 7
225 酶切产物回收 7
226 pcDNA6His™ A质粒量制备 8
227质粒pcDNA6His™ A酶切 8
228质粒酶切产物回收 8
229 PCR产物pcDNA6His™ A质粒载体连接 8
2210连接产物转化Ecoli DH5α感受态细胞 9
2211 克隆菌落PCR鉴定 9
3 结果 10
31 TG AP基扩增 10
32 PCR产物酶切PCDNA6HIS™ A质粒酶切电泳鉴定
11
33 TG AP基PCDNA6HIS™ A表达质粒构建 11
34 克隆菌落PCR鉴**果 12
35 重组质粒PCDNA6AP酶切鉴定 13
36重组质粒PCDNA6AP序列测定 14
4 讨 14
41 TG AP基序列扩增 14
42 质粒PCDNA6HIS™ A载体表达系统 14
5 结 15
致谢 16
参考文献 17
英文摘………………………………………………………………
………………………18
1前言
着国济发展民生活水日益提高民商品乳鸽
消费成倍增长特猪肉涨价许更乐购买鸽子
养鸽业发展前景观市场潜力国际市场
欧美东南亚等国家市场相广阔素鸽胜九鸡称
鸽代鸡鸽成宴趋势[1] 年**省养鸽业发展
迅速出现许万鸽场出现10万型鸽
场年存栏量达2000万商品乳鸽3~4亿国
养鸽省份外鸽子温驯易饲养适合散养
许许农户繁养
鸽子量养殖衍生许许问题鸽毛滴虫病首
该病鸽毛滴虫引起鸽毛滴虫Rirolta1878年首次
鸽肠中发现病原属原生动物门Protozoa鞭毛纲
Mastigophora动鞭亚纲Zoomastigina鞭毛目
Polymastigida毛滴虫科Trichomonadidae（Wenyon1926）毛
滴虫属（Trichomonas Donne1837）鸽毛滴虫（Trichomonas
gallinae）（Rivolta1878Stabler1938）鸽毛滴虫病种
侵害消化道段原虫病发生虫体量繁殖
破坏消化道粘膜表层等引起系列疾病问题鸽毛滴
虫局限口咽粘膜表面分泌物中繁殖病鸽口咽粘膜溃疡
发生干酪样坏死脓性炎症病理组织学变化[2]
目前约20野鸽60家鸽病带虫者正常
情况鸽子表现明显床症状断感染新鸽群
样病鸽群中连绵断许成鸽症状
带虫者常鸽子特乳鸽传染源消灭成
鸽体病原预防控制病重途径
病发生春夏两季传播途径消化道消化道病
病原虫通常寄生损害部位病鸽口腔溃疡病灶虫体聚
集点唾液量虫体 病鸽带虫鸽传染源
鸽群间通成年鸽接吻嗉囊乳哺育幼鸽途径直接感
染种特禽类疾病传染途径通饮水创伤感
染[3]
防治方面目前传统做法例病鸽隔离饲养
加强饲养理环境消毒药物治疗等效
达防治效果研制鸽毛滴虫疫苗防治鸽毛滴虫病
新思路希研制出种新型价廉量生产
范围防治鸽毛滴虫病疫苗
核酸疫苗(nucleic vaccine)年新兴种疫苗
编码某种抗原蛋白外源基(DNARNA)直接导入动物体细胞
宿细胞中通宿细胞转录系统合成抗原蛋白诱导
宿产生该抗原蛋白免疫应答获相应免疫保护
预防治疗疫病称基疫苗[4]
核酸疫苗独特优点吸引着：(1)抗原合成递呈程
病原然感染相似通MHC Ⅰ类Ⅱ类分子直接递呈免疫
系统特特异性CD8＋淋巴细胞(CTL)免疫反应灭活
疫苗亚单位疫苗拟(2)免疫原单性编码
需抗原基导入细胞表达载体身没抗原性重组
病毒活载体疫苗目基表达外庞复杂免疫
蛋白(3)易构建制备核酸疫苗涉基方面操作
象第1 代减毒活疫苗样需放射线防护设施 象第
2 代蛋白肽疫苗样需细胞培养蛋白纯化等复杂程
稳定性贮存方便成低廉适规模化生产(4) 免疫具
持续性 次接种获长期免疫力 避免灭活疫苗重组
亚单位疫苗等需次加强免疫繁琐（5）种异株交叉保
护作 采种株间保守DNA 序列作核酸疫苗
免疫作突破理株限制 甲型流感病毒中已证
实[5]
实验通扩增鸽毛滴虫粘附蛋白基插入
pcDNA6His™ A载体中构建重组真核表达载体进步研
制核酸疫苗奠定基础
2 材料方法
21 材料
211质粒
pcDNA6His™ AInvitrogen产品**省农科院兽医研究
寄生虫研究室购买提供pcDNA6His™ A 载体长52 kb
PCMV (Human cytomegalovirus immediateearly promoter)启
动子数哺乳动物细胞高水瞬时表达重组蛋白N
末端肽编码Xpress™ 抗原决定簇组氨酸(6xHis) 限制性
标签(见图12)
图 1 pcDNA6His™ A 克隆位点
图2 pcDNA6His™ A结构示意图
212 酶类试剂
限制性切酶EcoRⅠXbaⅠ相应缓液EXTaq DNA聚合酶
缓液dNTPsT4DNA连接酶2000bp分子量标记总RNA
抽提试剂盒RNAiso ReagentMiniBEST Plasmid Purification
Kit Ver20DNA胶回收试剂盒质粒DNA抽提试剂盒均**
TaKaRa产品酚氯仿异戊醇（25241）溶液购**生工生
物工程公司DEPCXgalIPTG**脂糖溴化乙锭（EB）购
宝泰克生物科技限公司
Ecoli DH5α感受态细胞**兽医学院寄生虫实验室
刘霞硕士生提供
213培养基常溶液
LB液体培养基：Tryptone 10gYeast Extract 5gNaCl 10g
加双蒸水定容1000mL高压灭菌20 min4℃保存
LB固体培养基：LB液体培养基中加入**脂粉终浓度16（
wv）高压灭菌分装灭菌皿凝固4℃保存
含氨苄青霉素（100µgmL）**脂板：灭菌LB固体培养
基温度降50℃左右时加入氨苄青霉素终浓度100µgmL
分装灭菌皿凝固4℃保存
氨苄青霉素贮存液：三蒸水配成浓度100mgmL022µm滤
膜滤菌分装20℃保存
双蒸水：Millipore超纯水仪制备成
电泳缓液TBE(10×)配制：称取Trisbase 108g硼酸55g
加入05molL EDTA(pH80) 20mL加离子水定溶1000mL
10**脂糖凝胶配制：称取10 g**脂糖三角瓶中加入
10mL 10×TBE缓液加水定容100mL加热溶解加入5μ
L EB(10mgmL)锡纸封住瓶口常温保存
214仪器
PCR Express Gradient PCR仪：HYBAID公司产品
REVCO超低温冰箱(80℃)：美国REVCO
Orbital Shaker：USA Thermo forma
LRH250A生化培养箱：**省医疗仪器厂
CS101AB型电热鼓风干燥箱：**试验设备厂
Eppendorf5804R低温高速离心机：Germany Eppendorf
Eppendorf centrifuge5415D台式高速离心机：Germany
Eppendorf
Eppendorf BiopHotometer：Germany Eppendorf
METTLER TOLEDO AB204E分析天：**思尔达科学仪器限公
司
SWCJ1FD超净工作台：**净化设备厂
HSGⅡC4电热恒温水浴锅：**市**仪器厂
全封闭紫外透射仪（WFH201B）：**市深华生物技术限公
司产品
凝胶成象分析系统：英国UVITEC公司产品
BioRAD电泳系统：美国BioRad公司产品
SHZ88型水浴恒温振荡器：**省**市医疗仪器厂
22方法
221引物设计合成
根已克隆Tg ap基序列重新设计引物扩增Tg
ap基游引物5’端引入EcoRⅠ 酶切位点游引物
5’端引入XbaⅠ酶切位点带终止密码子拟扩增长度约
930bpDNA片段
游引物：5'ATGGAATTCTGATGCTCTCCTCTTCCTTCG 3'
游引物：5'ATGCTAGAGGATCTTGCCCATTCTCTTCAT3'
222 Tg ap基序列扩增
测序含插入目基pMD18T载体JM108菌液
质粒分模板新设计引物进行PCR扩增反应程序
：94℃预变性3min94℃ 45s55℃ 45s72℃ 60s30循
环72℃ 延伸10min反应体系：
试剂 体积（μL）
10×EX Tap buffer 5
模板 05
dNTPs 4
游引物 1
游引物 1
EX Taq 025
ddH2O 补50
述反应体系混匀离心PCR仪进行扩增述程序执
行完毕10**脂糖凝胶（含05μgmL溴化乙锭EB）电
泳检测PCR产物130V电压进行电泳15min紫外灯
观察电泳结果
223 PCR产物回收纯化
具体操作步骤：
1) TBE缓液制作**脂糖凝胶然PCR产物进行**脂糖
凝胶电泳
2) 电泳紫外灯切凝胶中含目条带胶块纸巾吸
胶块表面液体放入预先称重量空15mL Ep中
3) 切碎胶块切碎加快胶块融化时间提高DNA回收
率
4) 装胶块Ep放电子天次称重计算胶块重
量1mg1uL 计算胶块体积
5) 胶块中加入胶块融化液DRI Buffer体积胶块体积3
倍
6) 均匀混合75℃加热融化胶块间摇动Ep2－3次
胶粒完全融化
7) 述胶块溶化液中加入DRI Buffer量12体积量DRII
Buffer均匀混合
8) 试剂盒中 Spin column 安置Collection Tube
9) 述步骤7溶液转移Spin column12000rpm离心1min
弃滤液
10) 500uLRinse A 加入Spin column中12000rpm离心30s
弃滤液
11) 700uLRinse B 加入Spin column中12000rpm离心30s
弃滤液
12) 重复步骤11)
13) Spin column安置新15mL离心Spin
column膜中央处加入25uLElution Buffer室温静置1min
14) 12000rpm离心1min收集滤液（滤液回收DNA）
置4℃冰箱保存备
224 PCR产物酶切
EcoRⅠXbaⅠ双酶切纯化PCR产物反应体系：
试剂 体积（μL）
10×M buffer 10
01％BSA 10
XbaⅠ 5
EcoRⅠ 5
PCR产物 30
ddH2O 补100
混匀离心37℃酶切4h
225 酶切产物回收
具体操作步骤223
226 pcDNA6His™ A质粒量制备
取pcDNA6His™ A质粒转化E coli DH5α感受态细胞菌液涂
布含氨苄青霉素（100µgmL）**脂板37℃培养箱中夜
次日挑取单菌落接种10 mL含氨苄青霉素（25µgmL）LB
液体培养基中37℃200rpm振荡培养12～16 h取10 mL菌液
TaKaRa Plasmid Minipreps Kit说明书抽提质粒
pcDNA6His™ A
227质粒pcDNA6His™ A酶切
EcoRⅠXbaⅠ双酶切质粒pcDNA6His™ A反应体系：
试剂
体积（μL）
10×M buffer 10
01％BSA 10
XbaⅠ 5
EcoRⅠ 5
pcDNA6His™ A质粒 30
ddH2O 补100
混匀离心37℃酶切4h
228质粒酶切产物回收
操作步骤223
229 PCR产物pcDNA6His™ A质粒载体连接
XbaⅠEcoRⅠ酶切回收PCR产物pcDNA6His™ A质粒载
体T4 DNA连接酶作4℃连接夜反应体系：
试剂 体积（μL）
10×Ligation buffer 1
PCR酶切回收产物 2
pcDNA6His™ A质粒酶切回收产物 5
T4 DNA连接酶 1
ddH2O 补10
2210连接产物转化Ecoli DH5α感受态细胞
取229中连接产物转化Ecoli DH5α感受态细胞步骤
1）取70℃冻存感受态细胞冰融化加入连接产物5µL
轻轻混匀冰浴30min
2）42℃水浴热激90s迅速放回冰2min
3）加入800µL LB液体培养基37℃ 200rpm220rpm振荡培养
45min恢复质粒抗性
4）4℃4000rpm离心5min弃清液600µL剩余200µL
菌液混匀涂布氨苄板37℃培养30min培养皿正放菌
液吸收完全皿倒置培养约12~16h单菌落出现
2211 克隆菌落PCR鉴定
挑取2单菌落接种3mL含氨苄青霉素（25µgmL）LB培养
液中37℃振荡培养12h取菌液进行PCR检测时设立空白
反应体系：
试剂 体积（μL）
10×EX Taq buffer 2
菌液 05
dNTPs 2
游引物 05
游引物 05
EX Taq 01
ddH2O 补20
PCR扩增反应程序：94℃预变性3min94℃ 45s55℃ 45s
72℃ 60s30循环72℃ 延伸10min产物10**脂糖
凝胶（含05 μgmL EB）电泳进行检测
3 结果
31 Tg ap基扩增
测序含插入目基pMD18T载体JM108菌液
质粒分模板重新设计引物扩增Tg ap基阅读框扩
增结果见图3**脂糖凝胶点样孔13出现约930bp
片段条带清晰非特异性条带预期（930bp）相
致表明已扩增Tg ap基样品2没扩增成功
图 3 Tg ap基编码序列PCR扩增电泳图
M：Marker DL2000 1：样品1 2：样品2 3：样品3
32 PCR产物酶切pcDNA6His™ A质粒酶切电泳鉴定
分取PCR产物酶切产物pcDNA6His™ A质粒酶切产物
10**脂糖凝胶进行电泳电泳结果图4
图4双酶切鉴定
M：Marker DL2000 1：PCR产物双酶切产物 2 ：质粒
双酶切产物
33 Tg ap基pcDNA6His™ A表达质粒构建
表达质粒pcDNA6ap构建示意图见图5示Tg ap基PCR
扩增纯化回收然EcoRⅠXba I双酶切质粒
pcDNA6His™ A样EcoRⅠXba I双酶切酶切PCR产
物酶切质粒T4 DNA连接酶4℃夜连接连接产物转
化肠杆菌感受态细胞DH5α含氨苄青霉素（100µgmL）
**脂板筛选37℃培养箱中夜获重组阳性肠杆菌菌
落挑取阳性转化子含氨苄青霉素（25µgmL）LB液体培
养基中夜培养菌液模板进行PCR鉴定抽提质粒作酶切
鉴定构建重组质粒命名pcDNA6ap
图5 表达质粒pcDNA6ap构建示意图
34 克隆菌落PCR鉴**果
Tg ap基PCR产物pcDNA6His™ A质粒相酶切连接
转化肠杆菌DH5α感受态细胞含氨苄青霉素（100µgmL
）**脂板筛选37℃培养箱中夜获重组阳性肠杆菌
菌落机挑取2菌落菌液进行PCR扩增均条
约930bp特异性条带预期致空白DNA
片段初步鉴定2菌落阳性克隆图6
图6克隆菌落PCR结果
M：Marker DL2000 1～2：菌落12号PCR结果 3：空白
35 重组质粒pcDNA6ap酶切鉴定
测序插入目基pMD18T载体质粒模板PCR
产物pPIczαC质粒分EcoRⅠXbaⅠ两酶双酶切
回收分连接酶试剂盒T4连接酶连接转入肠杆菌
DH5α感受态细胞挑取单菌落挑选PCR鉴定阳性菌
落量扩增提取质粒pCDNA6ap质粒模板进行PCR鉴定
时pCDNA6ap质粒EcoRⅠXbaⅠ两酶进行双酶切
EcoRⅠ单酶切未酶切pCDNA6ap质粒作结果：
pCDNA6ap质粒模板进行PCR扩增1条约
1000bp特异条带EcoRⅠ单酶切重组质粒仅1条
2000bp特异条带EcoRⅠXbaⅠ双酶切pCDNA6ap质粒
获1条约930bp片段1条2000bp片段表明Tg
ap基已插入表达质粒pcDNA6His™ A中图7
图7重组质粒pCDNA6ap酶切鉴定
Marker：Marker DL2000 1双酶切 2单酶切 3没酶切
pCDNA6ap质粒
36重组质粒pCDNA6ap序列测定
挑选PCR限制性切酶分析均正确阳性克隆送**博尚
生物技术限公司进行核苷酸序列测定结果证实：pCDNA6
ap质粒中目基核苷酸序列阅读框架均正确
4 讨
41 Tg ap基序列扩增
确保插入目片段序列正确阅读框完整根已
克隆Tg ap基序列游引物5’端引入EcoRⅠ 酶切位
点时加入两保护性碱基保证错位游引物5’
端引入XbaⅠ酶切位点带终止密码子利pcDNA6His™ A
身终止密码子
42 质粒pcDNA6His™ A载体表达系统
试验中采pcDNA6His™ A质粒表达系统含PCMV启动子
增强子够数哺乳动物细胞中高水表达含牛
生长激素（BGH）基转录终止序列聚腺苷酸化信号肽
转录目基mRNA含聚腺苷酸尾巴助维
持mRNA稳定性外带组氨酸(6xHis) 限制性标签
利蛋白纯化检测该载体非常核算
疫苗载体
谓核酸疫苗DNA疫苗编码病原生物保护性抗原基
重组真核表达质粒中通皮肤肌肉注射等途径接种动物
细胞表达编码目蛋白组织相容性MHC
Ⅰ结合呈递细胞表面刺激机体产生免疫应答目蛋白免
疫动物细胞表达助形成天然空间构相保持抗原
性诱导高水特异性抗体体液免疫细胞免疫应答重
组蛋白疫苗相具优势：1制备容易成低储
存运输方便简单2易制备价疫苗诱导针种
抗原表位抗病原体免疫3天然抗原形式体
长期表达持续刺激免疫系统效提呈产生持久免疫
应答4病毒载体相质粒载体免疫原性低5表达
源性抗原短肽形式递呈MHCⅠ时抗原释放细胞
外MHCⅡ类分子抗原提呈利诱导产生细胞免疫体
液免疫应答实验成功构建鸽毛滴虫核酸表达重组质粒
pcDNA6ap
5 结
Tg ap基片段插入真核表达载体质粒pcDNA6His™ A
获表达Tg ap重组质粒pcDNA6ap利pcDNA6His™ A
质粒进步研制核酸疫苗提供研制鸽毛滴虫基工程
疫苗奠定基础
致 谢
文够利完成离开许支持帮助首先感谢
导师李国清教授李教授文设计实验开展予全面
指导支持李教授严谨治学作风渊博学术知识积极
探索精神终身受益导师学生活中予指导
关怀顾学生终生忘导师致衷心感谢
博士生罗锋师兄徐前明师兄杨建伟师兄刘霞师姐仅
文设计技术方面予全面细致指导学
生活予微关心顾致
真诚感谢兽医寄生虫学研究室莫细师姐**光辉师兄等
指导表示感谢
班陈建新教授学五年里帮助时常
关心生活学谨文报答陈老师谢谢老师关爱
感谢父亲母亲姐姐等家学年默默支
持帮助学生活丰富彩
谨提未提予关心支持帮助老师
学朋友表示诚挚谢意
参 考 文 献
[1] 师俊 逐鸽**(J) **科技199923435
[3] 麦麦提吐尔逊•阿布热合曼 鸽毛滴虫病诊断治疗(J)
**畜牧业 2007163
[4] 胡保丰钱达清陈建新等核酸疫苗特点畜禽疫病
防制应前景(J) **畜牧兽医20072910
[5] Donnelly JJ F riedman A M artinez D et al P
reclinical efficacy of a p ro to type DNA vaccine
enhanced p ro tection against antigenic drift in
influenza virus [ J ] N at M ed 1995 1 (6) 583～
587
J．萨姆布鲁克E．F．弗里奇T．曼尼阿蒂斯 著．1992．分
子克隆：实验指南（第二版）[M]．金冬雁黎孟枫等 译．北
京：科学出版社 p891893
王春凤**泽荣孙哲等 2001 thyA基选择压力非抗性
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É肠杆菌中表达纯化鉴定（J） 中国生物化学分子
生物学报15(5)738741
The Establishment of Cloning Expression System of the
Adhesion Protein Gene AP of Trichomonas Gallinae from
Pigeon
Chen Rui
(College of Veterinary Medicine South China
Agricultural University Guangzhou 510642China)
Abstract
To construct and identify the Tg adhesion protein ( ap)
gene eukaryotic expression plasmid Based on the
requirement of pcDNA6His™ A vector and the gene Tg ap
which was got from our laboratory two pairs of primers
were disigned The ap gene was amplified by PCR with
pMD18ap plasmid then ap gene and pcDNA6His™ A vector
were digested by XbaⅠand EcoRⅠfinaly ap gene was
cloned to pcDNA6His™ A vector using T4 DNA connection
enzyme and the recombinant was translated into Ecoli
DH5α After the recombinant was confirmed by PCR and
double enzymatical digestionthe one which was
identified as masculine was send to restriction analysis
by gene company The electrophoresis result showed that
the size of the ap gene amplified by PCR technique was
930bp Ap gene and pcDNA6His™ A vector were recombined
after they were both digested by XbaⅠand EcoRⅠ The
recombinant plasmid pcDNA6ap was confirmed by PCR and
double enzymatical digestionthe one which was
identified as masculine was send to sequence the
result indicated that its size was 930bp exactly the
same as Tg apThus it could conclude that the ap gene
was cloned into pcDNA6His™ A successfully this will
provides basis for gene engineering vaccine of Tg from
pigeon
Key words Trichomonas gallinae adhesion protein gene
eukaryotic expression
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