附件6
动物源性食品中喹诺酮类物质快速检测
胶体金免疫层析法
(KJ201906)
1 范围
方法规定动物源性食品中喹诺酮类物质胶体金免疫层析快速检测方法
方法适生乳巴氏杀菌乳灭菌乳猪肉猪肝猪肾中洛美沙星培氟沙星氧氟沙星诺氟沙星达氟沙星二氟沙星恩诺沙星环丙沙星氟甲喹噁喹酸残留快速测定
2 原理
方法采竞争抑制免疫层析原理样品中喹诺酮类物质胶体金标记特异性抗体结合抑制抗体检测线（T线）抗原结合导致检测线颜色深浅变化通检测线控制线（C线）颜色深浅较样品中喹诺酮类物质进行定性判定
3 试剂材料
规定外方法试剂均分析纯水GBT 6682规定二级水
31 试剂
311 乙腈
312 甲酸
313 分散固相萃取剂I：分称取硫酸镁18 g醋酸钠45 g放研钵中研碎
314 分散固相萃取剂II：分称取硫酸镁27 gN丙基乙二胺（PSA）45 g放研钵中研碎
315 甲酸乙腈溶液：98 mL乙腈中加入2 mL甲酸混匀
316 甲醇
317 稀释液：脱脂奶粉︰水（1︰10）
32 参考物质
喹诺酮类参考物质中文名称英文名称CAS登录号分子式相分子量见表1纯度≥99
表1 喹诺酮类参考物质中文名称英文名称CAS登录号分子式相分子量
序号
中文名称
英文名称
CAS登录号
分子式
相分子量
1
洛美沙星
Lomefloxacin
98079517
C17H19F2N3O3
35135
2
培氟沙星
Pefloxacin
70458923
C17H20FN3O3
33336
3
氧氟沙星
Ofloxacin
82419361
C18H20FN3O4
36137
4
诺氟沙星
Norfloxacin
70458967
C16H18FN3O3
31933
5
达氟沙星
Danofloxacin
112398080
C19H20FN3O3
35738
6
二氟沙星
Difloxacin
5522394
C28H33N3F2
44958
7
恩诺沙星
Enrofloxacin
93106606
C19H22FN3O3
35916
8
环丙沙星
Ciprofloxacin
85721331
C17H18FN3O3
33113
9
氟甲喹
Flumequine
42835256
C14H12FNO3
26125
10
噁喹酸
Oxolinic Acid
14698294
C13H11NO5
26123
注：等溯源物质
33 标准溶液配制
331喹诺酮类物质标准储备液（1 mgmL）：分精密称取喹诺酮类参考物质（32）适量置50 mL烧杯中加入适量甲醇（316）超声溶解甲醇转入10 mL容量瓶中定容刻度摇匀配制成浓度1 mgmL喹诺酮标准储备液20℃避光保存效期6月
332喹诺酮类物质标准中间液（1 μgmL）：分吸取喹诺酮类标准储备液（1 mgmL）（331）100 μL100 mL容量瓶中甲醇（316）稀释刻度摇匀配制成浓度1 μgmL喹诺酮类标准中间液
34 材料
341 金标微孔（含胶体金标记特异性抗体）
342 试剂条检测卡
4 仪器设备
41 移液器：100 μL200 μL1 mL
42 涡旋混合器
43 离心机：转速≥4000 rmin
44 电子天：感量001 g
45 孵育器：调节时间温度控温精度±1℃
46 读数仪
47 氮吹仪
48 环境条件：温度15℃～35℃湿度≤80（采孵育器读数仪时求环境温度）
5 分析步骤
51 试样制备
液体乳直接测定猪肉猪肝猪肾组织捣碎机等搅碎备
52 试样提取
521 生乳巴氏杀菌乳灭菌乳
分吸取等体积液体乳样品稀释液混合测液
522 猪肉猪肝猪肾
准确称取25±001 g均质组织样品15 mL离心中加入5 mL甲酸乙腈溶液（315）涡旋混合1 min振荡5 min4000 rmin离心5 min清液2 mL转入10 mL 离心中分加入06 g分散固相萃取剂I(313)漩涡混合1 min加入06 g分散固相萃取剂II(314)漩涡混合1 min静置分层取1 mL10 mL 离心中氮吹仪60℃吹干1 mL样品稀释液溶解作测液
53 测定步骤
531 检测卡测定步骤
5311检测卡放入孵育器中心撕开检测卡薄膜指示线处避免提起检测卡海绵
5312移液器取测液（52）300 μL避免产生泡沫气泡竖直缓慢滴加检测卡两侧意侧凹槽中粘箔重新粘
5313盖孵育器盖子孵育器计时器动开始计时红灯闪烁孵育3 min
5314 取出检测卡挤压样品槽放读数仪中读数前保持样品槽端直读数仪读取结果孵育器取出直接目视法进行结果判定
532试剂条金标微孔测定步骤
吸取300 μL测液（52）金标微孔（341）中抽吸5～10次混合均匀试剂条（342）吸水海绵端垂直插入金标微孔中孵育5～8 min微孔中取出试剂条进行结果判定
注：试剂条（检测卡）具体检测步骤参考相应说明书操作
54 质控试验
批样品应时进行空白试验加标质控试验
541 空白试验
称取空白试样5253步骤样品法操作
542 加标质控试验
准确称取空白试样（精确001 g）置具塞离心中加入定体积诺氟沙星标准中间液诺氟沙星终浓度6 μgkg5253步骤样品法操作
6 结果判定
61 读数仪测定法
读数仪说明书求操作直接读取进行结果判定
62 目视法
通控制线（C线）检测线（T线）颜色深浅进行结果判定目视判定示意图见图1
621 效
控制线（C线）显色表明正确操作试剂条检测卡效
622 阴性
检测线（T线）颜色控制线（C线）颜色深者检测线（T线）颜色控制线（C线）颜色相表明样品中喹诺酮类低方法检测限判定阴性
623 阳性
检测线（T线）显色检测线（T线）颜色控制线（C线）颜色浅表明样品中喹诺酮类含量高方法检测限判定阳性
63 质控试验求
空白试验测定结果应阴性加标质控试验测定结果应阳性
图1 目视判定示意图
7 结
检测结果阳性时应结果进行确证
8 性指标
81 检测限
生乳巴氏杀菌乳灭菌乳猪肉猪肝猪肾中洛美沙星培氟沙星氧氟沙星诺氟沙星达氟沙星二氟沙星恩诺沙星环丙沙星氟甲喹噁喹酸3 μgkg
82 灵敏度
灵敏度应≥99
83 特异性
特异性应≥95
84 假阴性率
假阴性率应≤1
85 假阳性率
假阳性率应≤5
注：性指标计算方法见附录A
9
方法述试剂试剂盒信息操作步骤方法者提供方便方法时做限定方法者代试剂试剂盒操作步骤前须进行考察应满足方法规定项性指标
方法参标准GBT 213122007 动物源性食品中14种喹诺酮药物残留检测方法 液相色谱质谱质谱法附录A
定性方法性指标计算方法
表A1 性指标计算表
样品情况a
检测结果b
总数
阳性
阴性
阳性
N11
N12
N1N11+N12
阴性
N21
N22
N2N21+N22
总数
N1N11+N12
N2N21+N22
NN1+N2N1+N2
显著性差异（х2）
c2（|N12N21|1）2（N12+N21）
度（df）1
灵敏度（p+）
p+N11N1
特异性（p）
pN22N2
假阴性率（pf）
pfN12N1100灵敏度
假阳性率（pf+）
pf+N21N2100特异性
相准确度c
（N11+N22）（N1+N2）
注：
a参方法检验结果者样品中实际公议值结果
b确认方法检验结果灵敏度计算确认结果
N：特定单元结果数第标指行第二标指列例：N11表示第行第列N1表示第行N2表示第二列N12表示第行第二列
C方法检测结果相准确性结果致性分析浓度检测趋势情况综合评价
方法负责起草单位：黑龙江省质量监督检测研究院
验证单位：国家农林副产品质量监督检验中心国家乳制品质量监督检验中心海南省药品检验
起草：佟晓芳杨光赵陈薇薇李春娟姜金斗王玉芝陈坚
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动物源性食品中喹诺酮类物质快速检测
胶体金免疫层析法
(KJ201906)
1 范围
方法规定动物源性食品中喹诺酮类物质胶体金免疫层析快速检测方法
方法适生乳巴氏杀菌乳灭菌乳猪肉猪肝猪肾中洛美沙星培氟沙星氧氟沙星诺氟沙星达氟沙星二氟沙星恩诺沙星环丙沙星氟甲喹噁喹酸残留快速测定
2 原理
方法采竞争抑制免疫层析原理样品中喹诺酮类物质胶体金标记特异性抗体结合抑制抗体检测线（T线）抗原结合导致检测线颜色深浅变化通检测线控制线（C线）颜色深浅较样品中喹诺酮类物质进行定性判定
3 试剂材料
规定外方法试剂均分析纯水GBT 6682规定二级水
31 试剂
311 乙腈
312 甲酸
313 分散固相萃取剂I：分称取硫酸镁18 g醋酸钠45 g放研钵中研碎
314 分散固相萃取剂II：分称取硫酸镁27 gN丙基乙二胺（PSA）45 g放研钵中研碎
315 甲酸乙腈溶液：98 mL乙腈中加入2 mL甲酸混匀
316 甲醇
317 稀释液：脱脂奶粉︰水（1︰10）
32 参考物质
喹诺酮类参考物质中文名称英文名称CAS登录号分子式相分子量见表1纯度≥99
表1 喹诺酮类参考物质中文名称英文名称CAS登录号分子式相分子量
序号
中文名称
英文名称
CAS登录号
分子式
相分子量
1
洛美沙星
Lomefloxacin
98079517
C17H19F2N3O3
35135
2
培氟沙星
Pefloxacin
70458923
C17H20FN3O3
33336
3
氧氟沙星
Ofloxacin
82419361
C18H20FN3O4
36137
4
诺氟沙星
Norfloxacin
70458967
C16H18FN3O3
31933
5
达氟沙星
Danofloxacin
112398080
C19H20FN3O3
35738
6
二氟沙星
Difloxacin
5522394
C28H33N3F2
44958
7
恩诺沙星
Enrofloxacin
93106606
C19H22FN3O3
35916
8
环丙沙星
Ciprofloxacin
85721331
C17H18FN3O3
33113
9
氟甲喹
Flumequine
42835256
C14H12FNO3
26125
10
噁喹酸
Oxolinic Acid
14698294
C13H11NO5
26123
注：等溯源物质
33 标准溶液配制
331喹诺酮类物质标准储备液（1 mgmL）：分精密称取喹诺酮类参考物质（32）适量置50 mL烧杯中加入适量甲醇（316）超声溶解甲醇转入10 mL容量瓶中定容刻度摇匀配制成浓度1 mgmL喹诺酮标准储备液20℃避光保存效期6月
332喹诺酮类物质标准中间液（1 μgmL）：分吸取喹诺酮类标准储备液（1 mgmL）（331）100 μL100 mL容量瓶中甲醇（316）稀释刻度摇匀配制成浓度1 μgmL喹诺酮类标准中间液
34 材料
341 金标微孔（含胶体金标记特异性抗体）
342 试剂条检测卡
4 仪器设备
41 移液器：100 μL200 μL1 mL
42 涡旋混合器
43 离心机：转速≥4000 rmin
44 电子天：感量001 g
45 孵育器：调节时间温度控温精度±1℃
46 读数仪
47 氮吹仪
48 环境条件：温度15℃～35℃湿度≤80（采孵育器读数仪时求环境温度）
5 分析步骤
51 试样制备
液体乳直接测定猪肉猪肝猪肾组织捣碎机等搅碎备
52 试样提取
521 生乳巴氏杀菌乳灭菌乳
分吸取等体积液体乳样品稀释液混合测液
522 猪肉猪肝猪肾
准确称取25±001 g均质组织样品15 mL离心中加入5 mL甲酸乙腈溶液（315）涡旋混合1 min振荡5 min4000 rmin离心5 min清液2 mL转入10 mL 离心中分加入06 g分散固相萃取剂I(313)漩涡混合1 min加入06 g分散固相萃取剂II(314)漩涡混合1 min静置分层取1 mL10 mL 离心中氮吹仪60℃吹干1 mL样品稀释液溶解作测液
53 测定步骤
531 检测卡测定步骤
5311检测卡放入孵育器中心撕开检测卡薄膜指示线处避免提起检测卡海绵
5312移液器取测液（52）300 μL避免产生泡沫气泡竖直缓慢滴加检测卡两侧意侧凹槽中粘箔重新粘
5313盖孵育器盖子孵育器计时器动开始计时红灯闪烁孵育3 min
5314 取出检测卡挤压样品槽放读数仪中读数前保持样品槽端直读数仪读取结果孵育器取出直接目视法进行结果判定
532试剂条金标微孔测定步骤
吸取300 μL测液（52）金标微孔（341）中抽吸5～10次混合均匀试剂条（342）吸水海绵端垂直插入金标微孔中孵育5～8 min微孔中取出试剂条进行结果判定
注：试剂条（检测卡）具体检测步骤参考相应说明书操作
54 质控试验
批样品应时进行空白试验加标质控试验
541 空白试验
称取空白试样5253步骤样品法操作
542 加标质控试验
准确称取空白试样（精确001 g）置具塞离心中加入定体积诺氟沙星标准中间液诺氟沙星终浓度6 μgkg5253步骤样品法操作
6 结果判定
61 读数仪测定法
读数仪说明书求操作直接读取进行结果判定
62 目视法
通控制线（C线）检测线（T线）颜色深浅进行结果判定目视判定示意图见图1
621 效
控制线（C线）显色表明正确操作试剂条检测卡效
622 阴性
检测线（T线）颜色控制线（C线）颜色深者检测线（T线）颜色控制线（C线）颜色相表明样品中喹诺酮类低方法检测限判定阴性
623 阳性
检测线（T线）显色检测线（T线）颜色控制线（C线）颜色浅表明样品中喹诺酮类含量高方法检测限判定阳性
63 质控试验求
空白试验测定结果应阴性加标质控试验测定结果应阳性
图1 目视判定示意图
7 结
检测结果阳性时应结果进行确证
8 性指标
81 检测限
生乳巴氏杀菌乳灭菌乳猪肉猪肝猪肾中洛美沙星培氟沙星氧氟沙星诺氟沙星达氟沙星二氟沙星恩诺沙星环丙沙星氟甲喹噁喹酸3 μgkg
82 灵敏度
灵敏度应≥99
83 特异性
特异性应≥95
84 假阴性率
假阴性率应≤1
85 假阳性率
假阳性率应≤5
注：性指标计算方法见附录A
9
方法述试剂试剂盒信息操作步骤方法者提供方便方法时做限定方法者代试剂试剂盒操作步骤前须进行考察应满足方法规定项性指标
方法参标准GBT 213122007 动物源性食品中14种喹诺酮药物残留检测方法 液相色谱质谱质谱法附录A
定性方法性指标计算方法
表A1 性指标计算表
样品情况a
检测结果b
总数
阳性
阴性
阳性
N11
N12
N1N11+N12
阴性
N21
N22
N2N21+N22
总数
N1N11+N12
N2N21+N22
NN1+N2N1+N2
显著性差异（х2）
c2（|N12N21|1）2（N12+N21）
度（df）1
灵敏度（p+）
p+N11N1
特异性（p）
pN22N2
假阴性率（pf）
pfN12N1100灵敏度
假阳性率（pf+）
pf+N21N2100特异性
相准确度c
（N11+N22）（N1+N2）
注：
a参方法检验结果者样品中实际公议值结果
b确认方法检验结果灵敏度计算确认结果
N：特定单元结果数第标指行第二标指列例：N11表示第行第列N1表示第行N2表示第二列N12表示第行第二列
C方法检测结果相准确性结果致性分析浓度检测趋势情况综合评价
方法负责起草单位：黑龙江省质量监督检测研究院
验证单位：国家农林副产品质量监督检验中心国家乳制品质量监督检验中心海南省药品检验
起草：佟晓芳杨光赵陈薇薇李春娟姜金斗王玉芝陈坚
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