马铃薯中提取甘皮素通PI3KAkt介导Nrf2信号通路体外保护胃皮细胞免受H2O2诱导氧化损伤
研究旨探讨马铃薯新提取物抗氧化机制采高效液相色谱法(HPLC)马铃薯中提取4种色素马铃薯红素丹皮素麦维丁天竺葵苷结果显示浓度氧化氢(甘皮素)处理胃粘膜皮细胞(gs 1)细胞形态细胞活力着时间推移发生显著改变(P < 005)Paeonin甘皮素处理细胞表现出强抗氧化作种作时间剂量赖are 荧光素酶活性甘皮素1 mRNA表达甘皮素暴露细胞Paeonin预处理Keap1Nrf2甘皮素1NQO1蛋白表达明显调外甘皮素+ Paeonin组Nrf2表达免疫染色时间明显升高 甘皮素+ Paeonin组GSH含量明显低甘皮素+ Paeonin + GSK690693组2 Paeonin通增强Cyclin D1p27蛋白表达促进细胞周期外Paeonin通增加Bcl2总Caspase3总Caspase8蛋白表达抑制甘皮素处理细胞凋亡降低BaxpCaspase3pCaspase8蛋白表达结果提示丹皮素通激活Nrf2信号通路改变细胞周期凋亡发挥抗氧化作
慢性胃炎腺癌十二指肠胃溃疡胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤等胃疾病医疗系统带巨济负担严重降低生活质量需国际关注帮助解决疾病造成全球疾病负担越越实验床证表明数情况慢性氧化应激增加胃疾病病理特征胃疾病次进展中起重作例乙醇诱导鼠胃溃疡引起脂质氧化丙二醛升高终导致粘膜氧化应激损伤予抗氧化剂抗氧化酶通抑制氧化应激损伤乙醇性胃溃疡保护作
氧化应激定义活性氧(ROS)生成源性抗氧化防御系统失衡正常生理条件哺乳动物细胞产生ROS通抗氧化防御分子谷胱甘肽超氧化物歧化酶氧化氢酶氧化物酶硫氧蛋白等效降解然异常量活性氧生成会导致缺少生物分子严重氧化损伤包括蛋白质脂类核酸种活性氧中氧化氢(甘皮素)种稳定带电荷分子作生理第二信细胞膜扩散阶段繁殖氧化循环启动脂质氧化线粒体损伤DNA损伤等广泛应体外诱导氧化应激
根述研究果干预策略够改善氧化应激程相关途径适改善胃病床症状然核子 e2相关子2 (Nrf2)抗氧化反应元件(ARE)信号通路细胞抵抗氧化应激机制蛋白产物参解毒消反应性氧化剂基表达外许研究者认富含抗氧化剂食物苹果草莓番茄胡萝卜等够清活性氧终降低胃粘膜氧化损伤风险研究中试图探索马铃薯成分提取物抗氧化作抑制氧化应激损伤进步探讨材料Nrf2ARE信号通路抑制氧化应激损伤中潜机制
材料方法
细胞培养氧化氢(甘皮素)处理
胃粘膜皮细胞系gs 1细胞购American Type Culture Collection (ATCC)Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI1640吉布科德国)完全培养基补充10胎牛血清(胎牛血清5 CO湿化环境中隔2天更换培养基gs 1细胞达80~90融合时025胰蛋白酶(Sigma USA)消化细胞进行传代培养gs 1细胞1×10细胞孔密度接种6孔板中置37℃5湿培养箱中夜 达80融合GES1细胞处理0μM 100μMμM 200400μM 甘皮素 24 h根细胞生存力考试选择合适浓度实验细胞行性分析简单说根制造商说明浓度MTT试剂盒(Promega USA)处理gs 1细胞进行3(45二甲基噻唑2yl)25二苯基四唑溴化铵(MTT)测定细胞存活率22 然培养GES1细胞浓度甘皮素were镀96 孔板24 h然孵化20μl 5毫克毫升MTT试剂37°C 4 h150μl二甲亚砜(DMSO)解决方案添加紫色甲瓒晶体溶解伴着连续摇晃室温15分钟吸光度包括空白没细胞美国BioRad分光光度计490 nm波长测量 外根实验结果选择gs 1细胞中甘皮素处理细胞活力值进步检测选择甘皮素concentration孵育0 h3 h6 h12 h24 hgs 1细胞活力
采高效液相色谱法马铃薯中色素提取进行研究色素土豆中提取出化学试剂购美国费雪科学公司根相关制造商协议然Agilent HPLC仪器(Agilent USA)提取色素进行分析仪器G1311A四元泵G1322A气器G1314A紫外(UV)检测仪G1316A柱HPLC ChemStation软件组成分析条件C柱21×75 mm防护柱(径46 mm)(安捷伦美国)18流动相溶液(甲酸酸化水pH 30)B溶液(甲醇)呈阶梯梯度流速05 mlmin检测波长525nm处观察
抗氧化反应元件(ARE)荧光素酶活性测定制造商建议Lipofectamine2000 (Invitrogen美国)gs 1细胞接种24孔板中中国Biolab获报告基质粒转染gs 1细胞中TM 转染24时转染细胞治疗400年μM 甘皮素alone400μM 甘皮素 +四提取色素分24 h终AREluciferase测量通添加荧光素酶活性测定试剂(美国Promega)根制造商指导方针分光光度计波长490纳米外根实验结果选择AREluciferase活动GES1细胞甘皮素 +色素治疗进步研究AREluciferase活动GES1细胞浓度选择颜料孵化1 h 2 h 4 h 8 h 12 h24 h
定量逆转录聚合酶链反应(qRTPCR)检测Trizol试剂(TIANGEN China)制造商说明分离述处理收获gs 1细胞总RNADNase处理(Thermo USA)清RNA制剂中污染基组DNA长串互补DNA合成(互补)05 mRNAμg总RNA进行PrimeScript 7500快速实时试剂盒RT PCR(日豆类系统)(Applied Quantitative Biosystems analysis USA)根制造商协议血红素a氧合酶1 SYBR®Premix (甘皮素1)Ex Taq™II (Tli RNaseH Plus)试剂盒变性PCR条件1周期30年代95°C然95°C 40周期变性5 s退火60°C 34 s(数收集60°C步骤周期)离解15秒95°C 60°C 1分钟15秒95°C甘皮素1定量数化18S rRNA表达水2法计算−ΔΔCt 18qRTPCR引物序列甘皮素1正引物5 ＇ TGAAGGAGGCCACCAAGGAGGA3 ＇ 甘皮素1反引物5 ＇ agaggtcacccgtagcggg 3 ＇18S rRNA正引物5 ＇ CCTGGATACCGCA GCTAGGA3 ＇ 18S rRNA反引物5 ＇ GCGGCGCAATACGAATGCCCC3 ＇
免疫蛋白印记(WB)GES1细胞样品孵化μM 甘皮素 400 + 200μg 毫升Paeonin 0 h 1 h 2 h 4 h 8 h 12 h24时收集通MTT实验测量细胞生存力面描述样世行Nrf信号pathwayrelated蛋白质分析全细胞溶解产物中样品准备precooled radioimmunoprecipitation化验(里帕)裂解缓(美国热)包含50 mM TrisHCl (pH值75)150毫米氯化钠01诺清洁剂p 40蛋白酶抑制剂混合物磷酸酶抑制剂冰40分钟总蛋白质浓度BCA量化分析工具(Beyotime中国)牛血清白蛋白(BSA)作标准细胞溶解产物混合2×加载缓区(Beyotime中国)煮沸变性8分钟然解决8 ~ 10钠十二烷基sulfatepolyacrylamide凝胶电泳(sds page)(30μg )跑15 h恒定电压120 V蛋白质转移聚偏二氟乙烯(PVDF)膜2 h恒流200 mA封锁5脱脂牛奶室温2时兔子孵化antiNrf2抗体(11000稀释兔抗甘皮素 1抗(11000稀释兔抗nqo1抗(12000稀释兔抗p甘皮素sp甘皮素 akt (pAkt)抗(11000稀释兔抗akt抗(12000稀释美国Abcam)鼠标antiβactin(11000稀释作部控制美国阿布卡姆)4℃夜01 t吐温20 (TBST)三次tris缓盐水广泛洗分相应二抗(山羊抗鼠IgG山羊抗兔IgG)膜进行检测(均5脱脂牛奶112000稀释)室温放置1时然TBST洗涤3次增效化学发光试剂(Beyotime中国)ImageQuant LAS 4000 mini系统(GE Healthcare日)检测印迹ImageJ软件分析蛋白条带密度
谷胱甘肽(GSH)含量检查GES1细胞镀6well菜(1×105细胞)第二天细胞暴露甘皮素alone鸿燊+ Paeonin甘皮素 + Paeonin + GSK690693 (PI3K Akt信号通路抑制剂)24 h然刮细胞细胞溶解5偏磷酸冰 12000rmp离心10分钟商品化GSH测定试剂盒(中国南京建成生物科技限公司)检测清液中细胞GSH水分光光度计400nm处读取样品吸光度
免疫荧光显微镜(IF)gs 1细胞接种12孔板预先放置菌玻璃容器放置37℃5培养箱中夜第二天细胞孵化甘皮素alone甘皮素 + Paeonin 2 h 8 h12 h指定时间治疗细胞磷酸缓盐(PBS)两次室温4聚甲醛固定30分钟然1 permeabilized Triton x 100 10分钟5 BSA阻塞30分钟37°C antiNerf抗体细胞染色(110 0稀释)夜间4°C PBS洗涤3次pe标记山羊抗兔二抗(11000稀释(美国)37℃孵育1时PBS洗涤3次1 mgmlDAPI (Beyotime China)复染细胞5分钟抗褪色试剂(Solarbio China)复染细胞激光扫描聚焦显微镜(莱卡德国)观察捕获图
流式细胞术检测甘皮素and处理gs 1细胞细胞周期凋亡情况评估Paeonin作FACSCalibur系统(BD Biosciences USA)进行流式细胞术实验细胞周期分析收集细胞PBS洗涤离心 20℃70乙醇中夜细胞染色400μl染色解决方案包含100毫克毫升核糖核酸酶A40毫克毫升propidium碘(π)黑暗中30分钟37°C紧流式细胞术分析细胞凋亡分析收集细胞样PBS离心机250年resuspendedμl膜联蛋白V绑定缓FITCAnnexin V凋亡检测试剂盒(Beyotime China)37°C条件FITCAnnexin VPI黑暗中进行双重染色15分钟根制造商协议流式细胞仪30分钟细胞进行分析外通述操作通WB测定细胞周期相关蛋白(Cyclin D1p27)凋亡相关蛋白(Bcl2Caspase3Caspase8Bax)进步揭示甘皮素alone甘皮素+ Paeonin处理gs 1细胞细胞周期凋亡分布
数统计分析研究数均采SPSS 180软件(IBM SPSS USA)进行分析实验均进行少3次生物重复数均数±标准差(SD)表示采单素方差分析(ANOVA)评估两组间差异两组间较采双尾t检验P值005显著性
结果：
氧化损伤模型建立研究甘皮素氧化损伤浓度甘皮素at处理gs 1细胞发现GES1细胞0μM 甘皮素treatment形态正常GES1细胞浓度甘皮素treatment显示完整细胞形态特400年μM 甘皮素group(图1)外细胞生存力率400年μM 甘皮素group明显低三组(图1 b)外研究发现400年μM 甘皮素induced例减少细胞生存时间方式(图1 c) 选择400μM作佳剂量24时作续实验佳时期
图1示：建立甘皮素is诱导gs 1细胞氧化损伤模型(A)形态变化GES1细胞暴露4浓度甘皮素包括0μM 100μM 200μM400μM(B)通MTT法测定浓度甘皮素gs 1细胞活力影响细胞活力呈剂量赖性逐渐降* P < 005(C) 400年影响μM胡恩GES1细胞细胞生存力0 h 3 h 6 h12 h24 h细胞生存力逐渐降时间方式 * P < 005
马铃薯中提取四种色素修复甘皮素处理gs 1细胞氧化损伤结果显示马铃薯中分离出四种色素马铃薯球蛋白丹皮素麦维丁天竺葵色素(图2A)确定四种色素否通热处理减轻gs 1细胞氧化损伤gs 1细胞四种色素进行预孵育 结果表明GSE1甘皮素groups相四种色素特丹皮素显著促进稀土荧光素酶活性 稀土荧光素酶活性代表细胞抗氧化状态结果表明四种色素减少甘皮素诱导细胞氧化应激损伤时Paeonin激活AREluciferase reporter高信号选续实验佳色素(图2B)
丹皮素具抗氧化提高细胞活力作证实丹皮酚抗氧化作采浓度丹皮酚gs 1细胞进行时间预处理数表明AREluciferase活动(图3)甘皮素1 mRNA表达(图3 b)GES1细胞浓度Paeonin preincubated治疗400年μM 甘皮素前逐渐增加剂量赖性方式接选择200μg 毫升Paeonin GES1细胞预处理然400μM 甘皮素to孵化0 h 1 h 2 h 4 h 8 h 12 h24 h结果表明AREluciferase活动(图3 c)甘皮素1 mRNA表达(图3 d)时间明显升高GES1细胞甘皮素 + Paeonin治疗外甘皮素+丹皮素处理gs 1细胞中细胞存活率例时间显著调(图4A) 结果表明丹皮素仅具抗氧化作促进氧化损伤细胞模型细胞存活
Nrf2信号通路PI3KAkt信号通路参丹皮素抗氧化机制进步探索Paeonin否激活Nrf2信号通路提高抗氧化作首先通WB检测Nrf2信号相关蛋白表达水结果发现Keap1Nrf2甘皮素1NQO1蛋白表达0 h1 h2 h4 h时表达较弱8 h12 h24 h时表达明显增强(图4B)然pAkt蛋白表达0 h逐渐升高4h4h逐渐降低24h时间点Akt蛋白表达均明显变化(图4B)外IF图显示Nrf2荧光强度时间显著调(图4C)结果提示Paeonin着时间推移激活Nrf2信号通路PI3KAkt信号通路抑制剂(PI3KAkt信号通路抑制剂) GSK690693)证明丹皮素增殖促进作数显示甘皮素and 甘皮素+ Paeonin组相甘皮素+ Paeonin + GSK690693处理导致细胞GSH含量相降(图4D) 认PI3KAkt信号通路参甘皮素处理GSE1细胞氧化损伤修复
丹皮素治疗促进细胞增殖抑制细胞凋亡进步阐明芍药苷甘皮素处理GSE1细胞中修复机制流式细胞术检测细胞周期凋亡图5A示甘皮素显着引起细胞周期阻滞 丹皮素预处理细胞周期改善外发现甘皮素treatment显著促进gs 1细胞凋亡甘皮素+芍药苷处理GSE1细胞凋亡调(图5B) 甘皮素+ Paeonin组细胞周期蛋白D1p27Bcl2总Caspase3总Caspase8表达水明显高甘皮素group甘皮素+ Paeonin组BaxpCaspase3pCaspase8蛋白表达水明显低甘皮素group组(图5C)Image J分析软件通密度测定定量相蛋白表达水图5D示结果表明丹皮素加速甘皮素处理GSE1细胞增殖减缓细胞凋亡
图2：马铃薯中提取色素甘皮素处理gs 1细胞中作(A)采高效液相色谱法检测马铃薯中分离色素四显著峰值((B)马铃薯中提取四种色素预孵育甘皮素处理gs 1细胞检测20 ~ 26分钟AREluciferase活性gs 1甘皮素groups相四种提取色素均提高AREluciferase活性甘皮素处理gs 1细胞中丹皮素诱导产生高稀土荧光素酶活性甘皮素group较*P < 005 **P < 001 ***P < 0001
图3：丹皮素抗氧化作(A) AREluciferase活动荧光素酶试验测量甘皮素stimulated GES1细胞浓度Paeonin包括20μg ml 50μg 毫升100μg 毫升200μg 毫升着丹皮素浓度增加荧光素酶活性升高(B)qRTPCR检测Paeonin浓度甘皮素1细胞中甘皮素1 mRNA表达甘皮素1 mRNA表达芍药苷浓度呈正相关(C)——荧光素酶活性检测荧光素酶测定甘皮素stimulated GES1细胞200μg 毫升Paeonin 1 h 2 h 4 h 8 h12 h24 h治疗时间延长AREluciferase活动差异(D) 甘皮素1信rna测试中存甘皮素incubated GES1细胞200μg 毫升Paeonin 1 h 2 h 4 h 8 h12 h24 h甘皮素1 mRNA表达治疗时间正相关*甘皮素group较P < 005
图4：丹皮素通PI3K akt介导Nrf2信号通路发挥抗氧化作(A)细胞生存力测试通MTT测定甘皮素incubated GES1细胞200μg 毫升Paeonin 0 h 1 h 2 h 4 h 8 h 12 h24 h细胞生存力提出时间增加(B) PI3K Aktmediated Keap1 Nrf2信号通路相关蛋白表达世行甘皮素exposed GES1细胞200μg 毫升Paeonin 0 h 1 h 2 h 4 h 8 h12 h24 h(C)位置表达Nrf2果甘皮素stimulated GES1细胞200μg 毫升Paeonin 2 h 8 h12 h细胞核染成蓝色Nrf2蛋白质染色成红色(D)GSE1甘皮素甘皮素+ Paeonin甘皮素+ Paeonin + GSK690693组中检测GSH含量三组GSH含量均高GSE1组* P < 005
图5：丹皮素细胞周期凋亡影响GSE1细胞分三组GSE1集团甘皮素group甘皮素plus 200μg 毫升Paeonin组 (A)流式细胞术检测细胞周期出具代表性细胞周期图(B)流式细胞术检测细胞凋亡展示细胞凋亡典型图(C)通WB检测细胞周期凋亡相关蛋白中cyclin D1p27细胞周期相关蛋白Bcl2Caspase3pCaspase3Caspase8pCaspase8Bax凋亡相关蛋白GAPDH认源性参考(D)计算cyclin D1p27Bcl2Caspase3pCaspase3Caspase8pCaspase8Bax蛋白相表达直方图表示
讨：
氧化应激胃病发病程中起着重作研究中结果首先表明gs 1细胞暴露出现明显形态变化剂量时间赖性细胞活力丧失研究致结果表明成功建立gs 1细胞氧化应激模型马铃薯中提取色素高效液相色谱法进行纯化外四种分离色素中丹皮素暴露甘皮素gs 1细胞抗氧化作强目前增加饮食抗氧化剂摄入降低胃粘膜氧化损伤佳选择已广泛认识外前研究中已表明花青素提取Jianchuan甘皮素Zhuanxinwu土豆浓度赖方式具强抗氧化活性透露重基清力107 ~ 313倍维生素C表明土豆抗氧化效果进步证实Paeonin保护gs 1细胞免受氧化损伤中作分通荧光素酶检测qRTPCR检测甘皮素处理gs 1细胞中表达抗氧化力are 荧光素酶活性甘皮素1 mRNA表达数显示Paeonin剂量时间赖方式调甘皮素处理gs 1细胞are 荧光素酶活性甘皮素1 mRNA表达表明Paeonin甘皮素处理gs 1细胞中发挥抗氧化作外发现Paeonin处理甘皮素培养gs 1细胞中着时间延长细胞存活率逐渐升高进步说明Paeonin减轻gs 1细胞甘皮素treatment处理细胞损伤
进步挖掘丹皮素抗氧化损伤潜机制越越关注Nrf2信号通路种氧化原敏感转录子正常条件定位细胞质keap1相互作旦激活Nrf2进入细胞核结合靶基启动子抗氧化反应元件导致种抗氧化解毒酶转录终显示出细胞保护作越越研究表明Nrf2通路激活研究治疗胃病治疗靶点 研究发现丹皮素处理甘皮素1细胞中Keap1Nrf2甘皮素1NQO1明显升高外甘皮素处理gs 1细胞中Nrf2荧光强度着丹皮素处理时间延长增强Nrf2认种转录子氧化应激条件kelch样ech相关蛋白1 (Keap1)中解离然进入细胞核ARE结合导致抗氧化基(包括甘皮素1NQO1)转录激活外十年里种研究表明增强核Nrf2改善游基效保护细胞免受氧化应激引起细胞损伤例水杨酸通激活Nrf2信号通路抑制氧化应激诱导脐静脉皮细胞(HUVEC)损伤绿原酸通PI3K akt介导Nrf2甘皮素1信号通路保护鼠成骨细胞MC3T3E1免受甘皮素诱导氧化应激研究结果表明Paeonin通激活Nrf2信号通路阻止甘皮素刺激gs 1细胞氧化损伤外PI3KAkt信号通路激活认Nrf2信号通路激活关键游事件细胞中PI3KAkt信号通路nrf2赖转录方式调节抗氧化基表达应氧化应激时研究中Paeonin处理甘皮素暴露gs 1细胞中pAkt蛋白表达呈抛物线型趋势8 h时达峰值外甘皮素group甘皮素+ Paeonin组相PI3KAkt信号抑制剂GSK690693明显抑制H202+ Paeonin + GSK690693组GSH含量 然细胞中GSH水积累反映氧化应激抑制状态结果表明Paeonin抗氧化保护作PI3K akt介导Nrf2信号通路介导
结：
通流式细胞术WB检测细胞周期凋亡情况数表明丹皮素治疗显著改善甘皮素细胞周期阻滞gs 1细胞凋亡影响 目前已证实甘皮素诱导细胞周期阻滞凋亡细胞损伤关键指标外甘皮素刺激gs 1细胞相WB实验验证Paeonin促进细胞周期相关Cyclin D1p27抗凋亡相关Bcl2蛋白表达抑制促凋亡相关BaxpCaspase3pCaspase8蛋白表达22结果提示丹皮素甘皮素诱导细胞损伤效
综述提供第证证明土豆中提取丹皮素通种机制少部分赖PI3K akt介导Nrf2信号通路激活甘皮素诱导氧化应激损伤产生细胞保护作研究强调丹皮素作逆转胃部疾病氧化应激新靶点价值
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研究旨探讨马铃薯新提取物抗氧化机制采高效液相色谱法(HPLC)马铃薯中提取4种色素马铃薯红素丹皮素麦维丁天竺葵苷结果显示浓度氧化氢(甘皮素)处理胃粘膜皮细胞(gs 1)细胞形态细胞活力着时间推移发生显著改变(P < 005)Paeonin甘皮素处理细胞表现出强抗氧化作种作时间剂量赖are 荧光素酶活性甘皮素1 mRNA表达甘皮素暴露细胞Paeonin预处理Keap1Nrf2甘皮素1NQO1蛋白表达明显调外甘皮素+ Paeonin组Nrf2表达免疫染色时间明显升高 甘皮素+ Paeonin组GSH含量明显低甘皮素+ Paeonin + GSK690693组2 Paeonin通增强Cyclin D1p27蛋白表达促进细胞周期外Paeonin通增加Bcl2总Caspase3总Caspase8蛋白表达抑制甘皮素处理细胞凋亡降低BaxpCaspase3pCaspase8蛋白表达结果提示丹皮素通激活Nrf2信号通路改变细胞周期凋亡发挥抗氧化作
慢性胃炎腺癌十二指肠胃溃疡胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤等胃疾病医疗系统带巨济负担严重降低生活质量需国际关注帮助解决疾病造成全球疾病负担越越实验床证表明数情况慢性氧化应激增加胃疾病病理特征胃疾病次进展中起重作例乙醇诱导鼠胃溃疡引起脂质氧化丙二醛升高终导致粘膜氧化应激损伤予抗氧化剂抗氧化酶通抑制氧化应激损伤乙醇性胃溃疡保护作
氧化应激定义活性氧(ROS)生成源性抗氧化防御系统失衡正常生理条件哺乳动物细胞产生ROS通抗氧化防御分子谷胱甘肽超氧化物歧化酶氧化氢酶氧化物酶硫氧蛋白等效降解然异常量活性氧生成会导致缺少生物分子严重氧化损伤包括蛋白质脂类核酸种活性氧中氧化氢(甘皮素)种稳定带电荷分子作生理第二信细胞膜扩散阶段繁殖氧化循环启动脂质氧化线粒体损伤DNA损伤等广泛应体外诱导氧化应激
根述研究果干预策略够改善氧化应激程相关途径适改善胃病床症状然核子 e2相关子2 (Nrf2)抗氧化反应元件(ARE)信号通路细胞抵抗氧化应激机制蛋白产物参解毒消反应性氧化剂基表达外许研究者认富含抗氧化剂食物苹果草莓番茄胡萝卜等够清活性氧终降低胃粘膜氧化损伤风险研究中试图探索马铃薯成分提取物抗氧化作抑制氧化应激损伤进步探讨材料Nrf2ARE信号通路抑制氧化应激损伤中潜机制
材料方法
细胞培养氧化氢(甘皮素)处理
胃粘膜皮细胞系gs 1细胞购American Type Culture Collection (ATCC)Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI1640吉布科德国)完全培养基补充10胎牛血清(胎牛血清5 CO湿化环境中隔2天更换培养基gs 1细胞达80~90融合时025胰蛋白酶(Sigma USA)消化细胞进行传代培养gs 1细胞1×10细胞孔密度接种6孔板中置37℃5湿培养箱中夜 达80融合GES1细胞处理0μM 100μMμM 200400μM 甘皮素 24 h根细胞生存力考试选择合适浓度实验细胞行性分析简单说根制造商说明浓度MTT试剂盒(Promega USA)处理gs 1细胞进行3(45二甲基噻唑2yl)25二苯基四唑溴化铵(MTT)测定细胞存活率22 然培养GES1细胞浓度甘皮素were镀96 孔板24 h然孵化20μl 5毫克毫升MTT试剂37°C 4 h150μl二甲亚砜(DMSO)解决方案添加紫色甲瓒晶体溶解伴着连续摇晃室温15分钟吸光度包括空白没细胞美国BioRad分光光度计490 nm波长测量 外根实验结果选择gs 1细胞中甘皮素处理细胞活力值进步检测选择甘皮素concentration孵育0 h3 h6 h12 h24 hgs 1细胞活力
采高效液相色谱法马铃薯中色素提取进行研究色素土豆中提取出化学试剂购美国费雪科学公司根相关制造商协议然Agilent HPLC仪器(Agilent USA)提取色素进行分析仪器G1311A四元泵G1322A气器G1314A紫外(UV)检测仪G1316A柱HPLC ChemStation软件组成分析条件C柱21×75 mm防护柱(径46 mm)(安捷伦美国)18流动相溶液(甲酸酸化水pH 30)B溶液(甲醇)呈阶梯梯度流速05 mlmin检测波长525nm处观察
抗氧化反应元件(ARE)荧光素酶活性测定制造商建议Lipofectamine2000 (Invitrogen美国)gs 1细胞接种24孔板中中国Biolab获报告基质粒转染gs 1细胞中TM 转染24时转染细胞治疗400年μM 甘皮素alone400μM 甘皮素 +四提取色素分24 h终AREluciferase测量通添加荧光素酶活性测定试剂(美国Promega)根制造商指导方针分光光度计波长490纳米外根实验结果选择AREluciferase活动GES1细胞甘皮素 +色素治疗进步研究AREluciferase活动GES1细胞浓度选择颜料孵化1 h 2 h 4 h 8 h 12 h24 h
定量逆转录聚合酶链反应(qRTPCR)检测Trizol试剂(TIANGEN China)制造商说明分离述处理收获gs 1细胞总RNADNase处理(Thermo USA)清RNA制剂中污染基组DNA长串互补DNA合成(互补)05 mRNAμg总RNA进行PrimeScript 7500快速实时试剂盒RT PCR(日豆类系统)(Applied Quantitative Biosystems analysis USA)根制造商协议血红素a氧合酶1 SYBR®Premix (甘皮素1)Ex Taq™II (Tli RNaseH Plus)试剂盒变性PCR条件1周期30年代95°C然95°C 40周期变性5 s退火60°C 34 s(数收集60°C步骤周期)离解15秒95°C 60°C 1分钟15秒95°C甘皮素1定量数化18S rRNA表达水2法计算−ΔΔCt 18qRTPCR引物序列甘皮素1正引物5 ＇ TGAAGGAGGCCACCAAGGAGGA3 ＇ 甘皮素1反引物5 ＇ agaggtcacccgtagcggg 3 ＇18S rRNA正引物5 ＇ CCTGGATACCGCA GCTAGGA3 ＇ 18S rRNA反引物5 ＇ GCGGCGCAATACGAATGCCCC3 ＇
免疫蛋白印记(WB)GES1细胞样品孵化μM 甘皮素 400 + 200μg 毫升Paeonin 0 h 1 h 2 h 4 h 8 h 12 h24时收集通MTT实验测量细胞生存力面描述样世行Nrf信号pathwayrelated蛋白质分析全细胞溶解产物中样品准备precooled radioimmunoprecipitation化验(里帕)裂解缓(美国热)包含50 mM TrisHCl (pH值75)150毫米氯化钠01诺清洁剂p 40蛋白酶抑制剂混合物磷酸酶抑制剂冰40分钟总蛋白质浓度BCA量化分析工具(Beyotime中国)牛血清白蛋白(BSA)作标准细胞溶解产物混合2×加载缓区(Beyotime中国)煮沸变性8分钟然解决8 ~ 10钠十二烷基sulfatepolyacrylamide凝胶电泳(sds page)(30μg )跑15 h恒定电压120 V蛋白质转移聚偏二氟乙烯(PVDF)膜2 h恒流200 mA封锁5脱脂牛奶室温2时兔子孵化antiNrf2抗体(11000稀释兔抗甘皮素 1抗(11000稀释兔抗nqo1抗(12000稀释兔抗p甘皮素sp甘皮素 akt (pAkt)抗(11000稀释兔抗akt抗(12000稀释美国Abcam)鼠标antiβactin(11000稀释作部控制美国阿布卡姆)4℃夜01 t吐温20 (TBST)三次tris缓盐水广泛洗分相应二抗(山羊抗鼠IgG山羊抗兔IgG)膜进行检测(均5脱脂牛奶112000稀释)室温放置1时然TBST洗涤3次增效化学发光试剂(Beyotime中国)ImageQuant LAS 4000 mini系统(GE Healthcare日)检测印迹ImageJ软件分析蛋白条带密度
谷胱甘肽(GSH)含量检查GES1细胞镀6well菜(1×105细胞)第二天细胞暴露甘皮素alone鸿燊+ Paeonin甘皮素 + Paeonin + GSK690693 (PI3K Akt信号通路抑制剂)24 h然刮细胞细胞溶解5偏磷酸冰 12000rmp离心10分钟商品化GSH测定试剂盒(中国南京建成生物科技限公司)检测清液中细胞GSH水分光光度计400nm处读取样品吸光度
免疫荧光显微镜(IF)gs 1细胞接种12孔板预先放置菌玻璃容器放置37℃5培养箱中夜第二天细胞孵化甘皮素alone甘皮素 + Paeonin 2 h 8 h12 h指定时间治疗细胞磷酸缓盐(PBS)两次室温4聚甲醛固定30分钟然1 permeabilized Triton x 100 10分钟5 BSA阻塞30分钟37°C antiNerf抗体细胞染色(110 0稀释)夜间4°C PBS洗涤3次pe标记山羊抗兔二抗(11000稀释(美国)37℃孵育1时PBS洗涤3次1 mgmlDAPI (Beyotime China)复染细胞5分钟抗褪色试剂(Solarbio China)复染细胞激光扫描聚焦显微镜(莱卡德国)观察捕获图
流式细胞术检测甘皮素and处理gs 1细胞细胞周期凋亡情况评估Paeonin作FACSCalibur系统(BD Biosciences USA)进行流式细胞术实验细胞周期分析收集细胞PBS洗涤离心 20℃70乙醇中夜细胞染色400μl染色解决方案包含100毫克毫升核糖核酸酶A40毫克毫升propidium碘(π)黑暗中30分钟37°C紧流式细胞术分析细胞凋亡分析收集细胞样PBS离心机250年resuspendedμl膜联蛋白V绑定缓FITCAnnexin V凋亡检测试剂盒(Beyotime China)37°C条件FITCAnnexin VPI黑暗中进行双重染色15分钟根制造商协议流式细胞仪30分钟细胞进行分析外通述操作通WB测定细胞周期相关蛋白(Cyclin D1p27)凋亡相关蛋白(Bcl2Caspase3Caspase8Bax)进步揭示甘皮素alone甘皮素+ Paeonin处理gs 1细胞细胞周期凋亡分布
数统计分析研究数均采SPSS 180软件(IBM SPSS USA)进行分析实验均进行少3次生物重复数均数±标准差(SD)表示采单素方差分析(ANOVA)评估两组间差异两组间较采双尾t检验P值005显著性
结果：
氧化损伤模型建立研究甘皮素氧化损伤浓度甘皮素at处理gs 1细胞发现GES1细胞0μM 甘皮素treatment形态正常GES1细胞浓度甘皮素treatment显示完整细胞形态特400年μM 甘皮素group(图1)外细胞生存力率400年μM 甘皮素group明显低三组(图1 b)外研究发现400年μM 甘皮素induced例减少细胞生存时间方式(图1 c) 选择400μM作佳剂量24时作续实验佳时期
图1示：建立甘皮素is诱导gs 1细胞氧化损伤模型(A)形态变化GES1细胞暴露4浓度甘皮素包括0μM 100μM 200μM400μM(B)通MTT法测定浓度甘皮素gs 1细胞活力影响细胞活力呈剂量赖性逐渐降* P < 005(C) 400年影响μM胡恩GES1细胞细胞生存力0 h 3 h 6 h12 h24 h细胞生存力逐渐降时间方式 * P < 005
马铃薯中提取四种色素修复甘皮素处理gs 1细胞氧化损伤结果显示马铃薯中分离出四种色素马铃薯球蛋白丹皮素麦维丁天竺葵色素(图2A)确定四种色素否通热处理减轻gs 1细胞氧化损伤gs 1细胞四种色素进行预孵育 结果表明GSE1甘皮素groups相四种色素特丹皮素显著促进稀土荧光素酶活性 稀土荧光素酶活性代表细胞抗氧化状态结果表明四种色素减少甘皮素诱导细胞氧化应激损伤时Paeonin激活AREluciferase reporter高信号选续实验佳色素(图2B)
丹皮素具抗氧化提高细胞活力作证实丹皮酚抗氧化作采浓度丹皮酚gs 1细胞进行时间预处理数表明AREluciferase活动(图3)甘皮素1 mRNA表达(图3 b)GES1细胞浓度Paeonin preincubated治疗400年μM 甘皮素前逐渐增加剂量赖性方式接选择200μg 毫升Paeonin GES1细胞预处理然400μM 甘皮素to孵化0 h 1 h 2 h 4 h 8 h 12 h24 h结果表明AREluciferase活动(图3 c)甘皮素1 mRNA表达(图3 d)时间明显升高GES1细胞甘皮素 + Paeonin治疗外甘皮素+丹皮素处理gs 1细胞中细胞存活率例时间显著调(图4A) 结果表明丹皮素仅具抗氧化作促进氧化损伤细胞模型细胞存活
Nrf2信号通路PI3KAkt信号通路参丹皮素抗氧化机制进步探索Paeonin否激活Nrf2信号通路提高抗氧化作首先通WB检测Nrf2信号相关蛋白表达水结果发现Keap1Nrf2甘皮素1NQO1蛋白表达0 h1 h2 h4 h时表达较弱8 h12 h24 h时表达明显增强(图4B)然pAkt蛋白表达0 h逐渐升高4h4h逐渐降低24h时间点Akt蛋白表达均明显变化(图4B)外IF图显示Nrf2荧光强度时间显著调(图4C)结果提示Paeonin着时间推移激活Nrf2信号通路PI3KAkt信号通路抑制剂(PI3KAkt信号通路抑制剂) GSK690693)证明丹皮素增殖促进作数显示甘皮素and 甘皮素+ Paeonin组相甘皮素+ Paeonin + GSK690693处理导致细胞GSH含量相降(图4D) 认PI3KAkt信号通路参甘皮素处理GSE1细胞氧化损伤修复
丹皮素治疗促进细胞增殖抑制细胞凋亡进步阐明芍药苷甘皮素处理GSE1细胞中修复机制流式细胞术检测细胞周期凋亡图5A示甘皮素显着引起细胞周期阻滞 丹皮素预处理细胞周期改善外发现甘皮素treatment显著促进gs 1细胞凋亡甘皮素+芍药苷处理GSE1细胞凋亡调(图5B) 甘皮素+ Paeonin组细胞周期蛋白D1p27Bcl2总Caspase3总Caspase8表达水明显高甘皮素group甘皮素+ Paeonin组BaxpCaspase3pCaspase8蛋白表达水明显低甘皮素group组(图5C)Image J分析软件通密度测定定量相蛋白表达水图5D示结果表明丹皮素加速甘皮素处理GSE1细胞增殖减缓细胞凋亡
图2：马铃薯中提取色素甘皮素处理gs 1细胞中作(A)采高效液相色谱法检测马铃薯中分离色素四显著峰值((B)马铃薯中提取四种色素预孵育甘皮素处理gs 1细胞检测20 ~ 26分钟AREluciferase活性gs 1甘皮素groups相四种提取色素均提高AREluciferase活性甘皮素处理gs 1细胞中丹皮素诱导产生高稀土荧光素酶活性甘皮素group较*P < 005 **P < 001 ***P < 0001
图3：丹皮素抗氧化作(A) AREluciferase活动荧光素酶试验测量甘皮素stimulated GES1细胞浓度Paeonin包括20μg ml 50μg 毫升100μg 毫升200μg 毫升着丹皮素浓度增加荧光素酶活性升高(B)qRTPCR检测Paeonin浓度甘皮素1细胞中甘皮素1 mRNA表达甘皮素1 mRNA表达芍药苷浓度呈正相关(C)——荧光素酶活性检测荧光素酶测定甘皮素stimulated GES1细胞200μg 毫升Paeonin 1 h 2 h 4 h 8 h12 h24 h治疗时间延长AREluciferase活动差异(D) 甘皮素1信rna测试中存甘皮素incubated GES1细胞200μg 毫升Paeonin 1 h 2 h 4 h 8 h12 h24 h甘皮素1 mRNA表达治疗时间正相关*甘皮素group较P < 005
图4：丹皮素通PI3K akt介导Nrf2信号通路发挥抗氧化作(A)细胞生存力测试通MTT测定甘皮素incubated GES1细胞200μg 毫升Paeonin 0 h 1 h 2 h 4 h 8 h 12 h24 h细胞生存力提出时间增加(B) PI3K Aktmediated Keap1 Nrf2信号通路相关蛋白表达世行甘皮素exposed GES1细胞200μg 毫升Paeonin 0 h 1 h 2 h 4 h 8 h12 h24 h(C)位置表达Nrf2果甘皮素stimulated GES1细胞200μg 毫升Paeonin 2 h 8 h12 h细胞核染成蓝色Nrf2蛋白质染色成红色(D)GSE1甘皮素甘皮素+ Paeonin甘皮素+ Paeonin + GSK690693组中检测GSH含量三组GSH含量均高GSE1组* P < 005
图5：丹皮素细胞周期凋亡影响GSE1细胞分三组GSE1集团甘皮素group甘皮素plus 200μg 毫升Paeonin组 (A)流式细胞术检测细胞周期出具代表性细胞周期图(B)流式细胞术检测细胞凋亡展示细胞凋亡典型图(C)通WB检测细胞周期凋亡相关蛋白中cyclin D1p27细胞周期相关蛋白Bcl2Caspase3pCaspase3Caspase8pCaspase8Bax凋亡相关蛋白GAPDH认源性参考(D)计算cyclin D1p27Bcl2Caspase3pCaspase3Caspase8pCaspase8Bax蛋白相表达直方图表示
讨：
氧化应激胃病发病程中起着重作研究中结果首先表明gs 1细胞暴露出现明显形态变化剂量时间赖性细胞活力丧失研究致结果表明成功建立gs 1细胞氧化应激模型马铃薯中提取色素高效液相色谱法进行纯化外四种分离色素中丹皮素暴露甘皮素gs 1细胞抗氧化作强目前增加饮食抗氧化剂摄入降低胃粘膜氧化损伤佳选择已广泛认识外前研究中已表明花青素提取Jianchuan甘皮素Zhuanxinwu土豆浓度赖方式具强抗氧化活性透露重基清力107 ~ 313倍维生素C表明土豆抗氧化效果进步证实Paeonin保护gs 1细胞免受氧化损伤中作分通荧光素酶检测qRTPCR检测甘皮素处理gs 1细胞中表达抗氧化力are 荧光素酶活性甘皮素1 mRNA表达数显示Paeonin剂量时间赖方式调甘皮素处理gs 1细胞are 荧光素酶活性甘皮素1 mRNA表达表明Paeonin甘皮素处理gs 1细胞中发挥抗氧化作外发现Paeonin处理甘皮素培养gs 1细胞中着时间延长细胞存活率逐渐升高进步说明Paeonin减轻gs 1细胞甘皮素treatment处理细胞损伤
进步挖掘丹皮素抗氧化损伤潜机制越越关注Nrf2信号通路种氧化原敏感转录子正常条件定位细胞质keap1相互作旦激活Nrf2进入细胞核结合靶基启动子抗氧化反应元件导致种抗氧化解毒酶转录终显示出细胞保护作越越研究表明Nrf2通路激活研究治疗胃病治疗靶点 研究发现丹皮素处理甘皮素1细胞中Keap1Nrf2甘皮素1NQO1明显升高外甘皮素处理gs 1细胞中Nrf2荧光强度着丹皮素处理时间延长增强Nrf2认种转录子氧化应激条件kelch样ech相关蛋白1 (Keap1)中解离然进入细胞核ARE结合导致抗氧化基(包括甘皮素1NQO1)转录激活外十年里种研究表明增强核Nrf2改善游基效保护细胞免受氧化应激引起细胞损伤例水杨酸通激活Nrf2信号通路抑制氧化应激诱导脐静脉皮细胞(HUVEC)损伤绿原酸通PI3K akt介导Nrf2甘皮素1信号通路保护鼠成骨细胞MC3T3E1免受甘皮素诱导氧化应激研究结果表明Paeonin通激活Nrf2信号通路阻止甘皮素刺激gs 1细胞氧化损伤外PI3KAkt信号通路激活认Nrf2信号通路激活关键游事件细胞中PI3KAkt信号通路nrf2赖转录方式调节抗氧化基表达应氧化应激时研究中Paeonin处理甘皮素暴露gs 1细胞中pAkt蛋白表达呈抛物线型趋势8 h时达峰值外甘皮素group甘皮素+ Paeonin组相PI3KAkt信号抑制剂GSK690693明显抑制H202+ Paeonin + GSK690693组GSH含量 然细胞中GSH水积累反映氧化应激抑制状态结果表明Paeonin抗氧化保护作PI3K akt介导Nrf2信号通路介导
结：
通流式细胞术WB检测细胞周期凋亡情况数表明丹皮素治疗显著改善甘皮素细胞周期阻滞gs 1细胞凋亡影响 目前已证实甘皮素诱导细胞周期阻滞凋亡细胞损伤关键指标外甘皮素刺激gs 1细胞相WB实验验证Paeonin促进细胞周期相关Cyclin D1p27抗凋亡相关Bcl2蛋白表达抑制促凋亡相关BaxpCaspase3pCaspase8蛋白表达22结果提示丹皮素甘皮素诱导细胞损伤效
综述提供第证证明土豆中提取丹皮素通种机制少部分赖PI3K akt介导Nrf2信号通路激活甘皮素诱导氧化应激损伤产生细胞保护作研究强调丹皮素作逆转胃部疾病氧化应激新靶点价值
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