基工程工具
．基工程
1基工程名：基拼接技术DNA重组技术
2操作象：基
3操作水DNA分子水
4原理：基重组
5生物DNA拼接原：DNA规双螺旋结构
6种生物基种生物体表达原：生物套遗传密码子
二．DNA重组基工具
三种工具 限制酶 两种工具酶
DNA连接酶
载体
1限制酶（限制性核酸切酶）
（1）源：原核细胞
（2）作：识切割特定DNA序列
（识切割RNA单链DNA）
（3）限制酶作磷酸二脂键作氢键
（4）限制酶类酶种酶限制酶识DNA序列限制酶具特异性
（4）末端： 末端
粘性末端
（5）单酶切缺点：目基载体身环化
目基反插入载体中
（6）双酶切优点：防止目基载体身环化
目基载体正确连接
（7）种酶处理载体目基原：
切割获（粘性）末端相
2DNA连接酶
（1）DNA连接酶连接磷酸二脂键连接氢键
（2）具特异性
（3）分类
E．coli DNA连接酶（存肠杆菌中）：
连接粘性末端
T4DNA连接酶（存T4噬菌体中）：
连接粘性末端末端连接末端效率低
3载体
（1）载体作：
作运输工具目基导入受体细胞
携带目基受体细胞量复制
（3）具备条件
1)受体细胞中复制稳定存
2)限制酶切割位点供外源DNA片段插入
3)具标记基供重组DNA选择鉴定
基工程基操作程序
基工程基操作程序包括四步骤：
目基获取
基表达载体构建（关键步骤）
目基导入受体细胞
目基检测鉴定
目基获取
1获取目基常方法
（1）基文库中获取目基
（2）利PCR技术扩增目基
（3）工合成
2基文库中获取目基
基组文库
（1）基文库
部分基文库（：cDNA文库）
（2）基组文库cDNA文库较
基组文库中启动子终止子含子
cDNA文库中没启动子终止子含子
3利PCR技术扩增目基
（1）原理：DNA双链复制
（2）条件：
段已知目基核苷酸序列便根序列合成引物
（3）原料：模板DNATaq酶引物三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）
（4）程：
变性：加热90～95℃DNA解链
退火：冷55～60℃引物结合互补DNA链
延伸：加热70～75℃热稳定DNA聚合酶引物起始互补链合成
（5）注意
引物需满足条件：
引物1引物2结构互补单引物身互补
引物GC含量高退火温度高
三磷酸脱氧核苷酸转变脱氧核苷酸程中脱磷酸基团释放高磷酸键中量
二．基表达载体构建 （基表达载体构建基工程核心）
1目：目基受体细胞中稳定存遗传代
目基够表达发挥作
2组成：目基+启动子+终止子+标记基
目基：插入启动子终止子间
启动子 位置：基首端
功：RNA聚合酶识结合部位驱动基转录出mRNA
终止子 位置基尾端
功：终止转录
标记基作：鉴定受体细胞中否含目基
复制原点：起始复制
三．目基导入受体细胞
1转化概念：
目基进入受体细胞受体细胞维持稳定表达程
2受体细胞选择
动物：受精卵 受精卵具全性发育成完整体
植物：体细胞 植物体细胞具全性发育成完整体
微生物：
原核（肠杆菌）：繁殖快单细胞遗传物质相较少
真核（酵母菌）：真核细胞具质网高尔基体蛋白质进行加工修饰
3常转化方法：
（1）目基导入植物细胞：
农杆菌转化法（双子叶植物裸子植物）植物细胞常方法
基枪法（常单子叶植物）
花粉通道法
（2） 目基导入动物细胞：常方法显微注射技术
（3） 目基导入微生物细胞：Ca离子处理
Ca离子处理细胞目：
肠杆菌成感受态细胞更容易吸收重组DNA分子
4．注意
（1）受体细胞植物细胞需植物组织培养技术
（2）受体细胞动物细胞需早期胚胎培养胚胎移植
显微注射技术 早期胚胎培养
目基 受精卵 早期胚胎
胚胎移植
雌性动物子宫 发育成具新性状动物
5重组细胞导入受体细胞筛选含基表达载体受体细胞标记基否表达
6农杆菌转化法
四．目基检测鉴定
（1）分子水鉴定
1检测 转基生物染色体DNA否插入目基
方法采 DNA分子杂交技术
2检测 目基否转录出mRNA
方法采核酸分子杂交技术
3检测 目基否翻译成蛋白质
方法采抗原－抗体杂交技术
DNA分子杂交技术核酸分子杂交技术原理碱基互补配原探针放射性位素标记目基判断：否出现杂交带
抗原抗体杂交技术原理抗原抗体特异性结合例检测受体细胞否表达出胰岛素胰岛素抗体检测
（2）体生物学水鉴定
转基生物
检测方法
观察指标
抗虫植物
接种害虫
害虫否死亡
抗病植物
接种病毒（菌）
否出现病斑
抗盐植物
盐水浇灌
否正常生长
抗草剂植物
喷洒草剂
否正常生长
获取目基产物转基生物
提取细胞产物天然产品进行功活性较
细胞产物功活性否正常
植物基工程
1抗病转基植物采目基：
病毒外壳蛋白基病毒复制酶基
2抗真菌转基植物采目基：
丁质酶基抗毒素合成基
二．动物基工程
1肠乳糖酶基导入奶牛基组获转基牛表达出肠乳糖酶肠乳糖酶乳糖分解成半乳糖降低牛奶中乳糖含量
2．乳腺生物反应器
显微注射 早期胚胎培养
药蛋白基+乳腺蛋白基启动子 受精卵 早期胚胎
胚胎移植 泌乳期
子宫 转基动物 分泌乳汁 提取药物
（2）药蛋白基前插入乳腺蛋白基启动子目药蛋白基乳腺组织细胞中表达
（3）膀胱生物反应器优点
受性限制
受体发育时期限制
3器官移植
器官移植两难题：器官短缺免疫排斥
供体角度降低免疫排斥：
1）器官供体基组中导入某种调节子抑制抗原决定基表达
2）设法抗原决定基
4基治疗
基治疗正常基导入基缺陷细胞中正常基表达产物发挥作原缺陷基然存
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．基工程
1基工程名：基拼接技术DNA重组技术
2操作象：基
3操作水DNA分子水
4原理：基重组
5生物DNA拼接原：DNA规双螺旋结构
6种生物基种生物体表达原：生物套遗传密码子
二．DNA重组基工具
三种工具 限制酶 两种工具酶
DNA连接酶
载体
1限制酶（限制性核酸切酶）
（1）源：原核细胞
（2）作：识切割特定DNA序列
（识切割RNA单链DNA）
（3）限制酶作磷酸二脂键作氢键
（4）限制酶类酶种酶限制酶识DNA序列限制酶具特异性
（4）末端： 末端
粘性末端
（5）单酶切缺点：目基载体身环化
目基反插入载体中
（6）双酶切优点：防止目基载体身环化
目基载体正确连接
（7）种酶处理载体目基原：
切割获（粘性）末端相
2DNA连接酶
（1）DNA连接酶连接磷酸二脂键连接氢键
（2）具特异性
（3）分类
E．coli DNA连接酶（存肠杆菌中）：
连接粘性末端
T4DNA连接酶（存T4噬菌体中）：
连接粘性末端末端连接末端效率低
3载体
（1）载体作：
作运输工具目基导入受体细胞
携带目基受体细胞量复制
（3）具备条件
1)受体细胞中复制稳定存
2)限制酶切割位点供外源DNA片段插入
3)具标记基供重组DNA选择鉴定
基工程基操作程序
基工程基操作程序包括四步骤：
目基获取
基表达载体构建（关键步骤）
目基导入受体细胞
目基检测鉴定
目基获取
1获取目基常方法
（1）基文库中获取目基
（2）利PCR技术扩增目基
（3）工合成
2基文库中获取目基
基组文库
（1）基文库
部分基文库（：cDNA文库）
（2）基组文库cDNA文库较
基组文库中启动子终止子含子
cDNA文库中没启动子终止子含子
3利PCR技术扩增目基
（1）原理：DNA双链复制
（2）条件：
段已知目基核苷酸序列便根序列合成引物
（3）原料：模板DNATaq酶引物三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）
（4）程：
变性：加热90～95℃DNA解链
退火：冷55～60℃引物结合互补DNA链
延伸：加热70～75℃热稳定DNA聚合酶引物起始互补链合成
（5）注意
引物需满足条件：
引物1引物2结构互补单引物身互补
引物GC含量高退火温度高
三磷酸脱氧核苷酸转变脱氧核苷酸程中脱磷酸基团释放高磷酸键中量
二．基表达载体构建 （基表达载体构建基工程核心）
1目：目基受体细胞中稳定存遗传代
目基够表达发挥作
2组成：目基+启动子+终止子+标记基
目基：插入启动子终止子间
启动子 位置：基首端
功：RNA聚合酶识结合部位驱动基转录出mRNA
终止子 位置基尾端
功：终止转录
标记基作：鉴定受体细胞中否含目基
复制原点：起始复制
三．目基导入受体细胞
1转化概念：
目基进入受体细胞受体细胞维持稳定表达程
2受体细胞选择
动物：受精卵 受精卵具全性发育成完整体
植物：体细胞 植物体细胞具全性发育成完整体
微生物：
原核（肠杆菌）：繁殖快单细胞遗传物质相较少
真核（酵母菌）：真核细胞具质网高尔基体蛋白质进行加工修饰
3常转化方法：
（1）目基导入植物细胞：
农杆菌转化法（双子叶植物裸子植物）植物细胞常方法
基枪法（常单子叶植物）
花粉通道法
（2） 目基导入动物细胞：常方法显微注射技术
（3） 目基导入微生物细胞：Ca离子处理
Ca离子处理细胞目：
肠杆菌成感受态细胞更容易吸收重组DNA分子
4．注意
（1）受体细胞植物细胞需植物组织培养技术
（2）受体细胞动物细胞需早期胚胎培养胚胎移植
显微注射技术 早期胚胎培养
目基 受精卵 早期胚胎
胚胎移植
雌性动物子宫 发育成具新性状动物
5重组细胞导入受体细胞筛选含基表达载体受体细胞标记基否表达
6农杆菌转化法
四．目基检测鉴定
（1）分子水鉴定
1检测 转基生物染色体DNA否插入目基
方法采 DNA分子杂交技术
2检测 目基否转录出mRNA
方法采核酸分子杂交技术
3检测 目基否翻译成蛋白质
方法采抗原－抗体杂交技术
DNA分子杂交技术核酸分子杂交技术原理碱基互补配原探针放射性位素标记目基判断：否出现杂交带
抗原抗体杂交技术原理抗原抗体特异性结合例检测受体细胞否表达出胰岛素胰岛素抗体检测
（2）体生物学水鉴定
转基生物
检测方法
观察指标
抗虫植物
接种害虫
害虫否死亡
抗病植物
接种病毒（菌）
否出现病斑
抗盐植物
盐水浇灌
否正常生长
抗草剂植物
喷洒草剂
否正常生长
获取目基产物转基生物
提取细胞产物天然产品进行功活性较
细胞产物功活性否正常
植物基工程
1抗病转基植物采目基：
病毒外壳蛋白基病毒复制酶基
2抗真菌转基植物采目基：
丁质酶基抗毒素合成基
二．动物基工程
1肠乳糖酶基导入奶牛基组获转基牛表达出肠乳糖酶肠乳糖酶乳糖分解成半乳糖降低牛奶中乳糖含量
2．乳腺生物反应器
显微注射 早期胚胎培养
药蛋白基+乳腺蛋白基启动子 受精卵 早期胚胎
胚胎移植 泌乳期
子宫 转基动物 分泌乳汁 提取药物
（2）药蛋白基前插入乳腺蛋白基启动子目药蛋白基乳腺组织细胞中表达
（3）膀胱生物反应器优点
受性限制
受体发育时期限制
3器官移植
器官移植两难题：器官短缺免疫排斥
供体角度降低免疫排斥：
1）器官供体基组中导入某种调节子抑制抗原决定基表达
2）设法抗原决定基
4基治疗
基治疗正常基导入基缺陷细胞中正常基表达产物发挥作原缺陷基然存
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