第三军医学
硕士学位文
ASPP基家族mRNA肿瘤细胞株中表达启动子CpG岛甲基
化实验研究
姓名：张云
申请学位级：硕士
专业：床检验诊断学
指导教师：刘泽军
20040401
第三军医学硕士学位文
5
ASPP 基家族 mRNA 肿瘤细胞株中表达
启动子 CpG 岛甲基化实验研究
摘
目
p53 蛋白家熟知肿瘤抑制蛋白 目前 p53 蛋白相关基研究
集中 p53 蛋白促凋亡功调节 发现新蛋白家族 p53 促凋亡
蛋白(apoptosis stimulating protein of p53 ASPP) 三成员 ASPP1 ASPP2
iASPP((Inhibitory member of the ASPP family) ASPP1 ASPP2 显著性增强 p53 促
凋亡功 iASPP p 53 促凋亡功抑制子 次实验利 RTPCR 方法
检测 ASPP 基家族 mRNA 8种肿瘤细胞株表达水 揭示 ASPP 基家族 mRNA
表达量肿瘤发生发展关系 时解 ASPP 基家族 p53 相互作机制
利 internet 网免费引物设计 ASPP1 ASPP2 基启动子 CpG 岛进行分析设
计甲基化特异性 PCR(Methylathen Specific PCR MSP)引物 时利 MSP 方法检测
ASPP1 ASPP2 基启动子甲基化状况 探讨 ASPP1 ASPP2 肿瘤细胞中异常表达
原
方法
1 成纤维细胞肿瘤细胞株 HL60 K562 Jurkat HCT116 HT29 Hepg2
MCF7 A549 加 100Uml 青霉素 100Uml 链霉素 10牛血清高糖 DMEM
培养基 5CO2 条件 37oC 培养
2 应 RTPCR 检测 ASPP 基家族 mRNA 细胞株中表达情况
3 利 internet 网 CpG 岛分析软件 ASPP1 ASPP2 基启动子 CpG 岛进行
分析 利网免费引物设计软件 MSP34 设计 MSP 引物 建立检测 ASPP1 ASPP2
基启动子 CpG 岛甲基化状况 MSP 方法
4 利 MSP 方法检测 ASPP1 ASPP2 基启动子 p53 野生型肿瘤细胞株
Hepg2 MCF7 A549 成纤维细胞中甲基化状况
结果
1 ASPP 基家族 mRNA 细胞株中均表达 细胞株中表达量
差异
2 肿瘤细胞株中 ASPP1 基 mRNA 表达量明显低正常细胞(成纤维
第三军医学硕士学位文
6
细胞 血液单核细胞)表达量 P<001 ASPP2 基 mRNA 表达量肿瘤细
胞株中表达差异较 正常细胞表达量相呈降趋势 P<005
3 iASPP 基 mRNA 细胞株中表达量 A549 HT29 中表
达量正常细胞差异 P>005 6 种肿瘤细胞株中表达量均高正常细胞
表达量 P<001
4 ASPP1 ASPP2 基网 CpG 岛分析软件分析出 ASPP1 基 10 CpG
岛 第 CpG 岛中 均 34 碱基中 CG 序列 ASPP2 基 3 CpG
岛 第 CpG 岛中 均 383 碱基中 CG 序列
5 MSP 检测 3 株 p53 野生型肿瘤细胞株(A549 HEPG2 MCF7)成纤维细胞
ASPP1 ASPP2 基 CPG 岛甲基化情况 结果肿瘤细胞株中 ASPP1 ASPP2 基
甲基化引物均出现目基带 ASPP1 ASPP2 基未甲基化引物均没出现目
基带 成纤维细胞中 ASPP1 ASPP2 基甲基化引物均未出现目基带 ASPP1
ASPP2 基未甲基化引物均出现目基带
结
1 国首次 RTPCR 方法检测 ASPP 基家族 mRNA 表达 发现 ASPP
基家族 mRNA 肿瘤细胞株中均表达
2 通 GelPro31 凝胶图分析软件电泳图片半定量分析发现 肿瘤细胞株中
ASPP1 ASPP2 基 mRNA 表达量均低正常细胞 iASPP 基 mRNA 表达量
均高正常细胞 结 促 p53 促细胞凋亡功中 ASPP1 ASPP2 基正
调节 iASPP 基反调节 甚 p53 突变肿瘤细胞中 ASPP1 ASPP2 抑
制肿瘤细胞生长
3 首次应 internet ASPP1 ASPP2 基进行 CpG 岛分析 发现 ASPP1
ASPP2 基第 CpG 岛中 CG 序列含量丰富 表明第 CpG 岛
容易发生甲基化
4 首次应网免费引物设计软件 MSP34 设计 ASPP1 ASPP2 基 MSP 引物
建立检测 ASPP1 ASPP2 基 CpG 岛甲基化状况方法 MSP
5 首次 3 株 p53 野生型肿瘤细胞株(A549 HEPG2 MCF7)成纤维细胞中 ASPP1
ASPP2基 CpG岛甲基化状况检测发现 3株p53 野生型肿瘤细胞株中ASPP1 ASPP2
基 CpG 岛出现甲基化 成纤维细胞中 ASPP1 ASPP2 基 CpG 岛没出现甲基化
结果提示 ASPP1 ASPP2 基 CpG 岛甲基化状况肿瘤发生关
关键词 ASPP p53 细胞凋亡 肿瘤 启动子 甲基化 MSP
第三军医学硕士学位文
2
The experimental research on the mRNA expression of
ASPP gene family and the CpG island methylation of
ASPP gene promoters in the tumor cell lines
Abstract
Objective
The p53 protein is one of the bestknown tumour suppressors Recently a new family
of protein the ASPP (for apoptosisstimulating protein of p53) was discovered This family
consists of three members ASPP1 ASPP2 and iASPP ASPP1 and ASPP2 act as potent
activators of p53 iASPP acts as an inhibitor of p53 The apoptotic function of p53 is
stimulated by ASPP1 and ASPP2 and inhibited by iASPP To understand how important the
ASPP proteins are in human cancers we investigated the mRNA expression levels of ASPP
members in eight kinds of cancer cell lines To further understand the cause of abnormal
ASPP expression in cancer cells We detected the methylation status of ASPP1 and ASPP2
gene promoter in tumor cell by methylation specific polymerase chain reaction
Methods
1 Cells were grown in Dulbecco modified Eagle medium supplement with 10 fetal
calf serum and 100Uml benzylpenicillin and 100 Uml streptomycin sulfate in a humidified
atmosphere containing 5 of CO2 at 37oC
2 mRNA expression levels of ASPP gene family were measured by RTPCR
3 The CpG island status of ASPP1 and ASPP2 gene promoter were analyzed and MSP
primers were designed by Internet free primer design software An analysis method of
ASPP1 and ASPP2 gene methylation status was established
4 Using this MSP method to detect the CpG island methylation status of ASPP1 and
ASPP2 gene promoter in three p53 wildtype tumor cell lines (Hepg2 MCF7 A549) and
fibroblast cell
Results
1 ASPP gene family mRNA was expression in all cell lines but the expression is
different in each cell line
2 ASPP1 gene mRNA expression in all tumor cell lines is prominent lower than the
第三军医学硕士学位文
3
expression in normal cells (fibroblast cell and blood monocyte) p<001 ASPP2 gene
mRNA expression is different in each tumor cell line The expression level of the tumor cell
lines show descendent trend comparing with that of the normal cells P<005
3 iASPP gene mRNA expression is different in different cells In A549 and HT29 the
expression is no difference p>005 In the other 6 tumor cell lines the expression is higher
than the normal cell expression P<001
4 ASPP1 and ASPP2 gene CpG island analysis using Internet free CpG island analysis
software show that ASPP1 gene has 10 CpG islands and there is one CG sequence average
34 bases in the first CpG island ASPP2 gene has 3 CpG island and there is one CG
sequence average 383 bases in the first CpG island
5 MSP analysis showed that CpG islands of ASPP1 and ASPP2 gene promoters were
methylated in the three p53 wildtype tumor cell lines Hepg2 MCF7 A549 Whereas in
fibroblast cell unmethylated bands was observed
Conclusions
1 The mRNA expression of ASPP gene family was measured by RTPCR for the first
time The result indicated that ASPP gene family mRNA was expressed in all tumor cell
lines researched
2 The electrophoresis photos were semiquantified analysis by GelPro 31 software
The results showed that ASPP1 and ASPP2 gene mRNA expression in tumor cell lines was
lower than the expression of normal cells iASPP gene mRNA expression in tumor cell lines
was higher than the expression of normal cells The result indicated that ASPP1 and ASPP2
could enhance the apoptotic function of p53 and they could suppress tumor growth even in
tumors expressing mutant p53 iASPP can restrain the apoptotic function of p53
3 The methylation status of ASPP1 and ASPP2 gene was firstly analyzed by us and the
rich CG sequence content exists in their first CpG island This condition indicates that they
were affected easily by methylation in this position
4 Using internet free primer design software MSP34 designed MSP primer of ASPP1
and ASPP2 and established an analysis method MSP to detect ASPP1 and ASPP2 gene
methylation status
5 ASPP1 and ASPP2 gene CpG island methylation status was detected first time in
three p53 wildtype tumor cell lines (Hepg2 MCF7 A549) and fibroblast cell The results
第三军医学硕士学位文
4
showed that ASPP1 and ASPP2 gene CpG islands were methylated in three p53 wildtype
tumor cell lines and were unmethylated in fibroblast cell These results indicated that the
changes of CpG island methylation status of ASPP1 and ASPP2 gene promoter might be an
important factor in tumorigenesis
Key words ASPP p53 Apoptosis Tumor Promoter Methylation MSP
第三军医学硕士学位文
1
英文缩写词表
英文缩写 英文全称 中文译名
ASPP Apoptosis Stimulation Protein of P53 P53 凋亡刺激蛋白
BPB Bromophenol Blue 溴酚兰
DEPC Diethl Pyrocarbonate 焦碳酸二乙酯
DNA Deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核酸
dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate 脱氧核糖核苷三磷酸
EB Ethidium Bromide 溴化乙锭
EDTA Ethylene dinitrilotetraacetic acid 乙二胺四乙酸
HEPES Hydroxyethyl Piperazine Ethanesulfonic acid 羟乙基哌嗪乙磺酸
iASPP Inhibitory member of the ASPP family ASPP 家族抑制成员
IOD Integrated Optical Density 积分光密度
mRNA Messenger ribonucleic acid 信核糖核酸
MSP Methylation specific polymerase
chain reaction
甲基化特异性 PCR
PBS Phosphate buffer solution 磷酸盐缓溶液
PCR Polymerase chain reaction 聚酶链反应
RNA Ribonucleic acid 核糖核酸
RTPCR Reverse transcription PCR 逆转录聚酶链反应
TAE TrisAcetic acid glacialEDTA
electrophoresis buffer
Tris醋酸EDTA 电泳缓液
Taq Thermus aquaticus DNA Polymerase 栖热水生菌 DNA 聚合酶
TE TrisEDTA buffer TrisEDAT 缓液
TrisHCl Trishydrochloric acid buffer Tris盐酸缓液
第三军医学硕士学位文
7
ASPP 基家族 mRNA 肿瘤细胞株中表达
启动子 CpG 岛甲基化实验研究
前 言
肿瘤形成原癌基抑癌基遗传性变化增加 丢失 突变等 逐步积累
程 遗传素环境素作子疾病 越越研究表明
细胞凋亡(apoptosis)[12]肿瘤形成着密切关系 细胞死亡异常侧面出发寻
找正常组织演变肿瘤组织途径 细胞凋亡受抑制 破正常组织中细胞增
殖凋亡衡调节 结果细胞死亡率降 果机体重新恢复增殖凋亡
衡调节 导致细胞数目断增加 表现出生长优势 正常组织转变肿
瘤[345] 根美国 ISI(Information Sciences Institute) SCI 录引文关键词检索
发现 全球然科学研究中文发表集中三领域分细胞信号转导 细胞凋
亡基组研究 细胞凋亡成前生命科学研究热门领域
细胞许功 基转录 DNA 合成 DNA 修复 细胞循环停滞 衰老
细胞凋亡受 p53 蛋白调节 类肿瘤中 35 40发生 p53 基突变
p53 野生型肿瘤中 激活 p53 途径受破坏[6] 细胞凋亡程中 p53 蛋白
起着关重作 p53 转录调控子 质种核磷酸蛋白 正常
情况 p53 表达较低 特异 DNA 序列(p53 结合位点)结合 促转录
P53 生物功细胞处异常情况细胞周期负调控 细胞滞留
G1 期 G2M 期 细胞进入 DNA 合成 S 期丝分裂 细胞修复 DNA 损伤
机会 果细胞成功修复 DNA 效抗外界素干扰 胞杀防御
系统(凋亡)激活 细胞凋亡成 p53 保护整体组织受进步损伤防御功
肿瘤研究中发现 50肿瘤组织中 p53 基点突变缺失 表明 p 53
失活肿瘤发生必条件 果肿瘤组织带 p53 基表达正常
异体蛋白胞蛋白异常表达导致 p53 功减弱失活
发生肿瘤
2001 年 英国帝国癌症研究抑癌基研究室卢欣教授领导研究组发现
新蛋白家族─ASPP(apoptosis stimulating protein of p53)[7] 该家族成员 ASPP1
ASPP2 iASPP(inhibitory member of the ASPP family)[8] ASPP 蛋白家族
第三军医学硕士学位文
8
研究中发现 ASPP 家族改变 p53 蛋白细胞凋亡功 时 揭示 ASPP
家族 p53 作总机制 ASPP p53 结合形成 ASPPp53 复合物作原凋亡基
启动子 ASPP 微变化引起 p53 结合 DNA 力发生改变 影响 p53
诱导凋亡力[7] 细胞根 p53 蛋白停滞基结合凋亡基结合活力
做出细胞停滞细胞凋亡决定[9] ASPP1 ASPP2 通提高原凋亡基活力
促进 p53 赖细胞死亡 iASPP ASPP1 ASPP2 竞争 p53 结合位点
影响 ASPPp53 复合物 DNA 结合力 阻止 p53 细胞凋亡功 ASPP 家
族细胞凋亡中起着重作 目前国尚未该家族相关研究 次
实验研究 8 种肿瘤细胞株 2 种正常细胞中 ASPP 基家族 mRNA 表达状况
DNA 甲基化种基表观性修饰 影响染色质结构修饰 DNA 空间结构
DNA 序列发生变化[10] 影响基表达机制 肿瘤发生着密切联系
DNA 甲基化状态改变致癌作关键素 肿瘤抑制基失活方式
通基机制基外机制导致细胞增殖分化相关基表达异常 造成细胞失
正常程控制发生恶变形成肿瘤[ 11] ASPP 基家族 2001 年发现
细胞凋亡程中起着重作 DNA 甲基化状态改变细胞癌变关键
素 ASPP 基家族否存甲基化改变 目前国外尚未相关报道
次实验中利网 CpG 岛分析软件 ASPP1 ASPP2 基 CpG 岛进行分析
MSP34 甲基化引物设计软件设计引物 建立检测 ASPP1 ASPP2 基 CpG 岛甲
基化状态方法 MSP[12] 检测肿瘤细胞株中 ASPP1 ASPP2 基 CpG 岛甲基
化状态 解 ASPP1 ASPP2 基启动子甲基化状况肿瘤发生发展中作
实验研究容
DMEM 细胞培养液培养 8 种肿瘤细胞株成纤维细胞 时单核细胞
分离液分离血液单核细胞 利 RTPCR 方法分析细胞中 ASPP 基家族 mRNA
表达情况 解 ASPP 基家族 p53 相互机制 揭示 ASPP 基家族细胞凋亡
关系
二 利 internet 网 CpG 岛分析软件 ASPP1 ASPP2 基启动子 CpG 岛进
行分析 利网免费引物设计软件 MSP34 设计 MSP 引物 建立检测 ASPP1
ASPP2 基启动子 CpG 岛甲基化状况 MSP 方法
三 利 MSP 分析三株 p53 野生型肿瘤细胞株成纤维细胞 ASPP1 ASPP2
基启动子 CpG 岛甲基化状况
第三军医学硕士学位文
9
第部分 ASPP 基 mRNA 肿瘤细胞株中表达研究
癌症危害类健康重难题 癌症死亡率床疾病中位
居第二 目前止 量实验研究证明 细胞癌变分子基础基 DNA
变化正常活动导致细胞癌变 说 癌变某基表达失控结果
肿瘤发生中两类基 癌基(oncogene)抑癌基(tumor suppressor gene)
抗癌基(antioncogene)关 癌基抑癌基正常细胞胚胎期生命早期表
达类基 功调控细胞增殖分化关 癌基促进细胞增殖 抑制细
胞分化细胞凋亡 抑癌基作相反 正常状态 两类基相互作
维持细胞正常生长 分化凋亡 某种原原癌基激活抑癌基失活 均
导致细胞度增殖 分化 凋亡受阻 终引起肿瘤发生
p53 肿瘤抑制基 研究证明 p53 变异活性改变造成细胞正常抑癌
功丧失 导致肿瘤发生 约 50恶性肿瘤存 p53 突变缺失 外 50
肿瘤中 p53 非具活性 p53 野生型肿瘤量研究中发现 p53
肿瘤中没活性 p53 活性失活调节子功出现障致 2001
年卢欣[7]教授等发现 ASPP(Apoptosis Stimulation Protein of P53)蛋白质家族 包括
ASPP1 ASPP2 iASPP(Inhibitory member of the ASPP family)[8]等三成员 研究证
明 ASPP 蛋白质家族体 p53 关键调节蛋白
p53 稳定染色体 DNA 方面充 基组卫士 (guardian of genome) 分子警
察 (molecular policeman)角色 细胞 DNA 受损伤时 p53 面两种选择 诱
导细胞循环停滞 启动 DNA 修复 二 诱导细胞凋亡 DNA 损失太法修复时
ASPP 蛋白 p53 结合 p53 蛋白调靶基 bax IGFBP3 抑制 bcl2 基
调控细胞凋亡 维持基组遗传学稳定性[13] 行抑癌基功 诱导细胞凋亡
诱导凋亡仅清癌细胞 抑制突变细胞细胞群增值 否会细胞
变化生成更加恶性肿瘤
ASPP 蛋白家族 p53 促凋亡作 目前国外研究尚少 否
肿瘤细胞发生中起作 现清楚 RTPCR 分析 8 种肿瘤
细胞株中 ASPP 基家族 mRNA 表达情况 揭示 ASPP 基家族肿瘤发生中
作 时解 ASPP 蛋白家族 p53 促凋亡作机理 现实验报告
第三军医学硕士学位文
10
实验材料
细胞株
早幼粒急性白血病细胞株(HL60) 慢性髓原性白血病细胞株(K562) 急性 T 细胞
白血病细胞株(Jurkat)西南医院血液科陈龙硕士惠赠 乳腺癌细胞株(MCF7)西南
医院乳腺中心唐波硕士惠赠 结肠癌细胞株(HT29 HCT116) 肺癌细胞株(A549)
肝癌细胞株(HEPG2)西南医院分泌科彭勇硕士惠赠
二 仪器
1 恒温 CO2 细胞培养箱 Shldon Lab USA
2 超净工作台 苏州净化设备限公司
3 倒置显微镜(Olympas) Olympas Japan
4 显微镜(Olympas) Olympas Japan
5 PCR 扩增仪(PE2400) PE 公司 USA
6 紫外分光光度计 Smart spectro 3000(BioRad)
7 高速低温冷冻离心机 Beckman Coulter USA
8 电泳系统(FXDY252) 海复星公司
9 ZFZ90 功暗箱式紫外透射仪 海顾村电光仪器厂
10 凝胶成分析仪 Bioprofic French
11 水处理系统 PALL USA
12 电子天 Shimadzu Cerporation Kyoto
13 低温冰箱(20 40 70 ) Sanyo Japan
14 电热恒温水箱(GB1124189) 北京医疗设备厂
15 水离心机(TGL16G) 海安亭科学仪器厂
三 试剂
1 RPMI 1640 细胞培养液 Gibco
2 DMEM 细胞培养液 Hyclone 进口分装
3 牛血清 Hyclone 进口分装
4 胰酶 Sigma
5 Tripure Isolation Reagent 罗氏
6 HEPES Sigma
7 DEPC Sigma
第三军医学硕士学位文
11
8 EZNA Gel Extraction Kit Omega
9 巯基乙醇 海化学试剂公司
10 Taq 酶 Promega
11 DNTP Promega
12 PCR Markers 华美生物工程公司
13 琼脂糖 Shanghai Yito Enterprise Company
14 TrisHCl Farco Chemical Hongkong
15 RTPCR 试剂盒 TaKaRa Japan
16 MOPS Sigma
17 琼脂糖 Shanghai Yito Enterprise Company Limited
四 试剂配制
1 RPMI1640 DMEM 培养液(10牛血清)
分称取 RPMI1640 DMEM 干粉 104g 溶 800ml 离子水中 分加入碳
酸氢钠约 20g 32g 调 pH 72 74 加青霉素 链霉素终浓度 100Uml
离子水补足容积 1000ml 菌菌滤器培养基溶液抽入滤瓶中(022 m 膜
滤菌) 抽滤完毕 培养基转入菌分装瓶中 加入 1000ml 灭活菌牛血
清 充分混匀 分装成 100ml瓶储存 4 备
2 磷酸盐缓液(PBS)
800 ml 蒸馏水中溶解 8gNaCl 02gKCl 144gNa2HPO4 024gKH2PO4
HCl 调节溶液 PH 值 74 加水定容 1L 15 磅(1034×105Pa)高压蒸汽灭菌
20 分钟 保存室温
3 025胰酶消化液
称取 1g 胰酶干粉 溶解 400 ml PBS 缓液中 菌菌滤器滤分装 4
保存
4 01 DEPC 水
离子水 1000 ml DEPC 1ml 37 夜 15 磅高压 20 分钟
5 01M 枸橼酸钠 10 乙醇混合液
294g 枸橼酸钠溶 900ml 离子水 然加 100ml 水乙醇 混匀 滤菌
6 EB 溶液(10mgml)
1000ml 水中加入 1g 溴化乙锭(EB) 力震荡确保完全溶解 然转移
棕色瓶中 室温保存
第三军医学硕士学位文
12
7 05molL EDTA(pH80)
8000ml 水中加入 1861g EDTANa2H2O 搅拌 然 NaOH 调节 pH 值
80(约需 20g NaOH 颗粒) 然定容 10L 分装高压灭菌备
8 50 TAE
242gTris 碱 + 571ml 冰醋酸 + 1000ml 05molL EDTA(pH80) 加水定容 10L
室温保存
9 DNA 凝胶样缓液
溴酚兰(BPB)025 + 二甲苯青 025 + 甘油 30
10 PCR 琼脂糖凝胶
20g 琼脂糖溶 100ml 1 TAE 煮沸溶解 冷 60 加 10mgml EB 溶
液 50 l
11 5 RNA 甲醛变性凝胶电泳缓液
MOPS 01mmolL(pH 70) + 乙酸钠 40 mmolL + EDTA 5 mmolL(pH 70)
10M NaOH 盐酸调 pH 70
12 RNA 甲醛变性凝胶
1 RNA 甲醛变性凝胶缓液 + 甲醛 22molL + EB 05 gml
13 TE(10mM TrisHCl01mMEDTA pH 75)
484gTrisCl 溶 400ml 离子水 NaOH 调节 pH 值 75 然加 02ml
05molL EDTA(pH80) 加水定容 500ml 混匀
实验方法
细胞培养
1 早幼粒急性白血病细胞株 (HL60) 慢性髓原性白血病细胞株 (K562) 急性 T
细胞白血病细胞株(Jurkat)高糖 RPMI1640 培养液(10牛血清)培养
2 肺癌细胞株 A549 结肠癌 HT29 HCT16 乳腺癌 MCF7 肝癌 HEPG2
成纤维细胞高糖 DMEM 培养液(10牛血清)培养
3 肿瘤细胞株复苏 液氮中取出冻存肿瘤细胞株冻存 立放入 37
水浴箱中 振荡复融 2060 秒 中容物完全溶解 细胞悬液移入 10ml 离心
缓慢加入 80ml 左右 10牛血清培养液 菌低速离心 1000rpm 3min 弃
掉清液 加入适量新鲜 10牛血清培养液溶解沉淀细胞 移入螺口 50ml 培养瓶
第三军医学硕士学位文
13
置 37 5CO2 孵箱培养
4 细胞换液 天观察细胞生长 培养液颜色变黄 立更换培养液 3 种
白血病细胞株均悬浮生长 先吸入菌试 菌低速离心 1000rpm 5min 弃掉
清液 加入适量新鲜配制RPMI1640 (10牛血清)培养液轻轻混匀接种50ml
螺口培养瓶 37 5CO2 继续培养 贴壁生长肿瘤细胞株直接倒掉培养液
加入适量新鲜配制 DMEM(10牛血清)培养液继续培养
5 细胞传代 悬浮生长细胞株先吸入菌试 菌低速离心 1000rpm
5min 弃掉清液 加入适量新鲜配制 RPMI1640 (10牛血清)培养液轻轻混匀
分装接种 50ml 螺口培养瓶 37 5CO2 继续培养 贴壁生长肿瘤细胞株
胰酶消化 加入适量新鲜配制 DMEM (10牛血清)培养液轻轻吹散混匀
分装接种 50ml 螺口培养瓶 37 5CO2 继续培养
6 细胞回收 细胞处数生长时回收 冻存
二 血液白细胞收集
1 收集新鲜类血液
2 天津产单核细胞分离液单核细胞
21 加 4ml 单核细胞分离液离心中
22 加 2ml 新鲜血液(壁缓慢加单核细胞分离液面)
23 1200g 离心 15 分钟
24 吸取层单核细胞 加离心中
25 4 5ml 生理盐水洗滴单核细胞 1200g 离心 5 分钟 弃清 重复该
步骤二次
三 DNA RNA 提取
第步 细胞中提取 DNA RNA
1 获细胞置 EP EP 容量提取细胞 TriPure Isolation
Reagent 试剂总体积 2 倍
2 室温细胞中加入 TriPure Isolation Reagent 试剂 量 5 10 10
细胞 1ml TriPure Isolation Reagent Note 少量细胞(<10 )试剂量 08ml
TriPure Isolation Reagent + 510 微克糖原(glycogen作协助 RNA 沉淀载体)
3 吸反复吹细胞匀浆器细胞裂解
4 细胞裂解物转移 EP 中
注意 步样品匀浆进行步前 70 保存少 月
第三军医学硕士学位文
14
第二步 相分离
1 第步中样品匀浆置室温孵育 5 分钟――核蛋白复合物充分溶解
2 加入氯仿 量 02 ml 氯仿应 ml TriPure Isolation Reagent
3 心盖盖 力剧烈振荡 15 秒
4 室温孵育 215 分钟
5 4 12000g 离心 15 分钟 (离心时超 12000g)
6 离心 分三层
**层色液相 约占第步 TriPure Isolation Reagent 总量 60
RNA 提取
**中间层层红色机物液相 DNA 蛋白质提取
第三步 RNA 分离
1 第二步中色层液相转移新 EP 中
2 步骤色液相中沉淀 RNA
21 加异丙醇液相 1ml TriPure Isolation Reagent 应 05ml 异丙醇
22 盖盖 颠倒数次充分混匀
23 室温孵育 5 10 分钟 利 RNA 沉淀形成
24 4 12000g 离心 15 分钟
25 弃层液
3 加入 75 乙醇 1ml TriPure Isolation Reagent 应 1ml 乙醇
**RNA 沉淀保存 75 乙醇中 4 保存 周 20 保存年
4 通旋转作洗涤乙醇中 RNA 颗粒
5 4 7500g 离心 5 分钟 弃清液
6 空气干燥法样品置真空中 5 10 分钟 RNA 颗粒中余乙醇
7 DEPC 处理 RNA 酶水 DEPC 处理 05 SDS 重新悬浮 RNA 颗粒
8 吸头混匀 RNA 溶液 55 60 孵育 10 15 分钟
9 取 10ul 稀释 10 倍紫外分光光度计测定提取 RNA 260nm 280nm 处
吸光度 计算 RNA 浓度 OD260OD280 值
10 提取 RNA 作甲醛变性凝胶电泳 检测 RNA 完整性
第四步 DNA 提取
1 心弃第二步全部色液相
2 步骤中间相层红色液相中沉淀 DNA
第三军医学硕士学位文
15
21 加入水乙醇—— 1ml TriPure Isolation Reagent 应 03ml 水乙醇
22 盖盖颠倒数次充分混匀
23 室温孵育 2－3 分钟利 DNA 沉淀形成
24 4℃ 2000g 离心 5 分钟
3．清液转移 EP 中4℃保存该清液蛋白质分离
4．弃清液步骤做：
41 加 01M 枸橼酸钠 10％乙醇混合液—— 1ml TriPure 应 1ml
42 室温孵育 30 分钟时混匀
43 4℃ 2000g 离心 5 分钟弃层液
5．重复第 4 步二次
6．三次洗涤步骤处理 DNA 沉淀
61 75％乙醇洗涤 DNA 沉淀——１mlTriPure Isolation Reagent 应 15－
20ml 75％乙醇
62 室温孵育 10－20 分钟时混匀
63 4℃ 2000g 离心 5 分钟弃层液
7．通空气干燥法样品置真空中 5－10 分钟 DNA 颗粒中余
乙醇
8．步骤溶解 DNA
81 加定量 8mM NaOH DNA 浓度达 02－03μgμl例：107 细
胞加 03－06ml8mM NaOH
82 移液转移样品
83 果含没溶解物质 4℃ 12000g 离心 10 分钟清液转移
EP 中
9．取 10ul DNA 稀释 10 倍紫外分光光度计测定提取 DNA 260nm
280nm 处吸光度计算 DNA 浓度 OD260OD280 值
10．取提取 DNA 约 1 g作琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 完整性
四RTPCR 扩增 ASPP 基家族 βactin cDNA 序列引物设计 根
GeneBank 中提供 ASPP1(AJ318887)ASPP2(AJ318888)iASPP(NM_006663)
βactin(M24113)编码氨基酸 cDNA 序列分 Primer Premier 50 软件设计特异
引物引物均海生工公司合成合成引物序列见 Table 1：
第三军医学硕士学位文
16
Table1 Summary of the primer sets and Anealing for ASPP gene family and âactin
Primer Sequence Anealing
ASPP1 sense 5 GCAGCACACAGCGCCTTAAATAAG 3 604
ASPP1 antisense 5 TCCATTGTCCACATCGGCCAAGGT3 621
ASPP2 sense 5' TATCTAATCCTTACCGAAACC 3' 567
ASPP2antisense 5’CCCTCAGGCTCATAACTAA 3’ 585
iASPP sense 5'CCGCCTCTTCCATCGCA 3' 585
iASPP antisense 5' CTGGCTCGGGTCGTTCAT 3' 573
âactin sense 5' GTGGGCCGCTCTAGGCACCAA 3' 563
âactin antisense 5' CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC 3' 574
âactin sense 5' ACACTGTGCCCATCTACGAGGGG 3' 638
âactin antisense 5'ATGATGGAGTTGAAGGTAGTTTCGTGGAT 3' 612
引物海基康生物公司合成
五 RTPCR 扩增目片段
1 反转录
ASPP 基家族 Table2 配制反转录反应体系
Table2 System of reverse transcription reation
Reagent Volume Final concentration
MgCl2 4 l 25mmolL
10 RNA PCR Buffer 50 l
dNTP 1 l 025mmolL
RNase Inhibitor 1 l 20U
AMV Reverse Transcriptase 10 l 25U
Random 9 mers 10 l 25pmol l
RNA X l (50 g样) 100ng l
RNase Freed H2O 补 H2O 50 l
Total 500 l
反转录反应条件
30 10min 48 45 min 99 5 min 4 5 min
反转录形成 cDNA 产物20 保存
2 PCR
第三军医学硕士学位文
17
21 冰水浴条件 ASPP 基家族 Table3 配制反应体系
Table3 System of PCR reaction
10 PCRBuffer 50 l
MgCl2 40 l
dNTP 10 l
Primersense 20 l
Primerantisense 20 l
cDNA 50 l
Taq 05 l
H2O 305 l
Total 500 l
述 PCR 反应液轻轻混匀 1000rpm 离心 10 min 加 300 l 液体石蜡进行
扩增
22 PCR 反应条件
ASPP1 PCR 反应条件
95 3min 94 30 Sec 56 30 Sec 72 45 Sec 72 8min 4 保存
30 cycles
ASPP2 PCR 反应条件
95 3min 94 30 Sec 55 30 Sec 72 45 Sec 72 8min 4 保存
30 cycles
iASPP PCR 反应条件
95 3min 94 30 Sec 53 30 Sec 72 45 Sec 72 8min 4 保存
30 cycles
3 电泳
1 8 例取 10 l 溴酚兰 80 lPCR 产物混匀 点样 15琼脂糖
100V 电压电泳 45 min 紫外灯观察结果
六 胶回收 PCR 产物测序
第三军医学硕士学位文
18
1 ASPP2 基 RT PCR 产物做胶回收
11 新鲜 TAE buffer 跑电泳 TAE buffer TBE buffer 会胶回收率
降低
12 切需目基条带 UV 射超 30 秒
13 切胶称重 1gml 浓度胶例 02g 胶体积约 02ml 加 34
倍体积 binding buffer 5565 温度 7min 直胶完全溶解 23 分钟振摇 EP
次
14 取 750 l 混合液加入滤柱 10000g 离心 1min 弃掉滤出液 混合液
体积超 750 l 重复前面步骤 滤柱胶回收量 2530 g 回收
DNA 量超限度 需分干滤柱回收
15 加 300 l binding buffer 1000g 离心 1min
16 加入 750 l 事先已混水乙醇 wash buffer 静置 23min 1000g 离心
1min
17 弃掉滤出液 重复步骤 6
18 弃掉滤出液 空滤柱 10000g 离心 1min
19 滤柱移入干净 EP 中 膜中央加入 3050 l DNA Elution buffer
菌离子水(PH 值必须 8 左右) 10000g 离心 1min
110 测胶回收 DNA 浓度测 A260A280 值
2 正义引物目基做单测序
七 凝胶图分析
电泳凝胶置凝胶图分析系统 相 采 GelPro31(Media Cyberneties
Inc USA)凝胶图分析软件分析处理 测定扩增产物量 PCR 产物量积分光密度
(integrated optical density IOD)表示 积分光密度电泳条带均光密度电泳条带
面积积 计算 mRNA ß actin 值 该 mRNA 相表达量
八 统计学处理
实验数采 SPSS80 软件进行处理 统计方法独立样 t 检验
实验结果
细胞培养
HL60 K562 Jurkat 等白血病细胞株悬浮生长 细胞呈圆形圆球形 (见
第三军医学硕士学位文
19
片 1) A549 HEPG2 MCF7 HCT116 HT29 等细胞株贴壁生长 细胞呈圆
形 椭圆形梭形(见片 2)
二 DNA RNA 提取
1 细胞 DNA 总 RNA 定量纯度
细胞株提取 DNA A260A280 190 表明提取 DNA 纯度较高
MSP 分析 总 RNA A260A280 185 表明提取总 RNA 纯度较高
RTPCR 扩增
2 取细胞株 DNA 总 RNA 完整性鉴定
DNA 直接电泳 结果点样端见条亮带 表明提取 DNA 完整性较 (见
片 3)
真核细胞总 RNA80 rRNA( 28S 18S 5S) mRNA 含量仅 1 5
数百数千碱基等 实验甲醛变性 RNA 凝胶电泳 见 28S 18S
5S 三条带清晰 间见分子量云雾状 mRNA 证明提取总 RNA 完整
性较 明显降解 (见片 4)
三 ASPP1 ASPP2 iASPP 基 mRNA 细胞株中 RTPCR 结果
1 RTPCR 结果
ASPP1 ASPP2 iASPP 基 mRNA HL60 K562 Jurkat HCT116 HT29
Hepg2 MCF7 A549 正常血液单核细胞成纤维细胞株中表达 细
胞中表达量少 (见片 5 6 7 8 9 10)
2 图扫描分析结果
GelPro 31 凝胶图扫描分析软件分分析 ASPP1 ASPP2 iASPP 基 mRNA
细胞株 HL60 K562 Jurkat HCT116 HT29 Hepg2 MCF7 A549 正常
血液单核细胞成纤维细胞株中条相应带 IOD 值 计算种细胞 IOD 值
ßactin IOD 值值 结果 x ±SD 表示(见 Table4) 细胞株 HL60 K562
Jurkat 扫描结果正常血液单核细胞扫描结果较 细胞株 HCT116 HT29
Hepg2 MCF7 A549 扫描结果成纤维细胞扫描结果较 分作 t 检验
计算 P 值(见 Table5 Table6)
第三军医学硕士学位文
20
Table4 The Expression of ASPP family genes mRNA in different Cell Lines ( x ±SD)
Destination genes
Cell lines
ASSP1 ASPP2 iASPP
Blood Monocyte 0545 0019 0869 0021 0228 0032
HL60 0199 0016 0815 0031 0363 0031
K562 0155 0081 0789 0016 0373 0045
Jurkat 0191 0015 0785 0025 0367 0017
Fibroblast 0636 0041 0594 0016 0249 0029
HCT116 0381 0023 0296 0008 0442 0025
HT29 0300 0026 0548 0013 0248 0017
A549 0205 0021 0459 0020 0275 0011
HEPG2 0158 0020 0456 0046 0633 0034
MCF7 0205 0021 0466 0027 0520 0039
ASPP1
0
01
02
03
04
05
06
07
Cell Lines
Relative content of ASPP1 mRNA
Blood Monocyte
HL60
K562
Jurkat
Fibriblast
HCT116
HT29
A549
HEPG2
MCF7
Figure1 The Expression of ASPP1 genes mRNA in different Cell Lines
第三军医学硕士学位文
21
ASPP2
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
1
Cell Lines
Relative content of ASPP2 mRNA
Blood Monocyte
HL60
K562
Jurkat
Fibriblast
HCT116
HT29
A549
HEPG2
MCF7
Figure 2 The Expression of ASPP2 genes mRNA in different Cell Lines
iASPP
0
01
02
03
04
05
06
07
Cell Lines
Relative content of iASPP mRNA
Blood Monocyte
HL60
K562
Jurkat
Fibriblast
HCT116
HT29
A549
HEPG2
MCF7
Figure 3 The Expression of ASPP2 genes mRNA in different Cell Lines
第三军医学硕士学位文
22
Table5 The P value of three suspension cell lines comparing to blood monocyte (ttest)
ASPP1 ASPP2 iASPP
HL60 P<001 P<005 P<001
K562 P<001 P<001 P<001
Jurkat P<001 P<005 P<001
Table6 The P value of five anchorage cell lines comparing to fibroblast cell (ttest)
ASPP1 ASPP2 iASPP
HCT116 P<001 P<001 P<001
HT29 P<001 P<001 P<001
A549 P<001 P<001 P>005
HEPG2 P<001 P<001 P<001
MCF7 P<001 P<001 P>005
四 目基胶回收测序结果
1 胶回收结果
目基 ASPP2 cDNA 胶回收浓度 271 gml A260A280 19257
2 测序结果
DNA 序列测定 285 碱基 ASPP2 基序列 2419 2703 285 碱基
完全相 PCR 扩增目片段 测序具体结果
CGAAAGAAACTGTCTAACGCACCAAGGCCTCTAAAGAAACGTAGTTCTATTACAGAGCCAGAGGGTCCTAATGG
GCCAAATATTCAGAAGCTTTTATATCAGAGGACCACCATAGCGGCCATGGAGACCATCTCTGTCCCATCATACC
CATCCAAGTCAGCTTCTGTGACTGCCAGCTCAGAAAGCCCAGTAGAAATCCAGAATCCATATTTACATGTGGAG
CCCGAAAAGGAGGTGGTCTCTCTGGTTCCTGAATCATTGTGCCCCAGAGGATGTGGGGAATGCC
测序图谱
第三军医学硕士学位文
23
讨
p53 ASPP 家族结构功
p53 基认识历肿瘤抗原 癌蛋白抑癌基三阶段[14] 年
研究证明起癌基作 p53 基突变体 正常 p53 基(野生型)参
细胞生长负性调控 抑制肿瘤发生 发展
类 p53 基定位 17 号染色体短臂(17p131) 长度约 20Kb 11 外显子
第三军医学硕士学位文
24
10 含子组成 第 1 外显子编码 外显子 2 4 5 7 8 分编码 5 进化
高度保守结构域 5 高度保守区 1319 117142 171192 236258 270286
编码区 p53 蛋白 393 氨基酸组成 级结构分三结构域 第结
构域 N端开始 包括 17~80 区含酸性氨基酸较 该区二级结构部分 螺
旋 第二结构域包括 75~150 肽 区含疏水脯氨基较 疏水区 二级
结构长短等片层结构 11 片层相互反回折成夹心结构 核心疏水
区 高度保守突变区 第三结构域包括 C 端 319~393 肽段区域 含碱性氨
基酸较 碱性区 三结构域功 N端(1~43 肽段)作转录子
促进基转录 102~292 肽段区域 DNA 特异序列结合 处结合需 Zn2+
C端(300~393 肽段) p53 四聚化 DNA 呈非特异结合等关 野生型 p53 蛋
白 DNA 受损高度相关性 通影响编码细胞周期相关蛋白质基表达
调控细胞周期 G1 停滞
ASPP(apoptosis stimulating protein of p53)[7] p53 凋亡刺激蛋白 2001 年英国帝
国癌症研究抑癌基研究室卢欣教授领导研究组发现新蛋白家族
包括 ASPP1 ASPP2 iASPP(inhibitory member of the ASPP family)[8]三成员 该家
族结构特点 SH3 结构域 量锚蛋白重复 丰富谷氨基结构
域 ASPP 命名 ankyrin repeat SH3 domain prolinerich domain
containing proteins 缩写
ASPP1 PPP1R13B 基编码 1090 氨基酸组成蛋白质 功性氨基
酸区域 pro ank SH3 组成 p53BP2Bbp 源性蛋白质 ASPP1 C末
端 948 氨基酸 KIAA0771 蛋白相 377氨基酸 p53BP2相 ASPP2
p53BP2 编码 1128 氨基酸组成蛋白质 功性氨基酸区域 pro
ank SH3 helical 组成 ASPP2 编码 1128 氨基酸蛋白延伸 1005 氨基酸
p53BP2 ASPP1 ASPP2 蛋白 N末端 C末端相似性
MMPM 序列开始 蛋氨酸开始转录 Chen YuZhi[[15]等研究发现 ASPP2
够抑制 APPBP1 拯救 ts41 细胞突变力 时阻止 APPBP1 诱导神细胞
凋亡 ASPP1 ASPP2 减弱 Ras Ras+E7 Ras+E1A 等原癌蛋白转化潜 ASPP1
ASPP2 促进 p53 细胞凋亡功特异 功增强 p53 DNA 结
合 促进 p53 凋亡基启动子活化 增强 p53 细胞凋亡功 细胞程序性死亡
(programmed cell death PCD) 清机体余细胞 ASPP1 ASPP2 野生型
p53 结合 突变型 p53 结合 突变型 53 结合力野生型 p53
第三军医学硕士学位文
25
结合力弱 肿瘤发生程中 p53 序列旦突变 ASPP1 ASPP2
结合 阻止 p53 诱导细胞凋亡
iASPP 类 PPP1R13L 基编码 线虫中 ape1(apoptotic enhancer
1)基编码[34] 315 氨基酸组成 p65 A结合蛋白 C末端 223
氨基酸 53BP2 C末端 52相 iASPP CeiASPP(Celegans iASPP)
C末端 ASPP1 ASPP2 C末端广泛相似性 iASPP Ras E1A E7
合作癌蛋白 iASPP 表达增强 Ras Ras+E7 Ras+E1A 转化活性
增强突变 Ras p53 Ras+p53H175 Ras+p53L173 转化活性 功
p53 p53H175 p53L173 突变 ASPP1 ASPP2 竞争性 p53 结合位点结
合 抑制 p53 抑癌功 野生型 p53 ASPP 表达水正常乳腺癌中
高表达 CeiASPP 通抑制 Cep53 促凋亡活性抑制 Cep53 凋亡功[1617]
二 p53 ASPP 家族细胞凋亡
年认 肿瘤发生仅细胞增生关 细胞凋亡关 细胞凋亡
受基严格调控 抑癌基 p53 迄发现类肿瘤相关性高基 野生
型 p53 基维持细胞正常生长 抑制恶性增殖程中起着重作[1819] 突变型
p53 基细胞凋亡抑制作 p53 基发生突变 细胞失身
监视机制 促进细胞癌变
P53 介导细胞凋亡身特点 首先 p53 介导凋亡凋亡细胞处细胞
周期中位置关 发生细胞周期阶段[20] 次 p53 诱发细胞凋亡
力受细胞 DNA 受损状况影响 受细胞环境影响[21] 次 p53 介导细
胞凋亡活性细胞类型密切相关[22] p53 介导细胞凋亡机制目前十分清楚
现三种推测解释细胞 p53 影响选择凋亡分裂停滞 第种
剂量反应模型 低水 p53 诱导产生细胞停滞 高水 p53 启动细胞凋亡[23]
第二种 细胞背景 (cellbackground)假设认细胞 p53 反应细胞周围环境决
定 细胞表达高水抗凋亡基更历生长停滞凋亡[24] 第
三种推测认 p53 作靶基启动子 p53 种修饰形式识[2526]
早 1994 年 Caelles 等[27]提出 p53 介导凋亡涉细胞生存相关基
p53 修复受损 DNA 相关基 直接凋亡相关基关 2001 年 ASPP
家族发现支持三种推测中第三种 时 Caelles 提出理相符合
ASPP 蛋白家族三功区 SH3 结构域 量锚蛋白重复 丰富谷氨
基结构域 SH3 结构域 ASPP 蛋白家族 p53 蛋白特异性结合部位 具体情况图 4
第三军医学硕士学位文
26
图 4 ASPP 蛋白家族 p53 特异性结合示意图
ASPP1 ASPP2 蛋白 p53 蛋白结合 刺激 p53 蛋白凋亡功 促进细胞凋亡 iASPP
蛋白 p53 蛋白结合 抑制 p53 蛋白凋亡功 抑制细胞凋亡
细胞 DNA 受损伤时 p53 蛋白面两种选择 促进细胞凋亡 二 促
细胞分裂停滞 修复损伤 DNA 果时 ASPP 蛋白家族 p53 蛋白特异性结合
ASPP 蛋白提高 p53 反应原凋亡基活力 促进 p53 蛋白赖细胞凋亡 ASPP
家族 p53 作总机制 ASPP p53 结合形成 ASPPp53 复合物作原凋亡基
启动子 ASPP 微变化引起 p53 结合 DNA 力发生改变 影响 p53
诱导凋亡力 细胞根 p53 蛋白停滞基结合凋亡基结合活力做
出细胞停滞细胞凋亡决定[8](见图 5)
图 5 p53 蛋白功示意图
第三军医学硕士学位文
27
细胞根 p53 蛋白停滞基结合凋亡基结合活力做出细胞分裂
停滞细胞凋亡决定 a 般情况 p53 识涉细胞停滞基启动子区域
诱导细胞分裂停滞 修复损伤细胞 DNA b ASPP 蛋白 p53 结合形成 ASPPp53
复合物时 整复合物便倾诱导凋亡基启动子相作 诱导细胞凋亡
三 ASPP 家族肿瘤细胞中表达分析
目前止 癌症然类头号敌 医学发展天 许种癌症
够早期诊断 患者生存期够延长 癌症然前床治疗难
题 死亡率极高疾病 2001 年 Lu[7]等发现 ASPP 蛋白家族 发现
ASPP 蛋白家族成员 p53 蛋白结合改变 p53 蛋白促凋亡功
类 p53 野生型乳腺癌细胞株研究中发现 ASPP1 ASPP2 蛋白 mRNA 表达呈
降 iASPP 蛋白 mRNA 表达呈升[8] 时通 p53 质粒转染实验研
究发现 转染细胞中 p53 表达细胞凋亡率约 17 p53 缺陷 ASPP1
ASPP2 表达正常细胞中 细胞凋亡较少 相反 转染细胞中 果 p53
ASPP1 ASPP2 表达 转染细胞凋亡率 50 表明 ASPP1 ASPP2 促
进 p53 细胞凋亡功 iASPP 肿瘤细胞中表达呈升 表明细胞凋
亡定相关性
类 p53 野生型乳腺癌细胞研究中发现 ASPP 家族肿瘤细胞凋亡较
相关性 该家族否肿瘤细胞凋亡作 目前清楚 特
p53 突变型肿瘤细胞株中 ASPP 家族细胞凋亡否关系尚明确 建
立检测 ASPP 家族 mRNA 表达水 RTPCR 方法 采该方法检测 ASPP 家
族 mRNA 成纤维细胞血液单核细胞肿瘤细胞株 HL60 K562 Jurkat HCT116
HT29 Hepg2 MCF7 A549 等十种细胞中表达情况 十种细胞中 成纤维
细胞 血液单核细胞 Hepg2 MCF7 A549 p53 野生型细胞[28] K562 Jurkat
HL60 p53 缺失型细胞[29] HT29 HCT116 p53 突变型细胞 HT29 细胞株
p53 基座突变发生密码子 273 处 单碱基突变(CGT
CAT)[30] HCT116 细胞株 p53 基座突变发生密码子 247248 处 碱基
突变胞嘧啶变鸟嘌呤(CCGG gCGG)[31]
次实验中 选择 ASPP2 基 RTPCR 产物做胶回收测序 测序结
果 建立 RTPCR 方法完全 时 次实验 RTPCR 产物
电泳图片均 GelPro 31 凝胶图扫描分析软件分析 结果显示 ASPP 家族试验
细胞中均程度表达 实验肿瘤细胞株中 ASPP1 表达量明显低
第三军医学硕士学位文
28
正常细胞表达量(P<001) ASPP2 表达量细胞株中表达差异较
正常细胞表达量相 表达量呈降(P<005) iASPP 表达量 A549
HT29 细胞株中正常细胞显著性差异(P>005) 肿瘤细胞株表达量均高
正常细胞表达量(P<001) 结果说明 ASPP 家族仅 p53 野生型肿瘤细胞
株中表达量改变 p53 突变型 p53 缺陷型肿瘤细胞株均改变
ASPP 蛋白家族改变 p53 细胞凋亡功 Lu[7]等研究结果次实验结
果 ASPP 家族表达量改变仅 p53 野生型细胞株发生恶变关
p53 突变型 p53 缺陷型细胞株发生恶变关 Izidore SLossos 等[32]荧光定量
RTPCR 免疫组化等方法弥漫性 B 淋巴细胞瘤(DLBCL)滤泡性淋巴瘤(FCL)
ASPP2 研究 发现 ASPP2 表达高患者存活时间长 ASPP2 表达低患者存活时
间短 提示 ASPP 家族表达量高低肿瘤预关
第三军医学硕士学位文
29
第二部分 ASPP 基启动子 CpG 甲基化状况研究
体细胞均携带构成身体需全部成分编码基 中
仅少部分处活跃表达状态 基外遗传学修饰作开关样 协
助控制基活性 保证特定类型细胞中确需基处开启状
态[33] 细胞中特定基活性状态信息储存细胞分裂时传递
代
DNA 甲基化熟知基外遗传信号 甲基基团构成遗
传密码四化学碱基胞嘧啶进行修饰 必须遵守规律
DNA 甲基化基表达沉默相关 处活跃表达中基通常处未甲
基化状态[ 34] DNA 甲基化状态改变致癌作关键素 肿瘤抑制基
失活方式 通基机制基外机制导致细胞增殖分化相关基表达异
常 造成细胞失正常程控制发生恶变形成肿瘤[35] ASPP[ 7] 基 2001
年新发现促细胞凋亡基 细胞凋亡程中起着非常重作 该基
否存甲基化现 国外尚未相关报道
DNA 甲基化检测方法样[36] 早期利甲基化位点敏感 II 型限制性
切酶测定 DNA 特异位点 现限制性标指性基组扫描(restriction landmark
genomic scanning RLGS)[37] 表差异分析法(Representational difference analysis
RDA) 甲基化敏感机引物 PCR(Methylationsensitive arbitrarily primed PCR
APPCR) 甲基化 CpG 岛扩增技术(Methylation CpG islands amplification MCA)[38]
甲基化特异性 PCR (methylation specific PCR MSP) [11]等方法技术 目前常成
熟方法 MSP 通网 CpG 岛分析软件 ASPP 基 CpG 岛进行分析
利 MSP34 软件设计 ASPP 甲基化引物 建立检测 ASPP 基甲基化状
况方法 MSP 3 株 p53 野生型肿瘤细胞株 ASPP 基甲基化状况进行检测
解 ASPP 基甲基化状况细胞发生肿瘤关系 现报告
实验材料
细胞株(见第部分细胞株)
二 仪器(见第部分仪器)
第三军医学硕士学位文
30
三 试剂
1 巯基乙醇 海化学试剂公司
2 PCR Core system Promega
3 CpGenome TM DNA Modification Kit Intergen
4 余见第部分试剂
四 试剂配制
1 DNA 修饰试剂 II 溶解
750 l l 巯基乙醇加入 20ml 离子水配制溶液加入 135gDNA 修
饰试剂 II(份样品量) 配制该溶液程中注意试剂呼吸道皮肤刺激作
充分混匀保证完全溶解 1525 避光保存 6 周
2 3M NaOH 原液配制(次前新鲜配制)
1gNaOH 溶 83ml 水中
3 20mM NaOH 90 乙醇(次前新鲜配制)
3M NaOH66 l 100 乙醇 900 l 水 934 l 配成 1ml 样溶液
4 DNA 修饰试剂 I 溶解(次前新鲜配制)
份样品量 227mg 试剂 I 溶 571 l 水中 配制该溶液程中
注意试剂呼吸道皮肤刺激作 约 40 l 3M NaOH 调节 PH 值 5 pH
试纸检测
实验方法
细胞培养 (见第部分实验方法)
二 DNA 提取 (见第部分实验方法)
三 DNA 亚硫酸氢盐修饰
第步 DNA 修饰程
1 70 l 3M NaOH 加入 100 l DNA(10ng l)溶液 充分混匀
2 37 孵育 10 分钟
3 加 550 l 新鲜配制 DNA 修饰试剂 I 旋转 振荡
4 50 孵育 16 20 时
第二步 化学修饰完成 DNA 清
1 力振荡 DNA 修饰试剂 III 悬浮
第三军医学硕士学位文
31
2 DNA 溶液中加入 5 l DNA 修饰试剂 III
3 加 750 l DNA 修饰试剂 II 混匀
4 室温孵育 5 10 分钟
5 5000 g 离心 1 min 弃层液
6 加 10ml 70 乙醇 5000 g 离心 1 min 弃层液 重复该步骤 3 次
7 通 3 次洗涤高速离心 2 3 分钟 吸吸残留悬浮液
8 加 50 l 20mM NaOH 90 乙醇溶解样品
9 旋转 混匀 室温孵育 5 分钟
10 5000 g 离心 1 min 加 10ml 90 乙醇 旋转洗涤 次离心 弃清液
重复该步骤次
11 高速离心 5 分钟
12 弃层液 加 25 50 l TE(10 mM Tris01 mM EDTA pH75) 简单旋
转保证 DNA 溶解 TE 量开初 DNA 量定
13 50 60 孵育 15 分钟
14 高速离心 2 3 分钟 清液转移 EP
15 进行 MSP 测序前 15 25 条件保存 2 月
四 基 CpG 岛分析引物设计
MSP 引物设计 普通 PCR 引物设计 考虑引物特异性包含
容易发生甲基化变化 CpG 序列 GeneBank获 ASPP1 ASPP2
基序列提交 httpitsaucsfedu~urolabmethprimerruleshtml网页 ASPP1 ASPP2
基 CpG 岛加分析 httpwwwchangbiosciencecomprimomhowtohtml 网页
MSP34 引物设计软件设计 ASPP1 ASPP2 基 MSP 引物
MSP 引物设计包括 3 组引物 野生型(W) 甲基化型(M) 非甲基化型(U)
中 W 没亚硫酸氢盐修饰 DNA 进行扩增 检验该基否存
发生改变 作阳性 M U 亚硫酸氢盐修饰 DNA 进行扩增
判断甲基化情况 种引物设计 M U 少出现阳性扩增带 W 相
利 MSP 结果判断 MSP 引物包含胞嘧啶 野生型
引物 3'末端附含 CpG 引物序列见表 7
第三军医学硕士学位文
32
Table 7 Summary of the MSP primer sets and Anealing for ASPP family
Primer Sequence Anealing
ASPP1Uf 5'TTTTGTATTTTGTTGTAGTTGTTGTT3' 46°C
ASPP1Ur 5'CACAAAAAAAATCCACAACACCC3’
ASPP1Mf 5'CGTATTTCGTCGTAGTTGTCGTT3' 51°C
ASPP1Mr 5'CGAAAAAAATCCGCGACGCCC3'
ASPP2Uf 5'GGTGTTTTAGTTTGTGTGGAGG3' 47°C
ASPP2Ur 5'CAAACTAAAATACCCCAAAAAATCA3'
ASPP2Mf 5'GTGTTTTAGTTCGCGCGGAGG3' 51°C
ASPP2Mr 5'ACCGAACTAAAATACCCCGAAAA3
引物海申友生物技术公司合成
五 MSP
1 MSP 反应液
Table8 冰水浴条件配制反应体系
Table 8 system of MSP reaction
Reagent Volume Final concentration
10 PCR Buffer 50 l 1 PCR Buffer
MgCl2 40 l 20mmolL
dNTP 10 l 02mmolL
Primer F 20 l 10mmolL
Primer R 20 l 10mmolL
DNA 50 l ~20ng l
Taq 1 l 5U
H2O 30 l
Total 500 l
述 MSP 反应液混匀 1000rpm 离心 10sec 加 300 l 液体石蜡进行扩增
2 MSP 反应条件
第三军医学硕士学位文
33
ASPP1 甲基化型反应条件
94 5 min 94 30 Sec 51 30 Sec 72 30 Sec 72 8min 4 保存
40 cycles
ASPP1 未甲基化型反应条件
94 5 min 94 30 Sec 51 30 Sec 72 30 Sec 72 8min 4 保存
40 cycles
ASPP2 甲基化型反应条件
94 5 min 94 30 Sec 505 30 Sec 72 30 Sec 72 8min 4 保存
40 cycles
ASPP2 未甲基化型反应条件
94 5 min 94 30 Sec 51 30 Sec 72 30 Sec 72 8min 4 保存
40 cycles
3 电泳结果判断
1 6 例取 15 l 溴酚兰 90 lPCR 产物混匀 点样 2琼脂糖
100V 电压电泳 1 hour 紫外灯观察结果 凝胶成分析仪处理结果
实验结果
ASPP1 ASPP2 基 CpG 岛分析结果
该软件分析 ASPP1 ASPP2 全序列出 ASPP1 基 CpG 序列集聚区 CpG
岛 10 ASPP2 基 CpG 序列集聚区 CpG 岛 3 ASPP1 基第 CpG
岛调控序列中均 34 碱基中 CpG 序列 ASPP2 基第 CpG 岛调
控序列中均 383 碱基中 CpG 序列 CpG 岛中 CG 序列出现
率低第 CpG 岛中 CG 序列出现率 说明 ASPP1 ASPP2 第 CpG
岛更易发生甲基化 ASPP1 ASPP2 基 CpG 岛分析具体结果
第三军医学硕士学位文
34
ASPP1 MethPrimer result
Sequence Name ASPP1
Sequence Length 3780
CpG island prediction results
Criteria used Island size > 100 GC Percent > 400 ObsExp > 060
10 CpG island(s) were found in your sequence
Size (Start End)
Island 1 161 bp (46 206)
Island 2 178 bp (328 505)
Island 3 168 bp (615 782)
Island 4 113 bp (898 1010)
Island 5 110 bp (1045 1154)
Island 6 134 bp (1947 2080)
Island 7 185 bp (2136 2320)
Island 8 107 bp (2741 2847)
Island 9 192 bp (2889 3080)
Island 10 227 bp (3229 3455)
第三军医学硕士学位文
35
1 GAGCCCCGCATCCCGCCGCAGCTGCCGCCTCGCCGCGGCCGGGCCGGAGAGCACGGCGGC
|||++||++++||||++|++++++|++||++||||||++|++|+
1 GAGTTTCGTATTTCGTCGTAGTTGTCGTTTCGTCGCGGTCGGGTCGGAGAGTACGGCGGC
61 GGGAGCGCGGCCTTAGGAGGCGGCCGGAGCGGTGGGCACAGCTCGGCGCGGAGCGTCCTG
+||||++++|||||||||++|++|||++|||||||||++|++++|||++|||
61 GGGAGCGCGGTTTTAGGAGGCGGTCGGAGCGGTGGGTATAGTTCGGCGCGGAGCGTTTTG
121 TCAGGCGGCGGCCGAGGGCGTCGCGGACTCTCCCCGCGATGATGCCGATGATATTAACTG
||||++|++|++||||++|++++||||++++||||||++||||||||||||
121 TTAGGCGGCGGTCGAGGGCGTCGCGGATTTTTTTCGCGATGATGTCGATGATATTAATTG
181 TTTTCTTGAGCAACAATGAACAGATTTTAACAGAAGTTCCTATAACACCGGAAACAACCT
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||++|||||||
181 TTTTTTTGAGTAATAATGAATAGATTTTAATAGAAGTTTTTATAATATCGGAAATAATTT
241 GTCGAGATGTTGTAGAATTTTGCAAGGAACCTGGAGAAGGCAGCTGCCATTTAGCTGAAG
||++||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
241 GTCGAGATGTTGTAGAATTTTGTAAGGAATTTGGAGAAGGTAGTTGTTATTTAGTTGAAG
301 TGTGGAGGGGAAATGAACGTCCCATACCCTTTGATCATATGATGTACGAACATCTTCAGA
|||||||||||||||||++||||||||||||||||||||++|||||||||
301 TGTGGAGGGGAAATGAACGTTTTATATTTTTTGATTATATGATGTACGAATATTTTTAGA
361 TATGGGGTCCACGGAGGGAAGAAGTGAAATTTTTCCTTCGACACGAGGACTCCCCAACTG
|||||||||++|||||||||||||||||||||||++||++|||||||||
361 TATGGGGTTTACGGAGGGAAGAAGTGAAATTTTTTTTTCGATACGAGGATTTTTTAATTG
421 AGAACAGTGAACAAGGTGGCCGTCAGACCCAAGAGCAACGAACTCAGAGAAATGTAATAA
|||||||||||||||||++|||||||||||++||||||||||||||||||
421 AGAATAGTGAATAAGGTGGTCGTTAGATTTAAGAGTAACGAATTTAGAGAAATGTAATAA
481 ATGTACCTGGAGATAAACGTACTGAATATGGGGTTGGGAATCCACGTGTTGAACTTACCC
|||||||||||||||++||||||||||||||||||||||++||||||||||
481 ATGTATTTGGAGATAAACGTATTGAATATGGGGTTGGGAATTTACGTGTTGAATTTATTT
541 TCTCAGAGCTCCAAGATATGGCAGCTAGGCAACAGCAGCAGATTGAAAATCAGCAGCAGA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
541 TTTTAGAGTTTTAAGATATGGTAGTTAGGTAATAGTAGTAGATTGAAAATTAGTAGTAGA
601 TGTTGGTTGCCAAGGAACAGCGTTTACATTTTCTAAAGCAACAGGAGCGCCGTCAGCAGC
|||||||||||||||||++|||||||||||||||||||||++++|||||
601 TGTTGGTTGTTAAGGAATAGCGTTTATATTTTTTAAAGTAATAGGAGCGTCGTTAGTAGT
第三军医学硕士学位文
36
661 AGTCTATTTCTGAAAATGAAAAGCTTCAGAAATTGAAAGAACGAGTTGAAGCCCAGGAGA
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||++||||||||||||||
661 AGTTTATTTTTGAAAATGAAAAGTTTTAGAAATTGAAAGAACGAGTTGAAGTTTAGGAGA
721 ACAAGCTGAAGAAAATTCGTGCAATGAGAGGACAAGTCGACTACAGCAAAATCATGAACG
|||||||||||||||++||||||||||||||||++|||||||||||||||++
721 ATAAGTTGAAGAAAATTCGTGTAATGAGAGGATAAGTCGATTATAGTAAAATTATGAACG
781 GCAATCTGTCTGCTGAAATAGAAAGGTTCAGTGCCATGTTCCAGGAAAAGAAGCAGGAAG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
781 GTAATTTGTTTGTTGAAATAGAAAGGTTTAGTGTTATGTTTTAGGAAAAGAAGTAGGAAG
841 TACAGACTGCAATTTTAAGGGTTGATCAGCTTAGTCAGCAATTGGAAGATTTAAAGAAAG
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
841 TATAGATTGTAATTTTAAGGGTTGATTAGTTTAGTTAGTAATTGGAAGATTTAAAGAAAG
901 GAAAACTGAATGGGTTCCAGTCTTACAATGGCAAATTGACGGGACCAGCGGCGGTGGAGT
|||||||||||||||||||||||||||||||||++|||||++|++|||||||
901 GAAAATTGAATGGGTTTTAGTTTTATAATGGTAAATTGACGGGATTAGCGGCGGTGGAGT
961 TAAAAAGACTGTACCAAGAACTACAGATTCGTAACCAACTTAACCAGGAACAAAATTCAA
||||||||||||||||||||||||++||||||||||||||||||||||
961 TAAAAAGATTGTATTAAGAATTATAGATTCGTAATTAATTTAATTAGGAATAAAATTTAA
1021 AACTTCAGCAGCAGAAGGAACTCTTAAATAAGCGCAACATGGAGGTGGCCATGATGGACA
||||||||||||||||||||||||||++|||||||||||||||||||||
1021 AATTTTAGTAGTAGAAGGAATTTTTAAATAAGCGTAATATGGAGGTGGTTATGATGGATA
1081 AGCGAATCAGTGAACTGCGTGAACGTCTCTATGGGAAAAAAATTCAGCTGAACCGTGTGA
||++|||||||||||++||||++|||||||||||||||||||||||++|||||
1081 AGCGAATTAGTGAATTGCGTGAACGTTTTTATGGGAAAAAAATTTAGTTGAATCGTGTGA
1141 ATGGCACGTCATCACCACAGTCCCCTCTGAGCACATCGGGCAGGGTCGCTGCTGTGGGGC
|||||++||||||||||||||||++|||||||++|||||||||
1141 ATGGTACGTTATTATTATAGTTTTTTTTGAGTATATCGGGTAGGGTCGTTGTTGTGGGGT
1201 CTTATATCCAGGTTCCCAGTGCCGGAAGCTTTCCTGTGCTGGGGGACCCTATAAAGCCCC
|||||||||||||||++|||||||||||||||||||||||||
1201 TTTATATTTAGGTTTTTAGTGTCGGAAGTTTTTTTGTGTTGGGGGATTTTATAAAGTTTT
1261 AGTCTCTCAGTATTGCCTCAAATGCTGCTCATGGAAGATCCAAATCCGCTAATGATGGAA
||||||||||||||||||||||||||||||||||++|||||||||||
1261 AGTTTTTTAGTATTGTTTTAAATGTTGTTTATGGAAGATTTAAATTCGTTAATGATGGAA
第三军医学硕士学位文
37
1321 ACTGGCCAACATTAAAACAGAATTCTAGCTCTTCCGTGAAACCAGTGCAGGTGGCCGGTG
|||||||||||||||||||||||||++|||||||||||||||++|||
1321 ATTGGTTAATATTAAAATAGAATTTTAGTTTTTTCGTGAAATTAGTGTAGGTGGTCGGTG
1381 CAGACTGGAAGGATCCGAGCGTGGAGGGGTCTGTCAAGCAGGGCACTGTCTCCAGCCAGC
||||||||||||++||++||||||||||||||||||||||||||||
1381 TAGATTGGAAGGATTCGAGCGTGGAGGGGTTTGTTAAGTAGGGTATTGTTTTTAGTTAGT
1441 CTGTGCCCTTCTCAGCACTGGGACCCACGGAGAAGCCGGGCATCGAGATTGGTAAAGTGC
||||||||||||||||++||||||++||||++||||||||||||||
1441 TTGTGTTTTTTTTAGTATTGGGATTTACGGAGAAGTCGGGTATCGAGATTGGTAAAGTGT
1501 CACCTCCCATCCCGGGTGTAGGCAAGCAGCTGCCTCCAAGCTATGGGACATACCCAAGTC
||||++|||||||||||||||||||||||||||||||||
1501 TATTTTTTATTTCGGGTGTAGGTAAGTAGTTGTTTTTAAGTTATGGGATATATTTAAGTT
1561 CTACACCTCTGGGTCCTGGGTCGACAAGCTCCCTGGAAAGGAGGAAGGAAGGCAGCTTGC
||||||||||||||++|||||||||||||||||||||||||||||
1561 TTATATTTTTGGGTTTTGGGTCGATAAGTTTTTTGGAAAGGAGGAAGGAAGGTAGTTTGT
1621 CCAGGCCCAGTGCAGGCCTGCCAAGTCGACAGAGGCCCACCCTGCTGCCCGCCACAGGCA
||||||||||||||||++|||||||||||++|||||
1621 TTAGGTTTAGTGTAGGTTTGTTAAGTCGATAGAGGTTTATTTTGTTGTTCGTTATAGGTA
1681 GCACCCCCCAGCCAGGCTCCTCACAACAGATTCAGCAGAGGATTTCCGTACCGCCAAGTC
||||||||||||||||||||||||||||++||++||||
1681 GTATTTTTTAGTTAGGTTTTTTATAATAGATTTAGTAGAGGATTTTCGTATCGTTAAGTT
1741 CCACGTACCCGCCAGCGGGACCACCTGCATTTCCAGCTGGGGACAGCAAGCCTGAACTCC
|++||++||++||||||||||||||||||||||||||||
1741 TTACGTATTCGTTAGCGGGATTATTTGTATTTTTAGTTGGGGATAGTAAGTTTGAATTTT
1801 CACTGACAGTGGCCATTAGGCCTTTCCTGGCTGATAAAGGGTCAAGGCCACAGTCTCCCA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1801 TATTGATAGTGGTTATTAGGTTTTTTTTGGTTGATAAAGGGTTAAGGTTATAGTTTTTTA
1861 GGAAAGGACCCCAGACAGTGAATTCAAGTTCCATATACTCCATGTACCTCCAGCAAGCCA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1861 GGAAAGGATTTTAGATAGTGAATTTAAGTTTTATATATTTTATGTATTTTTAGTAAGTTA
1921 CACCACCTAAGAATTACCAGCCGGCAGCACACAGCGCCTTAAATAAGTCAGTTAAAGCAG
|||||||||||||++|||||||++||||||||||||||||||||
1921 TATTATTTAAGAATTATTAGTCGGTAGTATATAGCGTTTTAAATAAGTTAGTTAAAGTAG
第三军医学硕士学位文
38
1981 TGTATGGTAAGCCCGTTTTACCTTCGGGTTCAACCTCTCCATCGCCGCTGCCGTTTCTTC
|||||||||||++|||||||++||||||||||++++||++|||||
1981 TGTATGGTAAGTTCGTTTTATTTTCGGGTTTAATTTTTTTATCGTCGTTGTCGTTTTTTT
2041 ACGGGTCACTGTCCACGGGCACACCACAGCCTCAGCCACCTTCAGAAAGTACTGAGAAAG
|++||||||||++|||||||||||||||||||||||||||||
2041 ACGGGTTATTGTTTACGGGTATATTATAGTTTTAGTTATTTTTAGAAAGTATTGAGAAAG
2101 AGCCTGAGCAGGATGGCCCCGCCGCCCCCGCAGATGGCAGCACCGTGGAGAGCCTGCCAC
|||||||||||||++++++|||||||||++||||||||||+
2101 AGTTTGAGTAGGATGGTTTCGTCGTTTTCGTAGATGGTAGTATCGTGGAGAGTTTGTTAC
2161 GGCCACTCAGCCCCACCAAGCTCACGCCCATCGTGCATTCGCCACTGCGCTACCAGAGTG
+|||||||||||++||++|||||++|||++||||||||
2161 GGTTATTTAGTTTTATTAAGTTTACGTTTATCGTGTATTCGTTATTGCGTTATTAGAGTG
2221 ATGCAGACCTGGAGGCCCTCCGCAGGAAGCTGGCCAACGCGCCCCGGCCCCTGAAAAAGC
|||||||||||||++|||||||||||++++++|||||||||+
2221 ATGTAGATTTGGAGGTTTTTCGTAGGAAGTTGGTTAACGCGTTTCGGTTTTTGAAAAAGC
2281 GCAGCTCCATCACAGAGCCCGAGGGCCCCGGCGGGCCCAACATCCAGAAGCTGCTGTACC
+||||||||||++||||++|++|||||||||||||||||
2281 GTAGTTTTATTATAGAGTTCGAGGGTTTCGGCGGGTTTAATATTTAGAAGTTGTTGTATT
2341 AGCGCTTCAACACCCTGGCCGGTGGCATGGAGGGCACCCCTTTCTACCAGCCCAGCCCCT
||++||||||||++|||||||||||||||||||||||
2341 AGCGTTTTAATATTTTGGTCGGTGGTATGGAGGGTATTTTTTTTTATTAGTTTAGTTTTT
2401 CCCAGGACTTCATGGGCACCTTGGCCGATGTGGACAATGGAAACACCAATGCCAATGGAA
||||||||||||||||++|||||||||||||||||||||||||||
2401 TTTAGGATTTTATGGGTATTTTGGTCGATGTGGATAATGGAAATATTAATGTTAATGGAA
2461 ACCTGGAAGAGCTCCCCCCTGCCCAGCCCACAGCCCCACTCCCCGCTGAGCCTGCCCCGT
|||||||||||||||||||++||||||++|
2461 ATTTGGAAGAGTTTTTTTTTGTTTAGTTTATAGTTTTATTTTTCGTTGAGTTTGTTTCGT
2521 CATCAGATGCCAATGATAATGAGTTACCTTCCCCCGAACCAGAGGAGCTCATCTGTCCCC
||||||||||||||||||||||||++|||||||||||||||
2521 TATTAGATGTTAATGATAATGAGTTATTTTTTTTCGAATTAGAGGAGTTTATTTGTTTTT
2581 AAACCACCCACCAAACTGCCGAGCCGGCAGAGGACAATAACAACAACGTGGCCACGGTCC
||||||||||++||++||||||||||||||||++||||++||
2581 AAATTATTTATTAAATTGTCGAGTCGGTAGAGGATAATAATAATAACGTGGTTACGGTTT
第三军医学硕士学位文
39
2641 CCACCACGGAGCAGATCCCGAGTCCTGTGGCTGAGGCCCCATCTCCAGGGGAAGAGCAGG
||++|||||||++|||||||||||||||||||||||||||||
2641 TTATTACGGAGTAGATTTCGAGTTTTGTGGTTGAGGTTTTATTTTTAGGGGAAGAGTAGG
2701 TCCCTCCAGCACCTCTTCCCCCTGCCAGCCACCCTCCTGCCACCTCCACGAACAAGCGGA
|||||||||||||||||||++|||||++||
2701 TTTTTTTAGTATTTTTTTTTTTTGTTAGTTATTTTTTTGTTATTTTTACGAATAAGCGGA
2761 CCAACTTGAAGAAGCCCAACTCGGAGCGGACGGGGCACGGGCTGAGAGTCCGGTTTAACC
||||||||||||||++|||++||++||||++|||||||||++||||||
2761 TTAATTTGAAGAAGTTTAATTCGGAGCGGACGGGGTACGGGTTGAGAGTTCGGTTTAATT
2821 CCCTGGCACTGCTCCTAGACGCGTCTCTGGAAGGAGAGTTCGATCTGGTGCAGAGGATCA
|||||||||||++++|||||||||||||||++|||||||||||||||
2821 TTTTGGTATTGTTTTTAGACGCGTTTTTGGAAGGAGAGTTCGATTTGGTGTAGAGGATTA
2881 TCTATGAGGTGGAAGATCCCAGCAAGCCCAACGATGAAGGGATCACCCCACTGCACAACG
|||||||||||||||||||||||++|||||||||||||||||++
2881 TTTATGAGGTGGAAGATTTTAGTAAGTTTAACGATGAAGGGATTATTTTATTGTATAACG
2941 CCGTCTGCGCCGGCCACCATCACATCGTGAAGTTCCTGCTGGATTTTGGTGTCAACGTGA
++|||++++|||||||++||||||||||||||||||||||||++|||
2941 TCGTTTGCGTCGGTTATTATTATATCGTGAAGTTTTTGTTGGATTTTGGTGTTAACGTGA
3001 ATGCTGCTGATAGTGATGGATGGACGCCGCTGCACTGCGCTGCCTCTTGTAACAGCGTTC
||||||||||||||||||||||++++|||||++|||||||||||++||
3001 ATGTTGTTGATAGTGATGGATGGACGTCGTTGTATTGCGTTGTTTTTTGTAATAGCGTTT
3061 ACCTCTGCAAACAGCTGGTGGAGAGTGGTGCCGCCATTTTTGCCTCAACCATAAGCGACA
||||||||||||||||||||||||++|||||||||||||||++||
3061 ATTTTTGTAAATAGTTGGTGGAGAGTGGTGTCGTTATTTTTGTTTTAATTATAAGCGATA
3121 TTGAAACTGCTGCAGACAAGTGTGAGGAGATGGAGGAAGGCTACATCCAGTGCTCCCAGT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3121 TTGAAATTGTTGTAGATAAGTGTGAGGAGATGGAGGAAGGTTATATTTAGTGTTTTTAGT
3181 TTCTATATGGGGTGCAGGAAAAGCTGGGTGTGATGAACAAAGGTGTGGCGTATGCTCTGT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||++||||||||
3181 TTTTATATGGGGTGTAGGAAAAGTTGGGTGTGATGAATAAAGGTGTGGCGTATGTTTTGT
3241 GGGACTACGAGGCCCAGAACAGTGACGAGCTGTCCTTCCACGAAGGGGACGCCCTCACCA
||||||++||||||||||||++||||||||++|||||||++|||
3241 GGGATTACGAGGTTTAGAATAGTGACGAGTTGTTTTTTTACGAAGGGGACGTTTTTATTA
第三军医学硕士学位文
40
3301 TCCTGAGGCGCAAGGACGAAAGCGAGACTGAGTGGTGGTGGGCTCGCCTTGGAGACCGGG
||||||++|||||++||||++||||||||||||||||||++|||||||++||
3301 TTTTGAGGCGTAAGGACGAAAGCGAGATTGAGTGGTGGTGGGTTCGTTTTGGAGATCGGG
3361 AGGGCTATGTGCCCAAAAACCTGCTGGGGCTGTATCCACGGATCAAACCCCGACAGCGAA
||||||||||||||||||||||||||||++||||||++|||++||
3361 AGGGTTATGTGTTTAAAAATTTGTTGGGGTTGTATTTACGGATTAAATTTCGATAGCGAA
3421 CACTCGCCTGAACTTCCTTTTGGAGCACCGCATGGTCTTGCCAGCTACCAGGAGCCACTT
||++|||||||||||||||++||||||||||||||||||||
3421 TATTCGTTTGAATTTTTTTTTGGAGTATCGTATGGTTTTGTTAGTTATTAGGAGTTATTT
3481 AAGAGATTATTGTGCTGTTTTCCAGGAAAGCTGCAGCTAGAAAATGGTCTTAATGGTGCT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3481 AAGAGATTATTGTGTTGTTTTTTAGGAAAGTTGTAGTTAGAAAATGGTTTTAATGGTGTT
3541 CACTTTAGCAGACAGCGTCCACAATGTGAATCCTACAGTTTCCAGGTGAGGCCCTTTCTC
|||||||||||++||||||||||||||||||||||||||||||
3541 TATTTTAGTAGATAGCGTTTATAATGTGAATTTTATAGTTTTTAGGTGAGGTTTTTTTTT
3601 CAGTTTGCCCATTAACTGGGAGAGGTACTTTCGCCTCCAAGGACTGAATTTTGCCAATTA
|||||||||||||||||||||||||++||||||||||||||||||||
3601 TAGTTTGTTTATTAATTGGGAGAGGTATTTTCGTTTTTAAGGATTGAATTTTGTTAATTA
3661 CTATAAATCCAAATAAATACCCACTTTCAAAACACCCACCCCTCTTGCCATTAAGAAGTC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3661 TTATAAATTTAAATAAATATTTATTTTTAAAATATTTATTTTTTTTGTTATTAAGAAGTT
3721 CCATAACCCCCGGTTGGTTGCCAGTGAAGACAGAAGCTCTTACTGACTTGGCCCCGAGGC
||||++||||||||||||||||||||||||||||||||++|||
3721 TTATAATTTTCGGTTGGTTGTTAGTGAAGATAGAAGTTTTTATTGATTTGGTTTCGAGGT
第三军医学硕士学位文
41
ASPP2 MethPrimer result
Sequence Name ASPP2
Sequence Length 3180
CpG island prediction results
Criteria used Island size > 100 GC Percent > 400 ObsExp > 060
3 CpG island(s) were found in your sequence
Size (Start End)
Island 1 260 bp (47 306)
Island 2 168 bp (358 525)
Island 3 138 bp (2329 2466)
第三军医学硕士学位文
42
1 GTCACGAGCGTCGAAGAGACAAAGCCGCGTCAGGGGGCCCGGCCGGGGCGGGGGAGCCCG
|||++||++|++||||||||||++++|||||||++|++|||++||||||++
1 GTTACGAGCGTCGAAGAGATAAAGTCGCGTTAGGGGGTTCGGTCGGGGCGGGGGAGTTCG
61 GGGCTTGTTGGTGCCCCAGCCCGCGCGGAGGGCCCTTCGGACCCGCGCGCCGCCGCTGCC
||||||||||||||++++++|||||||++||++++++++++||+
61 GGGTTTGTTGGTGTTTTAGTTCGCGCGGAGGGTTTTTCGGATTCGCGCGTCGTCGTTGTC
121 GCCGCCGCCGCCTCGCAACAGGTCCGGGCGGCCTCGCTCTCCGCTCCCCTCCCCCGCATC
+++++++|++||||||++||++||++||++||++||
121 GTCGTCGTCGTTTCGTAATAGGTTCGGGCGGTTTCGTTTTTCGTTTTTTTTTTTCGTATT
181 CGCGACCCTCCGGGGCACCTCAGCTCGGCCGGGGCCGCAGTCTGGCCACCCGCTTCCATG
++++||++||||||||++|++|||++|||||||++|||||
181 CGCGATTTTTCGGGGTATTTTAGTTCGGTCGGGGTCGTAGTTTGGTTATTCGTTTTTATG
241 CGGTTCGGGTCCAAGATGATGCCGATGTTTCTTACCGTGTATCTCAGTAACAATGAGCAG
++|||++||||||||||||++|||||||||++|||||||||||||||||||
241 CGGTTCGGGTTTAAGATGATGTCGATGTTTTTTATCGTGTATTTTAGTAATAATGAGTAG
301 CACTTCACAGAAGTTCCAGTTACTCCAGAAACAATATGCAGAGACGTGGTGGATCTGTGC
|||||||||||||||||||||||||||||||||++||||||||||||
301 TATTTTATAGAAGTTTTAGTTATTTTAGAAATAATATGTAGAGACGTGGTGGATTTGTGT
361 AAAGAACCCGGCGAGAGTGATTGCCATTTGGCTGAAGTGTGGTGTGGCTCTGAACGTCCA
||||||++|++||||||||||||||||||||||||||||||||||||++||
361 AAAGAATTCGGCGAGAGTGATTGTTATTTGGTTGAAGTGTGGTGTGGTTTTGAACGTTTA
421 GTTGCGGATAATGAGCGAATGTTTGATGTTCTTCAACGATTTGGAAGTCAGAGGAACGAA
||||++|||||||||++|||||||||||||||||++|||||||||||||||||++||
421 GTTGCGGATAATGAGCGAATGTTTGATGTTTTTTAACGATTTGGAAGTTAGAGGAACGAA
481 GTTCGCTTCTTCCTTCGTCATGAACGCCCCCCTGGCAGGGACATTGTGAGTGGACCAAGA
|||++||||||++||||||++||||||||||||||||||||||||
481 GTTCGTTTTTTTTTTCGTTATGAACGTTTTTTTGGTAGGGATATTGTGAGTGGATTAAGA
541 TCTCAGGATCCAAGTTTAAAAAGAAATGGTGTAAAAGTTCCTGGTGAATATCGAAGAAAG
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||++|||||||
541 TTTTAGGATTTAAGTTTAAAAAGAAATGGTGTAAAAGTTTTTGGTGAATATCGAAGAAAG
601 GAGAACGGTGTTAATAGTCCTAGGATGGATCTGACTCTTGCTGAACTTCAGGAAATGGCA
|||||++||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
601 GAGAACGGTGTTAATAGTTTTAGGATGGATTTGATTTTTGTTGAATTTTAGGAAATGGTA
第三军医学硕士学位文
43
661 TCTCGCCAGCAGCAACAGATTGAAGCCCAGCAACAATTGCTGGCAACTAAGGAACAGCGC
||++||||||||||||||||||||||||||||||||||||||++
661 TTTCGTTAGTAGTAATAGATTGAAGTTTAGTAATAATTGTTGGTAATTAAGGAATAGCGT
721 TTAAAGTTTTTGAAACAACAAGATCAGCGACAACAGCAACAAGTTGCTGAGCAGGAGAAA
||||||||||||||||||||||||++|||||||||||||||||||||||||
721 TTAAAGTTTTTGAAATAATAAGATTAGCGATAATAGTAATAAGTTGTTGAGTAGGAGAAA
781 CTTAAAAGGCTAAAAGAAATAGCTGAGAATCAGGAAGCTAAGCTAAAAAAAGTGAGAGCA
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
781 TTTAAAAGGTTAAAAGAAATAGTTGAGAATTAGGAAGTTAAGTTAAAAAAAGTGAGAGTA
841 CTTAAAGGCCACGTGGAACAGAAGAGACTAAGCAATGGGAAACTTGTGGAGGAAATTGAA
||||||||++|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
841 TTTAAAGGTTACGTGGAATAGAAGAGATTAAGTAATGGGAAATTTGTGGAGGAAATTGAA
901 CAGATGAATAATTTGTTCCAGCAAAAACAGAGGGAGCTCGTCCTGGCTGTGTCAAAAGTA
||||||||||||||||||||||||||||||||++||||||||||||||||
901 TAGATGAATAATTTGTTTTAGTAAAAATAGAGGGAGTTCGTTTTGGTTGTGTTAAAAGTA
961 GAAGAACTGACCAGGCAGCTAGAGATGCTCAAGAACGGCAGGATCGACAGCCACCATGAC
||||||||||||||||||||||||||||++||||||++||||||||
961 GAAGAATTGATTAGGTAGTTAGAGATGTTTAAGAACGGTAGGATCGATAGTTATTATGAT
1021 AATCAGTCTGCAGTGGCTGAGCTTGATCGCCTCTATAAGGAGCTGCAGCTAAGAAACAAA
||||||||||||||||||||||++||||||||||||||||||||||||
1021 AATTAGTTTGTAGTGGTTGAGTTTGATCGTTTTTATAAGGAGTTGTAGTTAAGAAATAAA
1081 TTGAATCAAGAGCAGAATGCCAAGCTACAACAACAGAGGGAGTGTTTGAATAAGCGTAAT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||++||||
1081 TTGAATTAAGAGTAGAATGTTAAGTTATAATAATAGAGGGAGTGTTTGAATAAGCGTAAT
1141 TCAGAAGTGGCAGTCATGGATAAGCGTGTTAATGAGCTGAGGGACCGGCTGTGGAAGAAG
|||||||||||||||||||||++|||||||||||||||||++||||||||||||
1141 TTAGAAGTGGTAGTTATGGATAAGCGTGTTAATGAGTTGAGGGATCGGTTGTGGAAGAAG
1201 AAGGCAGCTCTACAGCAAAAAGAAAATCTACCAGTTTCATCTGATGGAAATCTTCCCCAG
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1201 AAGGTAGTTTTATAGTAAAAAGAAAATTTATTAGTTTTATTTGATGGAAATTTTTTTTAG
1261 CAAGCCGCGTCAGCCCCAAGCCGTGTGGCTGCAGTAGGTCCCTATATCCAGTCGTCTACT
|||++++||||||++||||||||||||||||||||||++||||
1261 TAAGTCGCGTTAGTTTTAAGTCGTGTGGTTGTAGTAGGTTTTTATATTTAGTCGTTTATT
第三军医学硕士学位文
44
1321 ATGCCTCGGATGCCCTCAAGGCCTGAATTGCTGGTGAAGCCAGCCCTGCCGGATGGTTCC
||||++||||||||||||||||||||||||||||++|||||||
1321 ATGTTTCGGATGTTTTTAAGGTTTGAATTGTTGGTGAAGTTAGTTTTGTCGGATGGTTTT
1381 TTGGTCATTCAGGCTTCAGAGGGGCCGATGAAAATACAGACACTGCCCAACATGAGATCT
||||||||||||||||||||++|||||||||||||||||||||||||
1381 TTGGTTATTTAGGTTTTAGAGGGGTCGATGAAAATATAGATATTGTTTAATATGAGATTT
1441 GGGGCTGCTTCACAAACTAAAGGCTCTAAAATCCATCCAGTTGGCCCTGATTGGAGTCCT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1441 GGGGTTGTTTTATAAATTAAAGGTTTTAAAATTTATTTAGTTGGTTTTGATTGGAGTTTT
1501 TCAAATGCAGATCTTTTCCCAAGCCAAGGCTCTGCTTCTGTACCTCAAAGCACTGGGAAT
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1501 TTAAATGTAGATTTTTTTTTAAGTTAAGGTTTTGTTTTTGTATTTTAAAGTATTGGGAAT
1561 GCTCTGGATCAAGTTGATGATGGAGAGGTTCCGCTGAGGGAGAAAGAGAAGAAAGTGCGT
|||||||||||||||||||||||||||++|||||||||||||||||||||||++|
1561 GTTTTGGATTAAGTTGATGATGGAGAGGTTTCGTTGAGGGAGAAAGAGAAGAAAGTGCGT
1621 CCGTTCTCAATGTTTGATGCAGTAGACCAGTCCAATGCCCCACCTTCCTTTGGTACTCTG
++||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1621 TCGTTTTTAATGTTTGATGTAGTAGATTAGTTTAATGTTTTATTTTTTTTTGGTATTTTG
1681 AGGAAGAACCAGAGCAGTGAAGATATCTTGCGGGATGCTCAGGTTGCAAATAAAAATGTG
||||||||||||||||||||||||||++|||||||||||||||||||||||||
1681 AGGAAGAATTAGAGTAGTGAAGATATTTTGCGGGATGTTTAGGTTGTAAATAAAAATGTG
1741 GCTAAAGTACCACCTCCTGTTCCTACAAAACCAAAACAGATTAATTTGCCTTATTTTGGA
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1741 GTTAAAGTATTATTTTTTGTTTTTATAAAATTAAAATAGATTAATTTGTTTTATTTTGGA
1801 CAAACTAATCAGCCACCTTCAGACATTAAGCCAGACGGAAGTTCTCAGCAGTTGTCAACA
||||||||||||||||||||||||++||||||||||||||||||
1801 TAAATTAATTAGTTATTTTTAGATATTAAGTTAGACGGAAGTTTTTAGTAGTTGTTAATA
1861 GTTGTTCCGTCCATGGGAACTAAACCAAAACCAGCAGGGCAGCAGCCGAGAGTGCTGCTA
||||||++||||||||||||||||||||||||||++||||||||||
1861 GTTGTTTCGTTTATGGGAATTAAATTAAAATTAGTAGGGTAGTAGTCGAGAGTGTTGTTA
1921 TCTCCCAGCATACCTTCGGTTGGCCAAGACCAGACCCTTTCTCCAGGTTCTAAGCAAGAA
|||||||||++||||||||||||||||||||||||||||||
1921 TTTTTTAGTATATTTTCGGTTGGTTAAGATTAGATTTTTTTTTTAGGTTTTAAGTAAGAA
第三军医学硕士学位文
45
1981 AGTCCACCTGCTGCTGCCGTCCGGCCCTTTACTCCCCAGCCTTCCAAAGACACCTTACTT
||||||||||++|++|||||||||||||||||||||
1981 AGTTTATTTGTTGTTGTCGTTCGGTTTTTTATTTTTTAGTTTTTTAAAGATATTTTATTT
2041 CCACCCTTCAGAAAACCCCAGACCGTGGCAGCAAGTTCAATATATTCCATGTATACGCAA
||||||||||||++|||||||||||||||||||||||||++||
2041 TTATTTTTTAGAAAATTTTAGATCGTGGTAGTAAGTTTAATATATTTTATGTATACGTAA
2101 CAGCAGGCGCCAGGAAAAAACTTCCAGCAGGCTGTGCAGAGCGCGTTGACCAAGACTCAT
|||||++||||||||||||||||||||||||++++|||||||||||
2101 TAGTAGGCGTTAGGAAAAAATTTTTAGTAGGTTGTGTAGAGCGCGTTGATTAAGATTTAT
2161 ACCAGAGGGCCACACTTTTCAAGTGTATATGGTAAGCCTGTAATTGCTGCTGCCCAGAAT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2161 ATTAGAGGGTTATATTTTTTAAGTGTATATGGTAAGTTTGTAATTGTTGTTGTTTAGAAT
2221 CAACAGCAGCACCCAGAGAACATTTATTCCAATAGCCAGGGCAAGCCTGGCAGTCCAGAA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2221 TAATAGTAGTATTTAGAGAATATTTATTTTAATAGTTAGGGTAAGTTTGGTAGTTTAGAA
2281 CCTGAAACAGAGCCTGTTTCTTCAGTTCAGGAGAACCATGAAAACGAAAGAATTCCTCGG
||||||||||||||||||||||||||||||||||++|||||||||++|
2281 TTTGAAATAGAGTTTGTTTTTTTAGTTTAGGAGAATTATGAAAACGAAAGAATTTTTCGG
2341 CCACTCAGCCCAACTAAATTACTGCCTTTCTTATCTAATCCTTACCGAAACCAGAGTGAT
|||||||||||||||||||||||||||||++|||||||||||
2341 TTATTTAGTTTAATTAAATTATTGTTTTTTTTATTTAATTTTTATCGAAATTAGAGTGAT
2401 GCTGACCTAGAAGCCTTACGAAAGAAACTGTCTAACGCACCAAGGCCTCTAAAGAAACGT
|||||||||||||++|||||||||||||++||||||||||||||++|
2401 GTTGATTTAGAAGTTTTACGAAAGAAATTGTTTAACGTATTAAGGTTTTTAAAGAAACGT
2461 AGTTCTATTACAGAGCCAGAGGGTCCTAATGGGCCAAATATTCAGAAGCTTTTATATCAG
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2461 AGTTTTATTATAGAGTTAGAGGGTTTTAATGGGTTAAATATTTAGAAGTTTTTATATTAG
2521 AGGACCACCATAGCGGCCATGGAGACCATCTCTGTCCCATCATACCCATCCAAGTCAGCT
|||||||||++||||||||||||||||||||||||||||
2521 AGGATTATTATAGCGGTTATGGAGATTATTTTTGTTTTATTATATTTATTTAAGTTAGTT
2581 TCTGTGACTGCCAGCTCAGAAAGCCCAGTAGAAATCCAGAATCCATATTTACATGTGGAG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2581 TTTGTGATTGTTAGTTTAGAAAGTTTAGTAGAAATTTAGAATTTATATTTATATGTGGAG
第三军医学硕士学位文
46
2641 CCCGAAAAGGAGGTGGTCTCTCTGGTTCCTGAATCATTGTCCCCAGAGGATGTGGGGAAT
++||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2641 TTCGAAAAGGAGGTGGTTTTTTTGGTTTTTGAATTATTGTTTTTAGAGGATGTGGGGAAT
2701 GCCAGTACAGAGAACAGTGACATGCCAGCTCCTTCTCCAGGCCTTGATTATGAGCCTGAG
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2701 GTTAGTATAGAGAATAGTGATATGTTAGTTTTTTTTTTAGGTTTTGATTATGAGTTTGAG
2761 GGAGTCCCAGACAACAGCCCAAATCTCCAGAATAACCCAGAAGAACCAAATCCAGAGGCT
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2761 GGAGTTTTAGATAATAGTTTAAATTTTTAGAATAATTTAGAAGAATTAAATTTAGAGGTT
2821 CCACATGTGCTTGATGTGTACCTGGAGGAGTACCCTCCATACCCACCCCCACCATACCCA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2821 TTATATGTGTTTGATGTGTATTTGGAGGAGTATTTTTTATATTTATTTTTATTATATTTA
2881 TCTGGGGAGCCTGAAGGGCCCGGAGAAGACTCGGTGAGCATGCGCCCGCCTGAAATCACC
|||||||||||||||++||||||||++||||||||++++|||||||+
2881 TTTGGGGAGTTTGAAGGGTTCGGAGAAGATTCGGTGAGTATGCGTTCGTTTGAAATTATC
2941 GGGCAGGTCTCTCTGCCTCCTGGTAAAAGGACAAACTTGCGTAAAACTGGCTCAGAGCGT
+||||||||||||||||||||||||||||++|||||||||||||++|
2941 GGGTAGGTTTTTTTGTTTTTTGGTAAAAGGATAAATTTGCGTAAAATTGGTTTAGAGCGT
3001 ATCGCTCATGGAATGAGGGTGAAATTCAACCCCCTTGCTTTACTGCTAGATTCGTCTTTG
||++|||||||||||||||||||||||||||||||||||||++|||||
3001 ATCGTTTATGGAATGAGGGTGAAATTTAATTTTTTTGTTTTATTGTTAGATTCGTTTTTG
3061 GAGGGAGAATTTGACCTTGTACAGAGAATTATTTATGAGGTTGATGACCCAAGCCTCCCC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3061 GAGGGAGAATTTGATTTTGTATAGAGAATTATTTATGAGGTTGATGATTTAAGTTTTTTT
3121 AATGATGAAGGCATCACGGCTCTTCACAATGCTGTGTGTGCAGGCCACACAGAAATCGTT
||||||||||||||++||||||||||||||||||||||||||||++||
3121 AATGATGAAGGTATTACGGTTTTTTATAATGTTGTGTGTGTAGGTTATATAGAAATCGTT
第三军医学硕士学位文
47
二 MSP 引物设计结果
ASPP1 ASPP2 基线软件 MSP34 设计 MSP 引物处第
CpG 岛中 引物序列达实验求 具体结果见 table 7
三 A549 K562 HEPG2 成纤维细胞 MSP 扩增结果
p53 野生型肿瘤细胞株 A549 K562 HEPG2 中 ASPP1 ASPP2 基甲基
化引物扩增产物 非甲基化引物没甲基化扩增产物 成纤维细胞中 ASPP1
ASPP2 基甲基化引物没扩增产物 非甲基化引物甲基化扩增产物(见片 11 12
13 14)
讨
基外遗传调控
拥相 DNA 甚常常样成长环境 完全相卵双生子
时显示出巨差 直遗传学家感困惑问题 目前 研究者认
改变 DNA 序列 称基外遗传学改变某基组细微修饰
关 认样解释遗传学完全相孪生子间存差异
基调控水发生 DNA 折叠 DNA 转录成 RNA RNA 翻译成蛋
白翻译发生加工程 DNA 甲基化精确调控方法 种遗传中
获 DNA 发生化学变化生性调控程 体细胞均携带构成
身体需全部成分编码基 中仅少部分处活跃表达状态 基
外遗传学修饰作开关样 协助控制基活性 保证特定类型
细胞中确需基处开启状态 细胞中特定基活性状态
信息储存细胞分裂时传递代
DNA 甲基化中熟知基外遗传信号 甲基基团构
成遗传密码四化学碱基胞嘧啶进行修饰 必须遵守规律
DNA 甲基化基表达沉默相关 处活跃表达中基通常处
未甲基化状态 DNA 甲基化容易导致基突变 DNA 链中 5甲基胞嘧啶
氨基团欠稳定 易发生发性水解 脱氨基转换 T 形成 T G 错配 5甲基胞
嘧啶胞嘧啶相更欠稳定性 样容易造成基甲基化位点点突变[38] 5mC 脱
氨基作产生点突变原[39] 时 DNA 甲基化导致某区域
DNA 构变化 影响蛋白质 DNA 相互作 抑制转录子启动区 DNA
第三军医学硕士学位文
48
结合效率
启动子区 DNA 分子甲基密度抑制基转录关键素 5甲基胞
嘧啶 DNA 分布机 基 5’端 3’端般较丰富 弱启
动子说 稀少甲基化完全失转录活性 类启动子增强时(带
增强子) 甲基化恢复转录活性 甲基化转录抑制强度甲
基 CpG 结合蛋白 1(methylCpGbinding protein 1 MeCP1)结合 DNA 力成正相关
甲基化 CpG 密度启动子强度间衡决定该启动子否具转录活性
基表达调控程系列核酸蛋白质相互作结果 DNA 甲基化甲
基化改变核酸分子构 导致某基隐蔽外基暴露 增强削
弱 DNA 蛋白质子结合 终影响基表达调控
二 基外遗传疾病
年中 科研员发现 某突变基处罕见特殊环
境中 通影响基组部位基外遗传学修饰发挥作 例
名 MECP2 基影响染色质重塑 出生时便携带突变 MECP2 基
孩子会逐渐丧失语言行走力 携带种突变形式 DNA 甲基化酶基患
者饱受免疫系统缺陷面部畸形折磨 外 种称 ATRX 基
果发生突变会导致智力迟钝 泌尿生殖器发育异常种贫血 明显染色
质结构 DNA 甲基化双重改变造成
肿瘤学家中 基外遗传学改变导致某肿瘤性疾病发生问题早已
达成识 家普遍认 基外遗传学改变癌症病学中占相重
位 早二十年前 约翰·霍普金斯学遗传学家首先研究发现 癌细胞中
确实存独特 DNA 甲基化模式 类似癌细胞中存基外遗传学
异常报道数量日俱增 研究发现种肿瘤基组中 肿瘤细胞 DNA 存
广泛低甲基化局部区域高甲基化存现 总甲基化力增高 意义
细胞生长分化密切关系癌基抗癌基 肿瘤细胞非 CpG 岛普遍性低
甲基化 肿瘤细胞中染色体 11P 短臂 17PCpG 岛 3PCpG 岛出现区域高甲基化
抑癌基高甲基化 肿瘤早期出现症状前 肿瘤中基组甲基化程度普遍
降低 Cmyc raf Cfos CHras CKras 等基 时肿瘤中特异癌基低甲
基化 肠癌中 CKras 基 Cmyc 基第三外显子低度甲基化 正常
细胞中完全甲基化 肿瘤细胞中抑癌基启动子区高甲基化 抑制抑
癌基转录 抑癌基失活 癌基充分甲基化导致基重新开放异
第三军医学硕士学位文
49
常表达 抑癌基度甲基化形成基突变靶点 Maria S Seongas[40]等报
告 1 例利甲基化程关闭 Apaf1 基(正常情况该基会导致细胞凋亡)转移性
黑素瘤 该基关闭时 肿瘤细胞化疗起反应存活发生转移
基组学研究吸引力已医学遗传学家注意集中 DNA 序
列邻结构 类基组计划实施重成果绘制获百
万单核苷酸态性(SNP)图谱 存体间基序列遗传密码子中
单碱基改变基组中位置 通观测单核苷酸态性常见病症
疑难病症连锁遗传 确定导致某特定疾病易感基位置 然
迄止 通单核苷酸态性基础建立方法未预期研究结果
导致研究者开始怀疑序列突变否致病素
诸生活方式 饮食惯等素疑会影响疾病易感性
便推测述素肯定会基组遗留微量基外遗传学痕迹
助解释什许疾病总进入老年发病 年龄增长时 DNA
甲基化等化学修饰改变断积累
目前 种称 azacitidine 抑制 DNA 甲基化药物已癌症患者中进
行实验性治疗 种药物加选择作整基组 研究
确认精神病 糖尿病疾病相关修饰 需进行更特异治疗
疑挑战 非克服 相信久 相应特异性药物出现
患者带希
三 MSP 甲基化检测实验原理
DNA 甲基化常常发生启动子 CpG 岛 甲基转移酶介导甲基转移 CpG 岛
胞嘧啶 形成甲基化胞嘧啶(5’MC) 常规克隆 PCR 等方法检测甲基化
位点相困难 DNA 扩增程中 甲基化信号消失 利甲基化敏感性限制
性核酸切酶消化 DNA 形成核酸片段 Southern 斑点法检测甲基化位点
酶消化完全造成假阳性假阴性结果 现 常方法亚
硫酸氢盐法 亚硫酸氢盐修饰 DNA 作模板 甲基化非甲基化差异利 PCR
检测出 PCR 产物进行测序 知道发生甲基化位点 样产生种
PCR 例 MSP[12] 甲基化敏感性单核苷引物延伸发(methylationsensitive single
nucleotide primer extension MsSNuPE)[41] 限制性核酸切酶法[42]等方法 方
法分析少数发生甲基化位点 方法利熔化温度差异 利
DGGE[43] DHPLC[44]分析
第三军医学硕士学位文
50
Fig 6 Example of direct DNA sequencing results of methylated and unmethylated bands
Cytosine residues outside of the CpG sites were converted to thymine after bisulfite treatment and PCR
CpG dinucleotides are underlined (A) Original sequence Before bisulfite treatment (B) Unmethylated
allele All cytosine were deaminated and converted to thymine (C) Methylated allele All cytosine
residues at CpG sites remained unchanged although other cytosines were converted to thymine
现广泛甲基化检测方法 MSP[12] MSP 检测剂量 DNA 甲基化状态
种新技术 具高敏感性 检测原理 亚硫酸氢盐选择性胞嘧啶变
尿嘧啶 甲基化胞嘧啶发生变化 利种甲基化非甲基化变化差异
亚硫酸氢盐处理 DNA 作模板 利特异性引物作 PCR 扩增产物通琼脂
糖电泳 DNA 测序检测基否发生甲基化 MSP 扩增否成功 引物
设计坏起着关重作 MSP 引物设计 普通 PCR 引物设计
考虑引物特异性包含容易发生甲基化变化 CpG 序列 MSP 引物
设计包括 3 组引物 野生型(W) 甲基化型(M) 非甲基化型(U) 中 W
没亚硫酸氢盐修饰 DNA 进行扩增 检验该基否存发生改变
作阳性 M U 亚硫酸氢盐修饰 DNA 进行扩增 判断甲基化
情况 该方法特点 避免限制性酶消化完全带假性结果 灵敏
度高 微量分析源基分析 检测 CpG 仅仅局限限制性酶切位点
没假阳性结果 石蜡包埋样品分析[46]
DNA 完整性 MSP 分析重 亚硫酸氢盐修饰 DNA 程 NaOH
处理形成 DNA 单链进行修饰[41] 果修饰 DNA 完整 导致 MSP 失
第三军医学硕士学位文
51
败 实验程中出现 DNA 完整性较时候 DNA 电泳结果点样端出
现亮带 MSP 结果 相反 MSP 出现结果 提取 DNA 求纯度高
定量求准确 修饰 DNA 微量 果修饰前 DNA 纯定量准
修饰 DNA 极微量 导致 MSP 出现假阴性结果
四 p53 野生型肿瘤细胞株 ASPP 基启动子甲基化状态分析
肿瘤形成素 阶段 基异常累计程 年发现肿瘤
发生细胞凋亡相关性 认肿瘤细胞起源应该走凋亡
未发生正常凋亡细胞 细胞凋亡特性改变影响肿瘤发生 时会影响肿瘤
生长 肿瘤发生中两类基 癌基(oncogene)抑癌基(tumor suppressor
gene)抗癌基(oncogene)关 正常细胞增殖 分化凋亡中 原癌基起着
正调控作 促进细胞进入增殖周期 阻止细胞分化凋亡 抑癌基起着负调控作
抑制细胞进入增殖周期 诱导终末分化细胞凋亡 维持基稳定 具潜抑
制肿瘤生长功 功失活基缺失 突变导致细胞恶性转化发生肿
瘤 正常细胞 抑癌基抑制肿瘤生长发展
P53 家熟知抑癌基 野生型 p53 基细胞生长 监控器 细
胞受外引起基应激种信号刺激时 p53 蛋白修饰胞某蛋白
质结合 潜 p53 变活化 p53 DNA 受种素损伤时 活化 p53
诱导 Bax 基表达 抑制 Bcl2 癌基表达 促细胞生长停滞走细胞凋亡 ASPP
蛋白体 p53 关键调节蛋白 ASPP1 ASPP2 蛋白通提高原凋亡基活力
促进 p53 赖细胞凋亡 ASPP 蛋白家族 2001 年发现 ASPP1 ASPP2 基
否存甲基化 目前清楚
实验利 internet 网 CpG 岛分析软件 ASPP1 ASPP2 基启动子 CpG 岛
进行分析 发现 ASPP1 ASPP2 基 CpG 岛中 第 CpG 岛中 CG 含量
丰富 说明 ASPP1 ASPP2 基第 CpG 岛中更易发生甲基化
第 CpG 岛进行甲基化分析更易成功 利网免费引物设计软件
MSP34 设计 MSP 引物 引物落第 CpG 岛中 建立检测 ASPP1
ASPP2 基启动子 CpG 岛甲基化状况 MSP 方法
次试验中 利建立检测 ASPP1 ASPP2 基启动子 CpG 岛甲
基化状况 MSP 方法 检测三株 p53 野生型肿瘤细胞株(A549 MCF7 HEPG2)
株正常成纤维细胞株 检测结果发现 ASPP1 ASPP2 基三株 p53 野生
型肿瘤细胞株中处甲基化状态 成纤维细胞 ASPP1 ASPP2 基发生未甲基化
第三军医学硕士学位文
52
DNA 甲基化基表达调控种重方式 种表观性调节方式肿瘤形成程
中认基突变等遗传性改变样位 DNA 甲基化认肿
瘤诊断早期标志物[ 47 ] DNA 甲基化导致基表达失活 果发生抑癌基
肿瘤形成重性言喻 ASPP1 ASPP2 基促 p53 细胞调亡抑
癌基 甲基化状态表达定影响 推测 ASPP1 ASPP2
基否甲基化肿瘤发生关 ASPP1 ASPP2 基甲基化状态成功检测
进步研究细胞凋亡中生物学功探讨床应价值良基
础
第三军医学硕士学位文
53
全文结
1 国首次 RTPCR 扩增出 ASPP 基家族 cDNA 发现 ASPP 基家族
mRNA 肿瘤细胞株中均表达
2 通 GelPro31 凝胶图分析软件电泳图片半定量分析发现 肿瘤细胞株中
ASPP1 ASPP2 基 mRNA 表达量均低正常细胞 iASPP 基 mRNA 表达量
均高正常细胞 出结 促 p53 促细胞凋亡功中 ASPP1 ASPP2 基
正调节 iASPP 基反调节
3 首次应 internet ASPP1 ASPP2 基进行 CpG 岛分析 发现 ASPP1
ASPP2 基第 CpG 岛中 CG 序列含量丰富 表明第 CpG 岛
容易发生甲基化
4 首次应网免费引物设计软件 MSP34 设计 ASPP1 ASPP2 基 MSP 引物
建立检测 ASPP1 ASPP2 基 CpG 岛甲基化状况方法 MSP
5 首次 3 株 p53 野生型肿瘤细胞株(A549 HEPG2 MCF7)成纤维细胞中
ASPP1 ASPP2 基 CpG岛甲基化状况检测发现 3株 p53野生型肿瘤细胞株中 ASPP1
ASPP2 基 CpG 岛出现甲基化 成纤维细胞中 ASPP1 ASPP2 基 CpG 岛没出
现甲基化 结 ASPP1 ASPP2 基 CpG 岛甲基化状况肿瘤发生关
第三军医学硕士学位文
54
致 谢
课题导师刘泽军教授悉心指导支持 鼓励完成 三年导师谆谆
教诲广博学识 严谨作风 求实精神 予启发帮助 受益
非浅 导师学识渊博 执着敬业 易 永远学榜样 悉心指导
受益终生 导师学 工作生活微关心帮助 表示衷
心感谢
课题够利完成 检验科全体员力支持分开 特感谢检验科府
伟灵 薛强副 张雪老师热心指导力支持 感谢检验科全体仁予
力支持
感谢西南医院血液科陈龙硕士 乳腺中心唐波硕士 分泌科彭勇硕士提供细胞
株 感谢西南医院检验科张兵硕士 黄庆硕士 MSP 方法热心指教 感谢西南
医院检验科杨新硕士 公衍文硕士 李维博士分子生物学方法帮助
未提予帮助 支持关心事 学 亲友 表示感谢
衷心感谢私帮助朋友
第三军医学硕士学位文
55
片
第三军医学硕士学位文
56
Photo 1 leukemia cell
Photo 2 conglutination cell
第三军医学硕士学位文
57
Photo 3 Gel electrophoresis of RNA formaldehyde degeneration
Photo 4 DNA electrophoresis
28S
18S
5S
第三军医学硕士学位文
58
1 2 3 4 5 6
2000
1000
750
ASPP1 500
actin
250
100
1 HEPG2 2MCF7 3A549 4Fibroblast cell 5Blood monocyte 6Marker
Photo 5 Agarose gel analysis of ASPP1 gene RTPCR production
1 2 3 4 5 6
ASPP1
actin
1HL60 2K562 3Jurkat 4HT29 5HCT116 6Marker
Photo 6 Agarose gel analysis of ASPP1 gene RTPCR production
2000
1000
750
500
250
100
第三军医学硕士学位文
59
1 2 3 4 5
actin
ASPP2
1 Fibroblast cell 2Blood monocyte 3HL60 4K562 5Marker
Photo 7 Agarose gel analysis of ASPP2 gene RTPCR production
1 2 3 4 5 6 7 8
1Jurkat 2HEPG2 3MCF7 4HCT116 5HT29 6A549
7 actin 8Marker
Photo 8 Agarose gel analysis of ASPP2 gene RTPCR production
2000
1000
750
500
250
100
2000
1000
750
500
250
100
第三军医学硕士学位文
60
1 2 3 4 5
actin
iASPP
1Blood monocyte 2fibroblast cell 3HL60 4K562 5Marker
Photo 9 Agarose gel analysis of iASPP gene RTPCR production
1 2 3 4 5 6
actin
iASPP
1A549 2HT29 3HCT116 4MCF7 5HEPG2 6Marker
Photo 10 Agarose gel analysis of iASPP gene RTPCR production
2000
1000
750
500
250
100
2000
1000
750
500
250
100
第三军医学硕士学位文
61
M U M U M L
1 2 3 4 5 6
12HEPG2 34MCF7 5A549 6Marker
M methylated bands U unmethylated bands L Marker
Photo 11 Methylation status of ASPP1 in tumor cell
U M U M U M L
1 2 3 4 5 6 7
M methylated bands U unmethylated bands 7 Marker
Photo 12 Methylation status of ASPP1 in fibroblast cell
2000
1000
750
500
250
100
2000
1000
750
500
250
100
第三军医学硕士学位文
62
U M U M U M L
1 2 3 4 5 6 7
12HEPG2 34MCF7 56A549 7Marker
M methylated bands U unmethylated bands L Marker
Photo 13 Methylation status of ASPP2in tumor cell
U M U M U L
1 2 3 4 5 6
M methylated bands U unmethylated bands 6 Marker
Photo 14 Methylation status of ASPP2 in fibroblast cell
2000
1000
750
500
250
100
2000
1000
750
500
250
100
第三军医学硕士学位文
63
参考文献
1 Kerr JF Shrinkage necrosis a distinct form of cellular death J Dathol 1971 1051320
2 Kerr JF Willie AH and Currie AR Apoptosis a basic biological phenomenon with
widergrging implications in tissue kinetics Br J Cancer 1972 26 239257
3 Vaux DL et al The molecular biology of apoptosis Proc Natl Sci USA 1996
9322392244
4 Ameisen JC The origin of programmed cell death Science 1996 27212781279
5 Jamerson MH Johnson MD and Dickson RB Dual regulation of proliferation and
apoptosis cmyc in bitransgenic murine mammary tumor models Oncogene 2000
10651071
6 Bergamaschi D Samuels Y Jin B Duraisingham S Crook T Lu X ASPP1 and
ASPP2 common activators of p53 family members Mol Cell Biol 2004 Feb
24(3)134150
7 SamuelsLev Y Lu X et al ASPP proteins specificially stimulate the apoptotic function
of P53 Molecular Cell 2001 8 781794
8 Bergamaschi D Samuels Y Lu X et al iASPP oncoprotein is a key inhibitor of p53
conserved from worm to human Nature genetics 2003 33162167
9 Lane D Cancer How cells choose to die Nature 2001 414 2527
10 Rush LJ Plash CAlterations of methylation in hematologic malignancies Can Lett
2002 185112
11 Costello JF Fruhwald MC et al Aberrant CpGisland methylation has nonrandom and
tumourtypespecific patterns [J] Nat Genet 2000 24(2) 132138
12 Herman JG Graff JG Myohanen S et al Methylationspecific PCR a novel PCR assay
for methylation status of CpG islands Proc Natl Acad Sci U SA 1996 93 9821–9826
13 Levine A p53 The cellular gatekeeper for growth and division Cell 1997 88
323331
14 Fujimoto K Yamada Y Okajima E et al Frequent association of p53 gene mutation in
bladder cancer Cancer Res 1992 52 1393
15 Yuzhi Chen Wenyun Liu Louie Naumovski et al ASPP2 inhibits APPBP1mediated
NEDD8 conjugation to cullin1 and decrease APPBP1induced cell proliferation and
第三军医学硕士学位文
64
neuronal apoptosis Neurochem 2003 85 801809
16 Derry WB Putzke AP et al Caenorhabditis elegans p53 role in apoptosis meiosis and
stress resistance Science 2001 294 591595
17 Schumacher B Hofmann K et al The Celegans homolog of the p53 tumor suppressor
is required for DNA damageinduce apoptosis Curr Biol 2001 11 17221727
18 Levine AJ Momand J Finlay A The p53 tumor suppressor gene Nature 1991 351
453
19 Lamb P Crauford L Characterization of human p53 gene Mol Cell Biol 1986 61379
20 Johnson P Chung S Benchimol S Growth suppression of Friendvirustransformed
erythroleukemia cell by p53 protein is accompanied by hemoglobin production and is
sensitive to erythropoietin Mol Cell Biol 1993 13 1456
21 Vojtesek B Lane DP Regulation of p53 protein expression in human breast cancer cell
lines J Cell Sci 1993 105 607
22 Merol GR p53dependent and p53independent activation of apoptosis in mammary
epithelial cell reveals a survival function of EPG and insulin J Cell Biel 1995 128(6)
1185
23 Chen X Ko LJ Jayaraman L Prives C et al p53 levels functional domains and DNA
damage determine the extent of the apoptotic response of tumor cells Genes Dev1996
10(19) 24382451
24 Smart P Lane EB Lane DP et al Effects on normal fibroblasts and neuroblastoma cells
of the activation of the p53 response by the nuclear export inhibitor leptomycin B
Oncogene 199918(15) 73787386
25 Ludwig RL Bates S Vousden KH et al Differential activation of target cellular
promoters by p53 mutants with impaired apoptotic function Mol Cell Biol 1996
16(9) 49524960
26 Saller E Tom E Brunori M et al Increased apoptosis induction by 121F mutant p53
EMBO J 1999 18(16) 44244437
27 Caelles C Helmberg A Karin M p 53dependent apoptosis is in the absence of
trascriprional activator of p53target genes Nature (Lond) 1994 370 29016
28 Jia LQ Osada M Ishioka C Gamo M Ikawa S Suzuki T et al Screening the p53
status of human cell lines using a yeast functional assay Mol Carcinog 1997
第三军医学硕士学位文
65
Aug19(4)24353
29 饶进军 朱正光 E1B 缺陷性腺病毒 p53 缺失性白血病细胞作 第军医
学学报 200121(11)819821
30 Rodrigues NR Rowan A Smith ME Kerr IB et al p53 mutations in colorectal cancer
Proc Natl Acad Sci U S A 1990 87(19) 75557559
31 Mancuso T Aguilar F Pescarolo MP Clerico L Russo P Parodi S Mutation
frequencies at codon 248 of the p53 tumour suppressor gene are not increased in colon
cancer cell lines with the RER+ phenotype Nucleic Acids Res 1997 September 15 25
(18) 3643–3648
32 Lossos IS Natkunam Y et al Apoptosis stimulating protein of P53(ASPP2) expression
differs in diffuse large Bcell and follicular center lymphoma correlation with clinical
outcome Leukemia Lymphoma 2002 43(12) 23092317
33 Robertson KD DNA methylation methyltransferases and cancer Oncogene 2001 20
313955
34 Costello JF Fruhwald MC et al Aberrant CpGisland methylation has nonrandom and
tumourtypespecific patterns [J] Nat Genet 2000 24(2) 132138
35 Liu ZJMaekawa MPolymerase chain reactionbased methods of DNA methylation
analysis Analy Boch2003
36 Hatada I Hayashizaki Y Hirotsune S et al A genomic scanning method for higher
organisms using restriction sites as landmarks Proc Natl Acad Sci USA 1991
889523–9527
37 Jones PA Laird PW Cancer epigenetics comes of age Nat Genet 1999 21 1637
38 Wajed Shahjehan A Laird P et al DNA Methylation An Alternative Pathway to
Cancer Ann Surg 2001 234(1) 1020
39 Greenblat MS Bennett WP Hollstein M et al Mutation in the p53 tumor suppressor
genelocus to cancer etiology and molecular pathogenesis[J]Cancer
Res19945448554875
40 Soengas MS Capodieci PPolsky D et al Inactivation of the apoptosis effector Aapaf1
in malignant melanomaNature2001409(6817)207211
41 Gonzalgo ML Jones PA Rapid quantitation of methylation differences at specific sites
using methylationsensitive single nucleotide primer extension (MsSNuPE) Nucl
第三军医学硕士学位文
66
Acids Res 1997 25 252931
42 Xiong Z Laird PW COBRA a sensitive and quantitative DNA methylation assay Nucl
Acids Res 1997 25 25324
43 Aggerholm A Guldberg P Hokland M Hokland P Extensive intra and interindividual
heterogeneity of p15INK4B methylation in acute myeloid leukemia Cancer Res 1999 59
43641
44 Baumer A Wiedemann U Hergersberg M Schinzel A A novel MSPDHPLC method
for the investigation of the methylation status of imprinted genes enables the molecular
detection of low cell mosaicisms Hum Mutat 2001 17 42330
45 Bender CM Pao MM Jones PA Inhibition of DNA methylation by
5Aza2’deoxycytidine suppress the growth of human tumor cell line [J] Cancer Res
1998 5895
46 Liu ZJ Maekawa MPolymerase chain reactionbased methods of DNA methylation
analysis Analy Boch2003 317(2) 259265
47 Liu ZJ Maekawa M Horri T et al The multiple promoter methylation profile of PR
gene and ERalpha gene in tumor cell lines Life Sci 200373 196372
第三军医学硕士学位文
67
文献综述
ASPP 家族 p53 相互作细胞凋亡研究进展
摘 肿瘤形成原癌基抑癌基遗传性变化增加 丢失 突变 逐
步积累程 时 肿瘤遗传素天素作子疾病 p53
肿瘤抑制蛋白 首先通影响编码细胞周期相关蛋白质基表达调控细
胞周期 G1 停滞 时会 DNA 损伤增 诱导细胞发生细胞凋亡 p53
诱导细胞凋亡机制年直太清楚 发现 ASPP(apoptosis stimulating
protein of p53)蛋白家族 p53 诱导细胞凋亡机制研究新进展 ASPP 蛋白
家族 p53 作特异性增强 p53 细胞凋亡功 p53 细胞生长停滞
功没作 ASPP 蛋白家族增强 p53 细胞凋亡功通增强 p53 促凋亡
基启动子 DNA 结合促进细胞凋亡 文作综述
关键词 ASPP 细胞凋亡 p53
细胞凋亡前生命科学研究热门领域 根美国 ISI(Information Sciences
Institute) SCI 录引文关键词检索发现 全球然科学研究中文发表集
中三领域分细胞信号转导 细胞凋亡基组研究 年着细胞凋亡
领域深入研究 许机制正逐步阐明 发现许重信号分子信号事件
p53 Bcl2 家族 线粒体通透性改变[1] 细胞素 C 等
细胞凋亡程中 p53 蛋白起着关重作 p53 肿瘤抑制蛋白
质种核磷酸蛋白 首先通影响编码细胞周期相关蛋白质基表达调
控细胞周期 G1 停滞 时会 DNA 损伤增 诱导细胞发生细胞凋亡
细胞周期停滞(cell cycle arrest)指正常细胞受素影响时 动停止细胞周
期某阶段 消受利素 细胞调亡(apoptosis)[23]称程序性细胞
死亡(programmed cell death) 细胞机体保持身组织稳定 调控身细胞
增殖死亡间衡 基控制细胞动性死亡程[4] 质膜发泡 细
胞质固缩 核染色体裂解调亡体形成特征 病理情况细胞坏死
质区 p53 野生型产生肿瘤机制 目前清楚 ASPP
家族发现机制更深入研究 ASPP(apoptosis stimulating protein of p53)[5]
第三军医学硕士学位文
68
蛋白质家族 成员 ASPP1 ASPP2 iASPP 三 p53 形成复合物
p53 诱导细胞凋亡作
1 p53 结构功
类 p53 基定位 17p 131 长度约 20Kb 11 外显子 10 含子组成
第 1 外显子编码 外显子 2 4 5 7 8 分编码 5 进化高度保守结构域
5 高度保守区 1319 117142 171192 236258 270286 编码区 p53 蛋
白 393氨基酸组成 分子量53x103 P53蛋白分N末端酸性转录活化区(150
位氨基酸) 信号区(6094 位氨基酸) 中央核心 DNA 连接区(100290 位氨基酸) 源
寡聚(Oligomarization)区(323355 位氨基酸) C末端非专 DNA 结合区(100290 位
氨基酸) 结构区 p53 识转录活化靶基程中发挥着重作[6] p53
肿瘤抑制蛋白属蛋白质家族 相关蛋白质 p73 p51 P73 转
录活化区 核心 DNA 连接区寡聚区 p53 高度相似性[7] p53 p73 转录
活化区 29相 核心 DNA 连接区 63相 寡聚 38相 P51
染色体 3q278 区发现 p 53 基源体 发现者分命名
Ket(鼠) p40 p63 p73L[811] p53 较 p73 p51 蛋白结构更接
结构功关联 p51 p73 细胞正常发展凋亡中起重作
[12] p53 阻止肿瘤细胞生长 p53 激活恶性相关刺激信号
反映 结果抑制肿瘤细胞生长[13]
P53 蛋白家熟悉肿瘤抑制物 控制蠕虫 果蝇类等数动
物细胞数[1415] 组织中广泛表达 P53 稳定染色体 DNA 方面充 基组
卫士 (guardian of genome) 分子警察 (molecular policeman)角色 细胞 DNA 受
第三军医学硕士学位文
69
辐射等素损伤时 p53 N末端会磷酸化影响 DNA HDM2 结合
力[16] 激活 诱导细胞生长停滞 细胞衰老 分化 细胞凋亡介导 DNA 修复
[1719] 损伤细胞处 G1 期 p53 触发细胞周期限制点 果 DNA 损伤细胞已
进入 S 期 p53 触发细胞凋亡 果 DNA 损伤细胞已进入 S 期 p53 触
发细胞凋亡 P53 蛋白通靶基 p21WAF1CIP1 抑制周期赖性激酶诱导 G1S 阻滞
阻止细胞 G1 期进入 S 期 通 1433sigma[20]抑制 Cdc25c 参 G2M 关卡
调控[21] 说 p53 通诱导 WAF1CIP1 1433sigma 等抑癌基表达 抑
制细胞生长 细胞周期停滞 时 p53 诱导 mdm2 基表达 mdm2 蛋白 修补
损伤细胞 DNA 细胞新进入细胞周期正常生长 P53 蛋白通调靶基 bax
IGFBP3 抑制 bcl2 基 调控细胞凋亡 维持基组遗传学稳定性[22] 行
抑癌基功
2 p53 灭活机制
床许肿瘤发生 p53 蛋白功丧失 p53 蛋白功丧失机
制许种 包括 p53 基损伤 p53 基身突变 p53 游调节子突
变等 P53 正常功丧失方式基突变 迄已发现 10 000 种类肿瘤
2 500 种基突变 p53 蛋白 393 氨基酸 280 发现突变[23] 通肿瘤中
量突变体分析 证实部分突变位 4 突变热点错义突变 4 突变
热点氨基酸 129146 171179 234260 270287 正应 p53 基进化
第三军医学硕士学位文
70
保守区段 p53 肿瘤中相关突变区域性点突变 导致单氨基酸改变
p53 高突变密码子中 28突变仅影响 p53 175 245 248 249 273
282 六氨基酸残基 单氨基酸改变导致 p53 失效 引起异常 p53 蛋白表达
种异常 p53 蛋白野生型 p53 蛋白更稳定 肿瘤细胞中高水表达
推测异常 p53 蛋白相四聚体 作野生型 p53 蛋白区域阴性抑制子[24]
许肿瘤分析结果发现 半数肿瘤中 p53 突变 p53 突变 5发生
调节区 95发生中心区域 研究发现 p53 核心区域外突变 p53
丧失细胞凋亡功中起重作[2526] 表明 p53 基座突变研究解 p53
抑癌机制更意义
某情况 p53 抑癌功丧失 Rb p16 BRCA1 BRCA2 等抑癌基
异常引起 时 p53 抑制蛋白度表达 p53 刺激子缺乏等引
起 p53 抑癌功丧失 外 蛋白质 p53 蛋白作 导致正常生物学
第三军医学硕士学位文
71
功丧失 例癌蛋白 HPVE6 p53 结合启动细胞蛋白酶降解 p53
SV40LT Ag 阻断 p53 DNA 结合区 腺病毒 EIB55K 蛋白阻断 p53 转录活化
区 癌基产物 Mdm 2p300 复合物参 p53 蛋白稳定性调节 异常扩增
干扰 p53 正常功[2728] 时研究发现 p53 某癌基产生刺激反应
受 p 14ARF 蛋白影响 许癌基诱导 p14ARF p14ARF 拮抗
Mdm2(HDM2) p 53 作[2932]
3 ASPP 家族结构功
2001 年 英国帝国癌症研究抑癌基研究室卢欣教授领导研究组发现
新蛋白家族─ASPP(apoptosis stimulating protein of p53) 目前已鉴定家族成员
第三军医学硕士学位文
72
ASPP1 ASPP2 iASPP(inhibitory member of the ASPP family)[33] 该家族结构
特点 SH3 结构域 量锚蛋白重复 丰富谷氨基结构域
ASPP 命名 ankyrin repeat SH3 domain prolinerich domain containing proteins
缩写
ASPP1 PPP1R13B 基编码 1090 氨基酸组成蛋白质 功性氨
基酸区域 pro ank SH3 组成 p53BP2Bbp 源性蛋白质 ASPP1 C
末端 948 氨基酸 KIAA0771 蛋白相 377氨基酸 p53BP2 相
ASPP2 p53BP2 编码 1128 氨基酸组成蛋白质 功性氨基酸区域
pro ank SH3 helical 组成 ASPP2 编码 1128 氨基酸蛋白延伸 1005
氨基酸 p53BP2 ASPP1 ASPP2 蛋白 N末端 C末端相似性
MMPM 序列开始 蛋氨酸开始转录[5] Chen YuZhi[[33]等研究
发现 ASPP2 够抑制 APPBP1 拯救 ts41 细胞突变力 时阻止 APPBP1
诱导神细胞凋亡 ASPP1 ASPP2 减弱 Ras Ras+E7 Ras+E1A 等原癌蛋白
转化潜 ASPP1 ASPP2 促进 p53 细胞凋亡功特异 功
增强 p53 DNA 结合 促进 p53 凋亡基启动子活化 增强 p53 细胞凋亡功
细胞程序性死亡(programmed cell death PCD) 清机体余细胞 ASPP1
ASPP2 野生型 p53 结合 突变型 p53 结合 突变型 53 结
合力野生型 p53 结合力弱 肿瘤发生程中 p53 序列旦突变
ASPP1 ASPP2 结合 阻止 p53 诱导细胞凋亡
iASPP 类 PPP1R13L 基编码 线虫中 ape1(apoptotic enhancer
1)基编码[34] 315 氨基酸组成 p65 A结合蛋白 C末端 223
氨基酸 53BP2 C末端 52相 iASPP CeiASPP(Celegans iASPP)
C末端 ASPP1 ASPP2 C末端广泛相似性[34] iASPP Ras E1A
E7 合作癌蛋白 iASPP 表达增强 Ras Ras+E7 Ras+E1A 转化活性
增强突变 Ras p53 Ras+p53H175 Ras+p53L173 转化活性[34] 功
p53 p53H175 p53L173 突变 ASPP1 ASPP2 竞争性 p53 结合
位点结合 抑制 p53 抑癌功 野生型 p53 ASPP 表达水正常乳腺
癌中高表达 CeiASPP 通抑制 Cep53 促凋亡活性抑制 Cep53 凋亡功
[3536]
4 ASPP 家族 p53 结合细胞凋亡关系
p53 肿瘤抑制蛋白 功诱导细胞凋亡细胞生长停滞 目前止
第三军医学硕士学位文
73
已三种推测解释细胞 p53 影响选择凋亡分裂停滞 第种剂
量反应模型 低水 p53 诱导产生细胞停滞 高水 p53 启动细胞凋亡[37] 第
二种 细胞背景 (cellbackground)假设认细胞 p53 反应细胞周围环境决定
细胞表达高水抗凋亡基更历生长停滞凋亡[38] 第三
种推测认 p53 作靶基启动子 p53 种修饰形式识[3940]
ASPP 家族发现支持第三种推测 启动子特异模型 ASPP 蛋白家族 p53 作
特异性增强 p53 细胞凋亡功 p53 细胞生长停滞功没作
ASPP 蛋白家族增强 p53 细胞凋亡功通增强 p53 促凋亡基启动子 DNA
结合促进细胞凋亡 ASPP 蛋白家族发现解什突变 p53
DNA 结合 发挥功 突变 p53 ASPP 蛋白结合
发挥功 变异细胞死亡[41] 许肿瘤中发现 p53 突变残基 亮氨基酸
半胱氨基酸残基 够 ASPP1 ASPP2 作促进 Bax 启动子激活
诱导细胞凋亡
研究 ASPP 家族 p53 结合细胞凋亡影响 许肿瘤细胞株
床标做研究 Xin Lu 等[34]野生型 p53 乳腺癌 ASPP1 ASPP2 mRNA
表达研究发现 60肿瘤 ASPP1 表达水降 23肿瘤 ASPP2 表达水
降 23肿瘤中 90 ASPP1 表达水降 时细胞表面标
记物 CD20 流式细胞仪(FACS)等技术 293 JW2 Tero Saos2 等细胞株作研究
发现 ASPP1 ASPP2 P53 表达 转染肿瘤细胞株 50凋亡 ASPP1
ASPP2 E2F1 Bax 等抑癌基表达细胞凋亡增加 Izidore SLossos
等[42] RTPCR 免疫组化等方法弥漫性 B 淋巴细胞瘤(DLBCL)滤泡性淋巴瘤
(FCL)等研究 发现 ASPP2 表达高患者存活时间长 ASPP2 表达低患者存
活时间短 Daniele Bergamaschi 等[34]检测八例野生型 P53 ASPP 水正常乳腺
癌患者 iASPP 含量 结果七例患者 iASPP 含量较高
研究证明 ASPP 蛋白体 p53 关键调节蛋白 ASPP1 ASPP2 通
提高原凋亡基活力促进 p53 赖细胞死亡 ASPP 家族 p53 作总机制
ASPP p53 结合形成 ASPPp53 复合物作原凋亡基启动子 ASPP 微变化
引起 p53 结合 DNA 力发生改变 影响 p53 诱导凋亡力 细胞根
p53 蛋白停滞基结合凋亡基结合活力做出细胞停滞细胞凋亡
决定[43] iASPP ASPP1 ASPP2竞争 p53 结合位点 影响 ASPPp53
复合物 DNA 结合力 阻止 p53 细胞凋亡功
第三军医学硕士学位文
74
p53 蛋白功示意图
a 般情况 p53 识涉细胞停滞基启动子区域 诱导细胞分裂停滞
修复损伤细胞 DNA
b ASPP 蛋白 p53 结合形成 ASPPp53 复合物时 整复合物便倾诱
导凋亡基启动子相作 诱导细胞凋亡
5 结束语
p53 许肿瘤发生 发展起重作 ASPP 家族许研究中表
明 p53 作独立 特异 ASPP 家族基功进步研究
解调控机制 治疗肿瘤开辟广阔前景
第三军医学硕士学位文
75
参考文献
1 Lin QS Mitochondria and apoptosis Acta Biochimica et Biophyscia Sinica 199331(2)
116118
2 Kerr JF Shrinkage necrosis a distinct form of cellular death J Dathol 1971 1051320
3 Kerr JF Willie AH and Currie AR Apoptosis a basic biological phenomenon with
widergrging implications in tissue kinetics Br J Cancer 1972 26 239257
4 Vaux DL Toward and understanding of the molecular methanisma of physiological cell
death Proc Natl Acad Sci USA 1993 90786
5 SamuelsLev Y Lu X et al ASPP proteins specificially stimulate the apoptotic
function of P53 Molecular Cell 2001 8 781794
6 Kaghad M Bonnet H Yang A et al Monoallelically expressed gene related to p53 at
1p36 a region frequently deleted in neuroblastoma and other human cancers Cell
1997 90(40 809819
7 Jost CA Marin MC Kaelin WG et al p73 is a human p53related protein that can
induce apoptosis Nature 1997 389(6647)191194
8 Trink B Okami K Wu L et al A new human p53 homologue Nat Med 19984(7)
747748
9 Osada M Ohba M Kawahara C et al Cloning and functional analysis of human p53
which structurally and functionally resembles p53 Nat Med 1998 4(7) 839843
10 Senoo M Seki N Ohira M et al A second p53related protein p73L with high
homology to p73 Biochem Biophy Res Commun 1998 248(30 603607
11 Yang A Kaghad M Wang Y et al p63 a p53 homology at 3q2729 encodes multiple
products with transactivating death inducing and dominantnegative activities Mol
Cell 1998 2(3) 305316
12 Irwin MS Hueber A Baum W et al P53 family update p73 and p63 develop their own
identities Cell Growth Differ 2001 12 337349
13 Balint E Vousden KH Activation and activities of the p53 tumor suppressor protein
BrJCancer 2002 85 18131823
14 Vogelstein B Lane D Levine AJ et al Surfing the p53 network Nature 2000(6810)
第三军医学硕士学位文
76
408 307310
15 Derry WB Putzke AP Rothman JH et al Caenorhabditis elegans p53 role in apoptosis
meiosis and stress resistance Science 2001 294 591595
16 Woo RA Mclure KG LeesMiller SP et al DNA dependent protein kinase acts
upstream of p53 in response to DNA damage Nature 1998 394(6694) 700704
17 Ko L Prives C p53 Puzzle and paradigm Genes and Development 199610
10541072
18 Ford JM Hanawalt PC et al Role of DNA excision repair gene defects in the etiology
of cancer Current Topics Microbiology and Immunology 1997 221 4770
19 Hermeking H Lengauer C Polyak K et al 1433 sigma is a p53regulated inhibitor of
G2M progression Mol Cell 1997 1(1) 311
20 Peng CY Graves PR Thomas RS et al Mitotic and G2 checkpoint control regulation
of 1433 protein binging by phosphorylation of Cdc25c on serine216 Science 1997
277(5331) 15011505
21 Levine A p53 The cellular gatekeeper for growth and division Cell 1997 88
323331
22 Pfeifer GP Denissenko MF Formation and repair of DNA lesions in the p53 gene
relation to cancer mutations Environ Mol Mutagen 1998 31(3) 197205
23 Lomax ME et al Two functional assays employed to detect an unusual mutation in the
oligomerisation domain of p53 in a LIFraumenilike family Oncogene 1997 14
18691823
24 Digiammarino EL et al A novel mechanism of tumorigenesis involving pHdependent
destailization of a mutant p53 tetramer Nature StructBiol 2002 9 1216
25 de Vries A et al Targeted point mutations of P53 lead to dominant negative inhibition
of wildtype p53 function ProcNatlAcadSciUSA 2002 99 29482953
26 Storey A Thomas M Kalita A et al Role of a p53 polymorphism in the development
of human papillomaviruaassociated cancer Nature 1998 393(6682) 229234
27 Grossman SR Perez M Kung AL et al p300MDM2 complexes participate in
MDM2mediated p53 degradation Mol cell 1998 2(4) 405415
28 Zhang Y Xiong Y Yarbrough WG et al ARF promotes MDM2 degradation and
stabilizes p53 ARFINK4a locus deletion impairs both the Rb and p53 tumor
第三军医学硕士学位文
77
suppression pathways Cell 1998 92(6)725732
29 Pomerantz J Schreiber AN Liegeois N et al The Ink4a tumor suppressor gene product
p19 Arf interacts with MDM2 and neutralizes MDM2’s inhibition of p53 Cell 1998
92(6) 713723
30 Bates S Phillips AC Clark PA et al p14ARF links the tumor suppressors RB and p53
Nature 1998 395(6698) 124125
31 Palmero I Pntoja C Serrano M p19ARF links the tumor suppressor p53 to RAS
Nature 1998 395(6698) 125126
32 Yuzhi Chen Wenyun Liu Louie Naumovski et al ASPP2 inhibits APPBP1mediated
NEDD8 conjugation to cullin1 and decrease APPBP1induced cell proliferation and
neuronal apoptosis Neurochem 2003 85 801809
33 Bergamaschi D Samuels Y Lu X et al iASPP oncoprotein is a key inhibitor of p53
conserved from worm to human Nature genetics 2003 33162167
34 Derry WB Putzke AP et al Caenorhabditis elegans p53 role in apoptosis meiosis and
stress resistance Science 2001 294 591595
35 Schumacher B Hofmann K et al The Celegans homolog of the p53 tumor suppressor
is required for DNA damageinduce apoptosis Curr Biol 2001 11 17221727
36 Chen X Ko LJ Jayaraman L Prives C et al p53 levels functional domains and DNA
damage determine the extent of the apoptotic response of tumor cells Genes Dev1996
10(19) 24382451
37 Smart P Lane EB Lane DP et al Effects on normal fibroblasts and neuroblastoma cells
of the activation of the p53 response by the nuclear export inhibitor leptomycin B
Oncogene 199918(15) 73787386
38 Ludwig RL Bates S Vousden KH et al Differential activation of target cellular
promoters by p53 mutants with impaired apoptotic function Mol Cell Biol 1996 16(9)
49524960
39 Saller E Tom E Brunori M et al Increased apoptosis induction by 121F mutant p53
EMBO J 1999 18(16) 44244437
40 Slee EA Lu X The ASPP family deciding between life and death after DNA damage
Toxicology Letters 2003 139 8187
41 Lossos IS Natkunam Y et al Apoptosis stimulating protein of p53(ASPP2) expression
第三军医学硕士学位文
78
differs in diffuse large Bcell and follicular center lymphoma correlation with clinical
outcome Leukemia Lymphoma 2002 43 23092317
42 Lane D Cancer How cells choose to die Nature 2001 414 2527
第三军医学硕士学位文
79
文献综述二
DNA 甲基化肿瘤研究进展
摘 细胞癌变阶段复杂程 包括原癌基激活抑癌基
失活 涉基基外种改变 时 细胞癌变遗传素天素
作子疾病 现发现表观性(epigenetic)机制肿瘤形成程中重作
DNA 甲基化表观性机制 发现肿瘤细胞总体甲基化水
低正常细胞 某 CpG 岛甲基化程度增高 DNA 启动子甲基化肿瘤相关
基转录失活重机制 X 染色体 基表达基组印迹中[ 1 ]起着重作
时 年研究发现 DNA 甲基化异常影响肿瘤发生 发展预
关键词 DNA 甲基化 肿瘤 基表达
1 DNA 甲基化基表达
11 DNA 甲基化甲基化
DNA 甲基化指生物体 DNA 甲基转移酶(DNA methyltransferase DMT)催化
s腺苷甲硫氨酸(SAM)甲基供体 甲基转移特定碱基程 DNA
甲基化时期短 通 DNA 甲基转移酶维持 目前知 维持 DNA 甲
基化酶两种 甲基转移酶 二重新甲基化转移酶 甲基化 CpG 点
重新甲基化 甲基化双链 DNA 复制生成双链中 母链携带甲基 子链非甲基
化 DNA 甲基转移酶识母链 5甲基胞嘧啶(5mC)
哺乳动物体存甲基化酶 种酶种糖基化酶 核酸切酶
甲基化酶 非特异甲基化特异基甲基化 DNA 甲基化
造成细胞基稳定原
12 DAN 甲基化基改变
DNA 甲基化助 5mC T 突变[ 2 ] DNA 甲基化引起基突变机制
DMT 催化反应形成 DMT 加快 C(胞嘧啶) 5mC 脱氨 封闭 U(尿嘧啶)修
复 U T 改变 DMT 促 CpG 序列 C T 突变[ 3 ] DNA 合成程中
DMT1 复制叉起作 半甲基化 DNA 变成全甲基化状态 保持基甲基化
外 DMT3a DMT3b 作催化甲基转移 裸露 DNA 获甲基化
第三军医学硕士学位文
80
肿瘤细胞中 DNMT1 DNMT3b 起作建立维持甲基化衡[4] 肿瘤
细胞 DNA 甲基化异常现表现 DNA 广泛低甲基化区域性高甲基化存
种组织 总甲基化力增强 DNA 甲基化改变直接间接影响基转录
通 5甲基胞嘧啶 NH3 诱发 C T(胸腺嘧啶)突变 5胞嘧啶甲基化改变
引起基表达异常 DNA 序基产物变
13 DNA 甲基化基错配修复
DNA 错配修复系统(DNA mismatch repair system MMR)指存类细胞中
种修复 DNA 碱基错配安全保障体系 系列特异修复 DNA 碱基错配酶分
子组成 Ahujia 等[ 5 ]研究发现 MMR 缺陷时 CpG 岛甲基化增强 认 MMR
DNA 甲基化关 基错配修复程中甲基化具导识作 错配修复基
表达缺陷原中基突变基启动子区高甲基化原[ 6 ]
14 DNA 甲基化基表达影响
基表达异常通基机制(genetic mechanism)表基机制(epigenetic
mechanism) 基机制包括基点突变 染色体重排 产生结构异常基产物 染
色体重组非 联结( nondisconjunction)导致隐性等位基表达 基放引起
度表达等 表基机制指 DNA5胞嘧啶甲基化改变 引起基表达异常
DNA 序基产物变 DNA 甲基化导致基突变 影响基表达 现
三种理解释 DNA 甲基化导致基突变 1 正常时保护鸟嘌呤突变
DNA 修复蛋白 MGMT(O(6)methylguanine DNA methyltransferase)甲基化缺乏
导致 GtoA 突变发生[ 7 ] 2 肿瘤形成程中氧基 DNA 损伤腺
嘌呤突变原 谷胱甘肽 S转移酶 1(Glutathione Stransferase P1 GTSP1)保
护作避免 GTSP1 启动子高甲基化 种保护作丧失 乳腺癌前
列腺癌中报道[ 8 ] 3 肿瘤基组低甲基化 染色体稳定性导致突
变率增加[ 9]
DNA 甲基化发育分化中调控基表达 时 DNA 甲基化基表达呈负
相关 启动子区低甲基化转录活性正相关(非启动子区甲基化例外) 基身
甲基化基表达弱负相关 基 CpG 岛甲基化干扰转录子基
调控区结合 DNA 甲基化直接抑制 RNA 聚合酶活性抑制基表达
时 甲基化 DNA 特异结合蛋白结合 DNA 甲基化改变染色质结构等
间接阻碍转录子 DNA 结合抑制转录 目前已证实 DNA 甲基化组蛋白乙
酰化呈正相关[ 10 ] 乙酰化调控基表达种重方式
第三军医学硕士学位文
81
2 甲基化肿瘤
DNA 甲基化种影响基表达机制 肿瘤发生着密切联系 DNA
甲基化状态改变致癌作关键素 肿瘤抑制基失活方式 通
基机制基外机制导致细胞增殖分化相关基表达异常 造成细胞失
正常程控制发生恶变形成肿瘤[11 ] 肿瘤细胞正常细胞较 DNA 甲基化模
式显著 基组低甲基化某特异性位点启动子 CpG 岛高甲基化存
[12] 肿瘤形成基遗传性模式原癌基度扩增抑癌基 沉寂 细胞
增殖衡受破坏导致细胞恶性状态 原癌基扩增低甲基化关 抑
癌基 沉寂 [13]高甲基化关
21 肿瘤细胞中 DNA 甲基化异常现
研究发现种肿瘤基组中 肿瘤细胞 DNA 存广泛低甲基化局部
区域高甲基化存现 总甲基化力增高 意义细胞生长分化
密切关系癌基抗癌基 肿瘤细胞非 CpG 岛普遍性低甲基化 肿瘤细胞中染
色体 11P 短臂 17P CpG 岛 3PCpG 岛出现区域高甲基化抑癌基高甲
基化 肿瘤早期出现症状前 肿瘤中基组甲基化程度普遍降低 Cmyc
raf Cfos CHras CKras 等基 时肿瘤中特异癌基低甲基化 肠癌
中 CKras 基 Cmyc 基第三外显子低度甲基化 正常细胞中完
全甲基化 肿瘤细胞中抑癌基启动子区高甲基化 抑制抑癌基转录
抑癌基失活 癌基充分甲基化导致基重新开放异常表达 抑癌基
度甲基化形成基突变靶点
22 DNA 甲基化改变癌变关系
肿瘤细胞中 DNA 甲基化衡 引起基表达遗传性改变 形成基
组稳定性分子基础 许肿瘤发现 DNA 低甲基化导致转甲基作程序
改变致癌基表达提高 细胞群体中 低甲基化细胞具形成肿瘤生长优势
DNA 甲基化促进低甲基化细胞克隆扩 启动子 CpG 岛甲基化基转录
失活定关系 果肿瘤抑制基细胞生长调节 分化 凋亡相关基发
生甲基化 甲基化肿瘤形成程中扮演重 角色 [ 1415]
类肿瘤中 P16 P15 基 5ˊCpG 岛重新甲基化基失活研究取重
进展 P16 等位基未发生点突变纯合性缺失类肿瘤细胞株中 出现
高例 P16 基 5ˊCpG 岛重新甲基化失转录活性 P16 基异常甲基化发
生类原发性肿瘤组织中 膀胱癌 头颈部鳞状细胞癌等[16] 时 P16 基
第三军医学硕士学位文
82
垂体肿瘤甲基化发生率高达 7080 P15 基 5ˊCpG 岛原发神胶质瘤白
血病中等易发生重新甲基化
白晓川[17 ]等研究发现 恶性肿瘤细胞中普遍存细胞降钙素基高甲基化
DNA 甲基转移活性增高 力[ 18 ] 等研究发现巴胺受体基 D4(DRD4)甲基化白血病
患者发生率明显高正常(P<005) 复发难治患者发生率高初治化疗
敏感患者 认 DRD4 基甲基化白血病发生 发展关 LiuM 等[19]
61 例急性淋巴细胞白血病(ALL) 7 例正常淋巴细胞 P75 基甲基化状态基
表达逆转录 PCR(RTPCR)方法检测发现 ALL 中 19 例 mRNA 未表达 正常淋
巴细胞中 P73mRNA 全表达 未表达 P73mRNA 基全高甲基化 正常细胞
P73 基没高甲基化 表明 T B 急性淋巴细胞白血病中 P73 失活白
血病发病机制 高甲基化 P73 失活机制 文格波[20]等发现 P53 基高甲基
化状态甲状腺癌 P53 基点突变关 Toyooka K O[ 21]等检测乳腺癌肺癌
启动子甲基化状态发现 原发性乳腺癌中 33(18 of 55)CDH13 启动子发生异常甲
基化 肺癌中 43(18 of 42)发生异常甲基化 表明 CDH13 异常甲基化乳腺癌肺
癌发生机制 研究表明 DNA 甲基化肿瘤基产生点突变原
DNA 甲基化癌变关系方面 组织通机制导致癌变
抑癌基某细胞生长调控甲基化状态深入研究 助进步认识肿瘤形
成机制
3 展
肖文华[22]等肝癌细胞研究中发现 Cmyc 基低甲基化状态反映肝癌恶
性程度 助判断病预 房静远等胃癌细胞 DNA 甲基化组织病理变化
研究中发现 DNA 甲基化水降幅度肿瘤细胞浸润深度组织学类型关
肿瘤体形态 胃周淋巴结受浸情况肿瘤细胞分化程度关 肿瘤 DNA
作甲基化状态分析作肿瘤预兆 例 编码 DNA 修复基 MGMT 启动子
高甲基化作肿瘤烷化药物治疗预测标记物[ 23 ] 血清中出现游离肿
瘤 DNA 作肿瘤治疗监测种手段 游离 DNA 甲基化检测作肿瘤形成
程药物治疗监测手段
表明 DNA 异常甲基化发生频率高分子作床监控病程评估疗效较
指标 时 DNA 异常甲基化发生频率高分子成肿瘤早期诊断肿瘤标志
物 癌症防治 防止癌变早期基组稳定性发生 减少肿瘤易感性突
变 达癌症早期预防
第三军医学硕士学位文
83
参考文献
1 Lyon MF Imprinting and Xchromosome inactivation Result Probl Cell Differ 1999
25(8)7390
2 Laird PW Jaenish R The role of DNA methylation in cancer genetics and epigenetics
Aunn Res Genet 1996(9) 30441464
3 Bender CM Zingg JM Jones PA DNA methylation as a target for drug design[J]
Pharm aceutical Res 1998 15(2) 175187
4 Bestor TH Hum Mol Genet 2000 9 2395402
5 Ahujia N et al Aging and DNA methylation in colorectal mucosa and cancer Cancer
Res 1998 58(23) 548994
6 Wheeler JM Beck NE Kim HC et al Mechanisms of inactivation of mismatch repair
genes in human colorectal cancer cell lines the predominant role of Hmlh1
ProcNatlAcadSciUSA 1999 96(18)1029610301
7 Esteller M Toyota M SanchezCespedes M et al Inactivation of the DNA repair gene
O6methylguanineDNA methyltransferase by promoter hypermethylation is associated
with G to A mutations in Kras in colorectal tumorigenesis Cancer Res 2000 60
23682371
8 Esteller M Corn PG Urena JM et al Inactivation of glutathione Stransferase P1 gene
by promoter hypermethylation in human neoplasia Cancer Res 1998 58 45154518
9 Chen RZ Pettersson U Beard C et al DNA hypomethylation leads to elevated
mutation rates Nature 1998 395 8993
10 Ng H H Bird A DNA methylation and chromatin modification[J] Curr Opin Genet
Dev 1999 9 (2) 158163
11 Costello JF Fruhwald MC et al Aberrant CpGisland methylation has nonrandom and
tumourtypespecific patterns[J] Nat Genet 2000 24(2) 132138
12 Robertson KD DNA methylation methyltransferases and cancer Oncogene 2001 20
313955
13 Wade PA Methyl CpG binding proteins coupling chromatin architecture to gene
regulation Oncogene 2001 20 316673
第三军医学硕士学位文
84
14 Costello JF and Plass C Methylation matters J Med Genet 2001 38285–303
15 Baylin SB and Herman JG DNA hypermethylation in tumorigenesis epigenetics joins
genetics Trends Genet 2000 16168–174
16 Cody DT Huang Y et al Differential DNA methylation of the P16 INK4ACDKA2A
promoter in human oral cancer cells and normal human oral kerarinocytes Oral Oncol
1999 35(5)516522
17 白晓川 白志勇 武淑兰等 8 种肿瘤细胞系降钙素甲基化模式甲基转移酶
活性关系 癌症 2001 20(2) 156159
18 力 王全 顾 群等 白血病细胞巴胺受体基甲基化研究 军医进修学
院学报 2000 21(1) 6264
19 Liu M Taketani T Li R et al Loss of P73 gene expression in lymphoid cell lines is
associated with hypermethylation[J] Leuk Res 2001 25 (6) 441447
20 文格波 曹仁贤 前 甲状腺癌P53 基甲基化研究[J]中国癌症杂志 1998
8(4) 280282
21 Toyooka KO Toyooka S Virmani AK et al Loss of expression and methylation of the
CDH13 (Hcadherin) gene in breast and lung carcinomas[J] Cancer Res 2001 61(11)
45564560
22 肖文华 刘文缢 肝细胞癌 17p133 位占 CpG 岛甲基化状态分析意义 中
华医学遗传学杂志 1997 14(5) 297299
23 Esteller M GarciaFoncillas J Andion E et al Inactivation of the DNArepair gene
MGMT and the clinical response of gliomas to alkylating agents N Engl J Med 2000
343 13504
第三军医学硕士学位文
85
读硕士期间发表文章
1 张云 刘泽军 DNA 甲基化肿瘤研究进展 医学综述 2003 9(7) 423424
2 张云 刘泽军 李维 杨丽华 等 肿瘤细胞中 ASPP2 mRNA 表达意义 第三
军医学学报 2003 25(23) 21032105
3 张云 刘泽军 卢欣 P53 促凋亡蛋白家族 p53 相互作细胞凋亡研究进
展 中国新医药杂志 2004 3(1) 15
4 张云 刘泽军 DNA 甲基化 PCR 扩增失败原分析体会 中国新医药杂志
2004 3(2) 45
5 张 云 张晓兵 杨 新 张 雪 刘泽军等 ASPP1 基启动子 CpG 岛甲基化检测
方法实验初探 中华医学 (刊)
6 张 云 刘泽军 李 维 杨丽华 ASPP1 基 mRNA 肿瘤细胞株中表达初
探 重庆医学 (刊)
7 张 云 刘泽军 MSP 网线免费引物设计介绍 中华检验杂志 (刊)
8 刘泽军 张 云 张晓兵 杨 新 Abnormal mRNA expression of ASPP members in
leukemia cell lines Leukemia 2004 18(2)880
9 张云 刘泽军 Advance in tumor diagnosis of telomerase research Chinese
Joural of Medicine and Clinical Science 2002 3(5) 293295
《香当网》用户分享的内容，不代表《香当网》观点或立场，请自行判断内容的真实性和可靠性！
该内容是文档的文本内容，更好的格式请下载文档
硕士学位文
ASPP基家族mRNA肿瘤细胞株中表达启动子CpG岛甲基
化实验研究
姓名：张云
申请学位级：硕士
专业：床检验诊断学
指导教师：刘泽军
20040401
第三军医学硕士学位文
5
ASPP 基家族 mRNA 肿瘤细胞株中表达
启动子 CpG 岛甲基化实验研究
摘
目
p53 蛋白家熟知肿瘤抑制蛋白 目前 p53 蛋白相关基研究
集中 p53 蛋白促凋亡功调节 发现新蛋白家族 p53 促凋亡
蛋白(apoptosis stimulating protein of p53 ASPP) 三成员 ASPP1 ASPP2
iASPP((Inhibitory member of the ASPP family) ASPP1 ASPP2 显著性增强 p53 促
凋亡功 iASPP p 53 促凋亡功抑制子 次实验利 RTPCR 方法
检测 ASPP 基家族 mRNA 8种肿瘤细胞株表达水 揭示 ASPP 基家族 mRNA
表达量肿瘤发生发展关系 时解 ASPP 基家族 p53 相互作机制
利 internet 网免费引物设计 ASPP1 ASPP2 基启动子 CpG 岛进行分析设
计甲基化特异性 PCR(Methylathen Specific PCR MSP)引物 时利 MSP 方法检测
ASPP1 ASPP2 基启动子甲基化状况 探讨 ASPP1 ASPP2 肿瘤细胞中异常表达
原
方法
1 成纤维细胞肿瘤细胞株 HL60 K562 Jurkat HCT116 HT29 Hepg2
MCF7 A549 加 100Uml 青霉素 100Uml 链霉素 10牛血清高糖 DMEM
培养基 5CO2 条件 37oC 培养
2 应 RTPCR 检测 ASPP 基家族 mRNA 细胞株中表达情况
3 利 internet 网 CpG 岛分析软件 ASPP1 ASPP2 基启动子 CpG 岛进行
分析 利网免费引物设计软件 MSP34 设计 MSP 引物 建立检测 ASPP1 ASPP2
基启动子 CpG 岛甲基化状况 MSP 方法
4 利 MSP 方法检测 ASPP1 ASPP2 基启动子 p53 野生型肿瘤细胞株
Hepg2 MCF7 A549 成纤维细胞中甲基化状况
结果
1 ASPP 基家族 mRNA 细胞株中均表达 细胞株中表达量
差异
2 肿瘤细胞株中 ASPP1 基 mRNA 表达量明显低正常细胞(成纤维
第三军医学硕士学位文
6
细胞 血液单核细胞)表达量 P<001 ASPP2 基 mRNA 表达量肿瘤细
胞株中表达差异较 正常细胞表达量相呈降趋势 P<005
3 iASPP 基 mRNA 细胞株中表达量 A549 HT29 中表
达量正常细胞差异 P>005 6 种肿瘤细胞株中表达量均高正常细胞
表达量 P<001
4 ASPP1 ASPP2 基网 CpG 岛分析软件分析出 ASPP1 基 10 CpG
岛 第 CpG 岛中 均 34 碱基中 CG 序列 ASPP2 基 3 CpG
岛 第 CpG 岛中 均 383 碱基中 CG 序列
5 MSP 检测 3 株 p53 野生型肿瘤细胞株(A549 HEPG2 MCF7)成纤维细胞
ASPP1 ASPP2 基 CPG 岛甲基化情况 结果肿瘤细胞株中 ASPP1 ASPP2 基
甲基化引物均出现目基带 ASPP1 ASPP2 基未甲基化引物均没出现目
基带 成纤维细胞中 ASPP1 ASPP2 基甲基化引物均未出现目基带 ASPP1
ASPP2 基未甲基化引物均出现目基带
结
1 国首次 RTPCR 方法检测 ASPP 基家族 mRNA 表达 发现 ASPP
基家族 mRNA 肿瘤细胞株中均表达
2 通 GelPro31 凝胶图分析软件电泳图片半定量分析发现 肿瘤细胞株中
ASPP1 ASPP2 基 mRNA 表达量均低正常细胞 iASPP 基 mRNA 表达量
均高正常细胞 结 促 p53 促细胞凋亡功中 ASPP1 ASPP2 基正
调节 iASPP 基反调节 甚 p53 突变肿瘤细胞中 ASPP1 ASPP2 抑
制肿瘤细胞生长
3 首次应 internet ASPP1 ASPP2 基进行 CpG 岛分析 发现 ASPP1
ASPP2 基第 CpG 岛中 CG 序列含量丰富 表明第 CpG 岛
容易发生甲基化
4 首次应网免费引物设计软件 MSP34 设计 ASPP1 ASPP2 基 MSP 引物
建立检测 ASPP1 ASPP2 基 CpG 岛甲基化状况方法 MSP
5 首次 3 株 p53 野生型肿瘤细胞株(A549 HEPG2 MCF7)成纤维细胞中 ASPP1
ASPP2基 CpG岛甲基化状况检测发现 3株p53 野生型肿瘤细胞株中ASPP1 ASPP2
基 CpG 岛出现甲基化 成纤维细胞中 ASPP1 ASPP2 基 CpG 岛没出现甲基化
结果提示 ASPP1 ASPP2 基 CpG 岛甲基化状况肿瘤发生关
关键词 ASPP p53 细胞凋亡 肿瘤 启动子 甲基化 MSP
第三军医学硕士学位文
2
The experimental research on the mRNA expression of
ASPP gene family and the CpG island methylation of
ASPP gene promoters in the tumor cell lines
Abstract
Objective
The p53 protein is one of the bestknown tumour suppressors Recently a new family
of protein the ASPP (for apoptosisstimulating protein of p53) was discovered This family
consists of three members ASPP1 ASPP2 and iASPP ASPP1 and ASPP2 act as potent
activators of p53 iASPP acts as an inhibitor of p53 The apoptotic function of p53 is
stimulated by ASPP1 and ASPP2 and inhibited by iASPP To understand how important the
ASPP proteins are in human cancers we investigated the mRNA expression levels of ASPP
members in eight kinds of cancer cell lines To further understand the cause of abnormal
ASPP expression in cancer cells We detected the methylation status of ASPP1 and ASPP2
gene promoter in tumor cell by methylation specific polymerase chain reaction
Methods
1 Cells were grown in Dulbecco modified Eagle medium supplement with 10 fetal
calf serum and 100Uml benzylpenicillin and 100 Uml streptomycin sulfate in a humidified
atmosphere containing 5 of CO2 at 37oC
2 mRNA expression levels of ASPP gene family were measured by RTPCR
3 The CpG island status of ASPP1 and ASPP2 gene promoter were analyzed and MSP
primers were designed by Internet free primer design software An analysis method of
ASPP1 and ASPP2 gene methylation status was established
4 Using this MSP method to detect the CpG island methylation status of ASPP1 and
ASPP2 gene promoter in three p53 wildtype tumor cell lines (Hepg2 MCF7 A549) and
fibroblast cell
Results
1 ASPP gene family mRNA was expression in all cell lines but the expression is
different in each cell line
2 ASPP1 gene mRNA expression in all tumor cell lines is prominent lower than the
第三军医学硕士学位文
3
expression in normal cells (fibroblast cell and blood monocyte) p<001 ASPP2 gene
mRNA expression is different in each tumor cell line The expression level of the tumor cell
lines show descendent trend comparing with that of the normal cells P<005
3 iASPP gene mRNA expression is different in different cells In A549 and HT29 the
expression is no difference p>005 In the other 6 tumor cell lines the expression is higher
than the normal cell expression P<001
4 ASPP1 and ASPP2 gene CpG island analysis using Internet free CpG island analysis
software show that ASPP1 gene has 10 CpG islands and there is one CG sequence average
34 bases in the first CpG island ASPP2 gene has 3 CpG island and there is one CG
sequence average 383 bases in the first CpG island
5 MSP analysis showed that CpG islands of ASPP1 and ASPP2 gene promoters were
methylated in the three p53 wildtype tumor cell lines Hepg2 MCF7 A549 Whereas in
fibroblast cell unmethylated bands was observed
Conclusions
1 The mRNA expression of ASPP gene family was measured by RTPCR for the first
time The result indicated that ASPP gene family mRNA was expressed in all tumor cell
lines researched
2 The electrophoresis photos were semiquantified analysis by GelPro 31 software
The results showed that ASPP1 and ASPP2 gene mRNA expression in tumor cell lines was
lower than the expression of normal cells iASPP gene mRNA expression in tumor cell lines
was higher than the expression of normal cells The result indicated that ASPP1 and ASPP2
could enhance the apoptotic function of p53 and they could suppress tumor growth even in
tumors expressing mutant p53 iASPP can restrain the apoptotic function of p53
3 The methylation status of ASPP1 and ASPP2 gene was firstly analyzed by us and the
rich CG sequence content exists in their first CpG island This condition indicates that they
were affected easily by methylation in this position
4 Using internet free primer design software MSP34 designed MSP primer of ASPP1
and ASPP2 and established an analysis method MSP to detect ASPP1 and ASPP2 gene
methylation status
5 ASPP1 and ASPP2 gene CpG island methylation status was detected first time in
three p53 wildtype tumor cell lines (Hepg2 MCF7 A549) and fibroblast cell The results
第三军医学硕士学位文
4
showed that ASPP1 and ASPP2 gene CpG islands were methylated in three p53 wildtype
tumor cell lines and were unmethylated in fibroblast cell These results indicated that the
changes of CpG island methylation status of ASPP1 and ASPP2 gene promoter might be an
important factor in tumorigenesis
Key words ASPP p53 Apoptosis Tumor Promoter Methylation MSP
第三军医学硕士学位文
1
英文缩写词表
英文缩写 英文全称 中文译名
ASPP Apoptosis Stimulation Protein of P53 P53 凋亡刺激蛋白
BPB Bromophenol Blue 溴酚兰
DEPC Diethl Pyrocarbonate 焦碳酸二乙酯
DNA Deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核酸
dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate 脱氧核糖核苷三磷酸
EB Ethidium Bromide 溴化乙锭
EDTA Ethylene dinitrilotetraacetic acid 乙二胺四乙酸
HEPES Hydroxyethyl Piperazine Ethanesulfonic acid 羟乙基哌嗪乙磺酸
iASPP Inhibitory member of the ASPP family ASPP 家族抑制成员
IOD Integrated Optical Density 积分光密度
mRNA Messenger ribonucleic acid 信核糖核酸
MSP Methylation specific polymerase
chain reaction
甲基化特异性 PCR
PBS Phosphate buffer solution 磷酸盐缓溶液
PCR Polymerase chain reaction 聚酶链反应
RNA Ribonucleic acid 核糖核酸
RTPCR Reverse transcription PCR 逆转录聚酶链反应
TAE TrisAcetic acid glacialEDTA
electrophoresis buffer
Tris醋酸EDTA 电泳缓液
Taq Thermus aquaticus DNA Polymerase 栖热水生菌 DNA 聚合酶
TE TrisEDTA buffer TrisEDAT 缓液
TrisHCl Trishydrochloric acid buffer Tris盐酸缓液
第三军医学硕士学位文
7
ASPP 基家族 mRNA 肿瘤细胞株中表达
启动子 CpG 岛甲基化实验研究
前 言
肿瘤形成原癌基抑癌基遗传性变化增加 丢失 突变等 逐步积累
程 遗传素环境素作子疾病 越越研究表明
细胞凋亡(apoptosis)[12]肿瘤形成着密切关系 细胞死亡异常侧面出发寻
找正常组织演变肿瘤组织途径 细胞凋亡受抑制 破正常组织中细胞增
殖凋亡衡调节 结果细胞死亡率降 果机体重新恢复增殖凋亡
衡调节 导致细胞数目断增加 表现出生长优势 正常组织转变肿
瘤[345] 根美国 ISI(Information Sciences Institute) SCI 录引文关键词检索
发现 全球然科学研究中文发表集中三领域分细胞信号转导 细胞凋
亡基组研究 细胞凋亡成前生命科学研究热门领域
细胞许功 基转录 DNA 合成 DNA 修复 细胞循环停滞 衰老
细胞凋亡受 p53 蛋白调节 类肿瘤中 35 40发生 p53 基突变
p53 野生型肿瘤中 激活 p53 途径受破坏[6] 细胞凋亡程中 p53 蛋白
起着关重作 p53 转录调控子 质种核磷酸蛋白 正常
情况 p53 表达较低 特异 DNA 序列(p53 结合位点)结合 促转录
P53 生物功细胞处异常情况细胞周期负调控 细胞滞留
G1 期 G2M 期 细胞进入 DNA 合成 S 期丝分裂 细胞修复 DNA 损伤
机会 果细胞成功修复 DNA 效抗外界素干扰 胞杀防御
系统(凋亡)激活 细胞凋亡成 p53 保护整体组织受进步损伤防御功
肿瘤研究中发现 50肿瘤组织中 p53 基点突变缺失 表明 p 53
失活肿瘤发生必条件 果肿瘤组织带 p53 基表达正常
异体蛋白胞蛋白异常表达导致 p53 功减弱失活
发生肿瘤
2001 年 英国帝国癌症研究抑癌基研究室卢欣教授领导研究组发现
新蛋白家族─ASPP(apoptosis stimulating protein of p53)[7] 该家族成员 ASPP1
ASPP2 iASPP(inhibitory member of the ASPP family)[8] ASPP 蛋白家族
第三军医学硕士学位文
8
研究中发现 ASPP 家族改变 p53 蛋白细胞凋亡功 时 揭示 ASPP
家族 p53 作总机制 ASPP p53 结合形成 ASPPp53 复合物作原凋亡基
启动子 ASPP 微变化引起 p53 结合 DNA 力发生改变 影响 p53
诱导凋亡力[7] 细胞根 p53 蛋白停滞基结合凋亡基结合活力
做出细胞停滞细胞凋亡决定[9] ASPP1 ASPP2 通提高原凋亡基活力
促进 p53 赖细胞死亡 iASPP ASPP1 ASPP2 竞争 p53 结合位点
影响 ASPPp53 复合物 DNA 结合力 阻止 p53 细胞凋亡功 ASPP 家
族细胞凋亡中起着重作 目前国尚未该家族相关研究 次
实验研究 8 种肿瘤细胞株 2 种正常细胞中 ASPP 基家族 mRNA 表达状况
DNA 甲基化种基表观性修饰 影响染色质结构修饰 DNA 空间结构
DNA 序列发生变化[10] 影响基表达机制 肿瘤发生着密切联系
DNA 甲基化状态改变致癌作关键素 肿瘤抑制基失活方式
通基机制基外机制导致细胞增殖分化相关基表达异常 造成细胞失
正常程控制发生恶变形成肿瘤[ 11] ASPP 基家族 2001 年发现
细胞凋亡程中起着重作 DNA 甲基化状态改变细胞癌变关键
素 ASPP 基家族否存甲基化改变 目前国外尚未相关报道
次实验中利网 CpG 岛分析软件 ASPP1 ASPP2 基 CpG 岛进行分析
MSP34 甲基化引物设计软件设计引物 建立检测 ASPP1 ASPP2 基 CpG 岛甲
基化状态方法 MSP[12] 检测肿瘤细胞株中 ASPP1 ASPP2 基 CpG 岛甲基
化状态 解 ASPP1 ASPP2 基启动子甲基化状况肿瘤发生发展中作
实验研究容
DMEM 细胞培养液培养 8 种肿瘤细胞株成纤维细胞 时单核细胞
分离液分离血液单核细胞 利 RTPCR 方法分析细胞中 ASPP 基家族 mRNA
表达情况 解 ASPP 基家族 p53 相互机制 揭示 ASPP 基家族细胞凋亡
关系
二 利 internet 网 CpG 岛分析软件 ASPP1 ASPP2 基启动子 CpG 岛进
行分析 利网免费引物设计软件 MSP34 设计 MSP 引物 建立检测 ASPP1
ASPP2 基启动子 CpG 岛甲基化状况 MSP 方法
三 利 MSP 分析三株 p53 野生型肿瘤细胞株成纤维细胞 ASPP1 ASPP2
基启动子 CpG 岛甲基化状况
第三军医学硕士学位文
9
第部分 ASPP 基 mRNA 肿瘤细胞株中表达研究
癌症危害类健康重难题 癌症死亡率床疾病中位
居第二 目前止 量实验研究证明 细胞癌变分子基础基 DNA
变化正常活动导致细胞癌变 说 癌变某基表达失控结果
肿瘤发生中两类基 癌基(oncogene)抑癌基(tumor suppressor gene)
抗癌基(antioncogene)关 癌基抑癌基正常细胞胚胎期生命早期表
达类基 功调控细胞增殖分化关 癌基促进细胞增殖 抑制细
胞分化细胞凋亡 抑癌基作相反 正常状态 两类基相互作
维持细胞正常生长 分化凋亡 某种原原癌基激活抑癌基失活 均
导致细胞度增殖 分化 凋亡受阻 终引起肿瘤发生
p53 肿瘤抑制基 研究证明 p53 变异活性改变造成细胞正常抑癌
功丧失 导致肿瘤发生 约 50恶性肿瘤存 p53 突变缺失 外 50
肿瘤中 p53 非具活性 p53 野生型肿瘤量研究中发现 p53
肿瘤中没活性 p53 活性失活调节子功出现障致 2001
年卢欣[7]教授等发现 ASPP(Apoptosis Stimulation Protein of P53)蛋白质家族 包括
ASPP1 ASPP2 iASPP(Inhibitory member of the ASPP family)[8]等三成员 研究证
明 ASPP 蛋白质家族体 p53 关键调节蛋白
p53 稳定染色体 DNA 方面充 基组卫士 (guardian of genome) 分子警
察 (molecular policeman)角色 细胞 DNA 受损伤时 p53 面两种选择 诱
导细胞循环停滞 启动 DNA 修复 二 诱导细胞凋亡 DNA 损失太法修复时
ASPP 蛋白 p53 结合 p53 蛋白调靶基 bax IGFBP3 抑制 bcl2 基
调控细胞凋亡 维持基组遗传学稳定性[13] 行抑癌基功 诱导细胞凋亡
诱导凋亡仅清癌细胞 抑制突变细胞细胞群增值 否会细胞
变化生成更加恶性肿瘤
ASPP 蛋白家族 p53 促凋亡作 目前国外研究尚少 否
肿瘤细胞发生中起作 现清楚 RTPCR 分析 8 种肿瘤
细胞株中 ASPP 基家族 mRNA 表达情况 揭示 ASPP 基家族肿瘤发生中
作 时解 ASPP 蛋白家族 p53 促凋亡作机理 现实验报告
第三军医学硕士学位文
10
实验材料
细胞株
早幼粒急性白血病细胞株(HL60) 慢性髓原性白血病细胞株(K562) 急性 T 细胞
白血病细胞株(Jurkat)西南医院血液科陈龙硕士惠赠 乳腺癌细胞株(MCF7)西南
医院乳腺中心唐波硕士惠赠 结肠癌细胞株(HT29 HCT116) 肺癌细胞株(A549)
肝癌细胞株(HEPG2)西南医院分泌科彭勇硕士惠赠
二 仪器
1 恒温 CO2 细胞培养箱 Shldon Lab USA
2 超净工作台 苏州净化设备限公司
3 倒置显微镜(Olympas) Olympas Japan
4 显微镜(Olympas) Olympas Japan
5 PCR 扩增仪(PE2400) PE 公司 USA
6 紫外分光光度计 Smart spectro 3000(BioRad)
7 高速低温冷冻离心机 Beckman Coulter USA
8 电泳系统(FXDY252) 海复星公司
9 ZFZ90 功暗箱式紫外透射仪 海顾村电光仪器厂
10 凝胶成分析仪 Bioprofic French
11 水处理系统 PALL USA
12 电子天 Shimadzu Cerporation Kyoto
13 低温冰箱(20 40 70 ) Sanyo Japan
14 电热恒温水箱(GB1124189) 北京医疗设备厂
15 水离心机(TGL16G) 海安亭科学仪器厂
三 试剂
1 RPMI 1640 细胞培养液 Gibco
2 DMEM 细胞培养液 Hyclone 进口分装
3 牛血清 Hyclone 进口分装
4 胰酶 Sigma
5 Tripure Isolation Reagent 罗氏
6 HEPES Sigma
7 DEPC Sigma
第三军医学硕士学位文
11
8 EZNA Gel Extraction Kit Omega
9 巯基乙醇 海化学试剂公司
10 Taq 酶 Promega
11 DNTP Promega
12 PCR Markers 华美生物工程公司
13 琼脂糖 Shanghai Yito Enterprise Company
14 TrisHCl Farco Chemical Hongkong
15 RTPCR 试剂盒 TaKaRa Japan
16 MOPS Sigma
17 琼脂糖 Shanghai Yito Enterprise Company Limited
四 试剂配制
1 RPMI1640 DMEM 培养液(10牛血清)
分称取 RPMI1640 DMEM 干粉 104g 溶 800ml 离子水中 分加入碳
酸氢钠约 20g 32g 调 pH 72 74 加青霉素 链霉素终浓度 100Uml
离子水补足容积 1000ml 菌菌滤器培养基溶液抽入滤瓶中(022 m 膜
滤菌) 抽滤完毕 培养基转入菌分装瓶中 加入 1000ml 灭活菌牛血
清 充分混匀 分装成 100ml瓶储存 4 备
2 磷酸盐缓液(PBS)
800 ml 蒸馏水中溶解 8gNaCl 02gKCl 144gNa2HPO4 024gKH2PO4
HCl 调节溶液 PH 值 74 加水定容 1L 15 磅(1034×105Pa)高压蒸汽灭菌
20 分钟 保存室温
3 025胰酶消化液
称取 1g 胰酶干粉 溶解 400 ml PBS 缓液中 菌菌滤器滤分装 4
保存
4 01 DEPC 水
离子水 1000 ml DEPC 1ml 37 夜 15 磅高压 20 分钟
5 01M 枸橼酸钠 10 乙醇混合液
294g 枸橼酸钠溶 900ml 离子水 然加 100ml 水乙醇 混匀 滤菌
6 EB 溶液(10mgml)
1000ml 水中加入 1g 溴化乙锭(EB) 力震荡确保完全溶解 然转移
棕色瓶中 室温保存
第三军医学硕士学位文
12
7 05molL EDTA(pH80)
8000ml 水中加入 1861g EDTANa2H2O 搅拌 然 NaOH 调节 pH 值
80(约需 20g NaOH 颗粒) 然定容 10L 分装高压灭菌备
8 50 TAE
242gTris 碱 + 571ml 冰醋酸 + 1000ml 05molL EDTA(pH80) 加水定容 10L
室温保存
9 DNA 凝胶样缓液
溴酚兰(BPB)025 + 二甲苯青 025 + 甘油 30
10 PCR 琼脂糖凝胶
20g 琼脂糖溶 100ml 1 TAE 煮沸溶解 冷 60 加 10mgml EB 溶
液 50 l
11 5 RNA 甲醛变性凝胶电泳缓液
MOPS 01mmolL(pH 70) + 乙酸钠 40 mmolL + EDTA 5 mmolL(pH 70)
10M NaOH 盐酸调 pH 70
12 RNA 甲醛变性凝胶
1 RNA 甲醛变性凝胶缓液 + 甲醛 22molL + EB 05 gml
13 TE(10mM TrisHCl01mMEDTA pH 75)
484gTrisCl 溶 400ml 离子水 NaOH 调节 pH 值 75 然加 02ml
05molL EDTA(pH80) 加水定容 500ml 混匀
实验方法
细胞培养
1 早幼粒急性白血病细胞株 (HL60) 慢性髓原性白血病细胞株 (K562) 急性 T
细胞白血病细胞株(Jurkat)高糖 RPMI1640 培养液(10牛血清)培养
2 肺癌细胞株 A549 结肠癌 HT29 HCT16 乳腺癌 MCF7 肝癌 HEPG2
成纤维细胞高糖 DMEM 培养液(10牛血清)培养
3 肿瘤细胞株复苏 液氮中取出冻存肿瘤细胞株冻存 立放入 37
水浴箱中 振荡复融 2060 秒 中容物完全溶解 细胞悬液移入 10ml 离心
缓慢加入 80ml 左右 10牛血清培养液 菌低速离心 1000rpm 3min 弃
掉清液 加入适量新鲜 10牛血清培养液溶解沉淀细胞 移入螺口 50ml 培养瓶
第三军医学硕士学位文
13
置 37 5CO2 孵箱培养
4 细胞换液 天观察细胞生长 培养液颜色变黄 立更换培养液 3 种
白血病细胞株均悬浮生长 先吸入菌试 菌低速离心 1000rpm 5min 弃掉
清液 加入适量新鲜配制RPMI1640 (10牛血清)培养液轻轻混匀接种50ml
螺口培养瓶 37 5CO2 继续培养 贴壁生长肿瘤细胞株直接倒掉培养液
加入适量新鲜配制 DMEM(10牛血清)培养液继续培养
5 细胞传代 悬浮生长细胞株先吸入菌试 菌低速离心 1000rpm
5min 弃掉清液 加入适量新鲜配制 RPMI1640 (10牛血清)培养液轻轻混匀
分装接种 50ml 螺口培养瓶 37 5CO2 继续培养 贴壁生长肿瘤细胞株
胰酶消化 加入适量新鲜配制 DMEM (10牛血清)培养液轻轻吹散混匀
分装接种 50ml 螺口培养瓶 37 5CO2 继续培养
6 细胞回收 细胞处数生长时回收 冻存
二 血液白细胞收集
1 收集新鲜类血液
2 天津产单核细胞分离液单核细胞
21 加 4ml 单核细胞分离液离心中
22 加 2ml 新鲜血液(壁缓慢加单核细胞分离液面)
23 1200g 离心 15 分钟
24 吸取层单核细胞 加离心中
25 4 5ml 生理盐水洗滴单核细胞 1200g 离心 5 分钟 弃清 重复该
步骤二次
三 DNA RNA 提取
第步 细胞中提取 DNA RNA
1 获细胞置 EP EP 容量提取细胞 TriPure Isolation
Reagent 试剂总体积 2 倍
2 室温细胞中加入 TriPure Isolation Reagent 试剂 量 5 10 10
细胞 1ml TriPure Isolation Reagent Note 少量细胞(<10 )试剂量 08ml
TriPure Isolation Reagent + 510 微克糖原(glycogen作协助 RNA 沉淀载体)
3 吸反复吹细胞匀浆器细胞裂解
4 细胞裂解物转移 EP 中
注意 步样品匀浆进行步前 70 保存少 月
第三军医学硕士学位文
14
第二步 相分离
1 第步中样品匀浆置室温孵育 5 分钟――核蛋白复合物充分溶解
2 加入氯仿 量 02 ml 氯仿应 ml TriPure Isolation Reagent
3 心盖盖 力剧烈振荡 15 秒
4 室温孵育 215 分钟
5 4 12000g 离心 15 分钟 (离心时超 12000g)
6 离心 分三层
**层色液相 约占第步 TriPure Isolation Reagent 总量 60
RNA 提取
**中间层层红色机物液相 DNA 蛋白质提取
第三步 RNA 分离
1 第二步中色层液相转移新 EP 中
2 步骤色液相中沉淀 RNA
21 加异丙醇液相 1ml TriPure Isolation Reagent 应 05ml 异丙醇
22 盖盖 颠倒数次充分混匀
23 室温孵育 5 10 分钟 利 RNA 沉淀形成
24 4 12000g 离心 15 分钟
25 弃层液
3 加入 75 乙醇 1ml TriPure Isolation Reagent 应 1ml 乙醇
**RNA 沉淀保存 75 乙醇中 4 保存 周 20 保存年
4 通旋转作洗涤乙醇中 RNA 颗粒
5 4 7500g 离心 5 分钟 弃清液
6 空气干燥法样品置真空中 5 10 分钟 RNA 颗粒中余乙醇
7 DEPC 处理 RNA 酶水 DEPC 处理 05 SDS 重新悬浮 RNA 颗粒
8 吸头混匀 RNA 溶液 55 60 孵育 10 15 分钟
9 取 10ul 稀释 10 倍紫外分光光度计测定提取 RNA 260nm 280nm 处
吸光度 计算 RNA 浓度 OD260OD280 值
10 提取 RNA 作甲醛变性凝胶电泳 检测 RNA 完整性
第四步 DNA 提取
1 心弃第二步全部色液相
2 步骤中间相层红色液相中沉淀 DNA
第三军医学硕士学位文
15
21 加入水乙醇—— 1ml TriPure Isolation Reagent 应 03ml 水乙醇
22 盖盖颠倒数次充分混匀
23 室温孵育 2－3 分钟利 DNA 沉淀形成
24 4℃ 2000g 离心 5 分钟
3．清液转移 EP 中4℃保存该清液蛋白质分离
4．弃清液步骤做：
41 加 01M 枸橼酸钠 10％乙醇混合液—— 1ml TriPure 应 1ml
42 室温孵育 30 分钟时混匀
43 4℃ 2000g 离心 5 分钟弃层液
5．重复第 4 步二次
6．三次洗涤步骤处理 DNA 沉淀
61 75％乙醇洗涤 DNA 沉淀——１mlTriPure Isolation Reagent 应 15－
20ml 75％乙醇
62 室温孵育 10－20 分钟时混匀
63 4℃ 2000g 离心 5 分钟弃层液
7．通空气干燥法样品置真空中 5－10 分钟 DNA 颗粒中余
乙醇
8．步骤溶解 DNA
81 加定量 8mM NaOH DNA 浓度达 02－03μgμl例：107 细
胞加 03－06ml8mM NaOH
82 移液转移样品
83 果含没溶解物质 4℃ 12000g 离心 10 分钟清液转移
EP 中
9．取 10ul DNA 稀释 10 倍紫外分光光度计测定提取 DNA 260nm
280nm 处吸光度计算 DNA 浓度 OD260OD280 值
10．取提取 DNA 约 1 g作琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 完整性
四RTPCR 扩增 ASPP 基家族 βactin cDNA 序列引物设计 根
GeneBank 中提供 ASPP1(AJ318887)ASPP2(AJ318888)iASPP(NM_006663)
βactin(M24113)编码氨基酸 cDNA 序列分 Primer Premier 50 软件设计特异
引物引物均海生工公司合成合成引物序列见 Table 1：
第三军医学硕士学位文
16
Table1 Summary of the primer sets and Anealing for ASPP gene family and âactin
Primer Sequence Anealing
ASPP1 sense 5 GCAGCACACAGCGCCTTAAATAAG 3 604
ASPP1 antisense 5 TCCATTGTCCACATCGGCCAAGGT3 621
ASPP2 sense 5' TATCTAATCCTTACCGAAACC 3' 567
ASPP2antisense 5’CCCTCAGGCTCATAACTAA 3’ 585
iASPP sense 5'CCGCCTCTTCCATCGCA 3' 585
iASPP antisense 5' CTGGCTCGGGTCGTTCAT 3' 573
âactin sense 5' GTGGGCCGCTCTAGGCACCAA 3' 563
âactin antisense 5' CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC 3' 574
âactin sense 5' ACACTGTGCCCATCTACGAGGGG 3' 638
âactin antisense 5'ATGATGGAGTTGAAGGTAGTTTCGTGGAT 3' 612
引物海基康生物公司合成
五 RTPCR 扩增目片段
1 反转录
ASPP 基家族 Table2 配制反转录反应体系
Table2 System of reverse transcription reation
Reagent Volume Final concentration
MgCl2 4 l 25mmolL
10 RNA PCR Buffer 50 l
dNTP 1 l 025mmolL
RNase Inhibitor 1 l 20U
AMV Reverse Transcriptase 10 l 25U
Random 9 mers 10 l 25pmol l
RNA X l (50 g样) 100ng l
RNase Freed H2O 补 H2O 50 l
Total 500 l
反转录反应条件
30 10min 48 45 min 99 5 min 4 5 min
反转录形成 cDNA 产物20 保存
2 PCR
第三军医学硕士学位文
17
21 冰水浴条件 ASPP 基家族 Table3 配制反应体系
Table3 System of PCR reaction
10 PCRBuffer 50 l
MgCl2 40 l
dNTP 10 l
Primersense 20 l
Primerantisense 20 l
cDNA 50 l
Taq 05 l
H2O 305 l
Total 500 l
述 PCR 反应液轻轻混匀 1000rpm 离心 10 min 加 300 l 液体石蜡进行
扩增
22 PCR 反应条件
ASPP1 PCR 反应条件
95 3min 94 30 Sec 56 30 Sec 72 45 Sec 72 8min 4 保存
30 cycles
ASPP2 PCR 反应条件
95 3min 94 30 Sec 55 30 Sec 72 45 Sec 72 8min 4 保存
30 cycles
iASPP PCR 反应条件
95 3min 94 30 Sec 53 30 Sec 72 45 Sec 72 8min 4 保存
30 cycles
3 电泳
1 8 例取 10 l 溴酚兰 80 lPCR 产物混匀 点样 15琼脂糖
100V 电压电泳 45 min 紫外灯观察结果
六 胶回收 PCR 产物测序
第三军医学硕士学位文
18
1 ASPP2 基 RT PCR 产物做胶回收
11 新鲜 TAE buffer 跑电泳 TAE buffer TBE buffer 会胶回收率
降低
12 切需目基条带 UV 射超 30 秒
13 切胶称重 1gml 浓度胶例 02g 胶体积约 02ml 加 34
倍体积 binding buffer 5565 温度 7min 直胶完全溶解 23 分钟振摇 EP
次
14 取 750 l 混合液加入滤柱 10000g 离心 1min 弃掉滤出液 混合液
体积超 750 l 重复前面步骤 滤柱胶回收量 2530 g 回收
DNA 量超限度 需分干滤柱回收
15 加 300 l binding buffer 1000g 离心 1min
16 加入 750 l 事先已混水乙醇 wash buffer 静置 23min 1000g 离心
1min
17 弃掉滤出液 重复步骤 6
18 弃掉滤出液 空滤柱 10000g 离心 1min
19 滤柱移入干净 EP 中 膜中央加入 3050 l DNA Elution buffer
菌离子水(PH 值必须 8 左右) 10000g 离心 1min
110 测胶回收 DNA 浓度测 A260A280 值
2 正义引物目基做单测序
七 凝胶图分析
电泳凝胶置凝胶图分析系统 相 采 GelPro31(Media Cyberneties
Inc USA)凝胶图分析软件分析处理 测定扩增产物量 PCR 产物量积分光密度
(integrated optical density IOD)表示 积分光密度电泳条带均光密度电泳条带
面积积 计算 mRNA ß actin 值 该 mRNA 相表达量
八 统计学处理
实验数采 SPSS80 软件进行处理 统计方法独立样 t 检验
实验结果
细胞培养
HL60 K562 Jurkat 等白血病细胞株悬浮生长 细胞呈圆形圆球形 (见
第三军医学硕士学位文
19
片 1) A549 HEPG2 MCF7 HCT116 HT29 等细胞株贴壁生长 细胞呈圆
形 椭圆形梭形(见片 2)
二 DNA RNA 提取
1 细胞 DNA 总 RNA 定量纯度
细胞株提取 DNA A260A280 190 表明提取 DNA 纯度较高
MSP 分析 总 RNA A260A280 185 表明提取总 RNA 纯度较高
RTPCR 扩增
2 取细胞株 DNA 总 RNA 完整性鉴定
DNA 直接电泳 结果点样端见条亮带 表明提取 DNA 完整性较 (见
片 3)
真核细胞总 RNA80 rRNA( 28S 18S 5S) mRNA 含量仅 1 5
数百数千碱基等 实验甲醛变性 RNA 凝胶电泳 见 28S 18S
5S 三条带清晰 间见分子量云雾状 mRNA 证明提取总 RNA 完整
性较 明显降解 (见片 4)
三 ASPP1 ASPP2 iASPP 基 mRNA 细胞株中 RTPCR 结果
1 RTPCR 结果
ASPP1 ASPP2 iASPP 基 mRNA HL60 K562 Jurkat HCT116 HT29
Hepg2 MCF7 A549 正常血液单核细胞成纤维细胞株中表达 细
胞中表达量少 (见片 5 6 7 8 9 10)
2 图扫描分析结果
GelPro 31 凝胶图扫描分析软件分分析 ASPP1 ASPP2 iASPP 基 mRNA
细胞株 HL60 K562 Jurkat HCT116 HT29 Hepg2 MCF7 A549 正常
血液单核细胞成纤维细胞株中条相应带 IOD 值 计算种细胞 IOD 值
ßactin IOD 值值 结果 x ±SD 表示(见 Table4) 细胞株 HL60 K562
Jurkat 扫描结果正常血液单核细胞扫描结果较 细胞株 HCT116 HT29
Hepg2 MCF7 A549 扫描结果成纤维细胞扫描结果较 分作 t 检验
计算 P 值(见 Table5 Table6)
第三军医学硕士学位文
20
Table4 The Expression of ASPP family genes mRNA in different Cell Lines ( x ±SD)
Destination genes
Cell lines
ASSP1 ASPP2 iASPP
Blood Monocyte 0545 0019 0869 0021 0228 0032
HL60 0199 0016 0815 0031 0363 0031
K562 0155 0081 0789 0016 0373 0045
Jurkat 0191 0015 0785 0025 0367 0017
Fibroblast 0636 0041 0594 0016 0249 0029
HCT116 0381 0023 0296 0008 0442 0025
HT29 0300 0026 0548 0013 0248 0017
A549 0205 0021 0459 0020 0275 0011
HEPG2 0158 0020 0456 0046 0633 0034
MCF7 0205 0021 0466 0027 0520 0039
ASPP1
0
01
02
03
04
05
06
07
Cell Lines
Relative content of ASPP1 mRNA
Blood Monocyte
HL60
K562
Jurkat
Fibriblast
HCT116
HT29
A549
HEPG2
MCF7
Figure1 The Expression of ASPP1 genes mRNA in different Cell Lines
第三军医学硕士学位文
21
ASPP2
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
1
Cell Lines
Relative content of ASPP2 mRNA
Blood Monocyte
HL60
K562
Jurkat
Fibriblast
HCT116
HT29
A549
HEPG2
MCF7
Figure 2 The Expression of ASPP2 genes mRNA in different Cell Lines
iASPP
0
01
02
03
04
05
06
07
Cell Lines
Relative content of iASPP mRNA
Blood Monocyte
HL60
K562
Jurkat
Fibriblast
HCT116
HT29
A549
HEPG2
MCF7
Figure 3 The Expression of ASPP2 genes mRNA in different Cell Lines
第三军医学硕士学位文
22
Table5 The P value of three suspension cell lines comparing to blood monocyte (ttest)
ASPP1 ASPP2 iASPP
HL60 P<001 P<005 P<001
K562 P<001 P<001 P<001
Jurkat P<001 P<005 P<001
Table6 The P value of five anchorage cell lines comparing to fibroblast cell (ttest)
ASPP1 ASPP2 iASPP
HCT116 P<001 P<001 P<001
HT29 P<001 P<001 P<001
A549 P<001 P<001 P>005
HEPG2 P<001 P<001 P<001
MCF7 P<001 P<001 P>005
四 目基胶回收测序结果
1 胶回收结果
目基 ASPP2 cDNA 胶回收浓度 271 gml A260A280 19257
2 测序结果
DNA 序列测定 285 碱基 ASPP2 基序列 2419 2703 285 碱基
完全相 PCR 扩增目片段 测序具体结果
CGAAAGAAACTGTCTAACGCACCAAGGCCTCTAAAGAAACGTAGTTCTATTACAGAGCCAGAGGGTCCTAATGG
GCCAAATATTCAGAAGCTTTTATATCAGAGGACCACCATAGCGGCCATGGAGACCATCTCTGTCCCATCATACC
CATCCAAGTCAGCTTCTGTGACTGCCAGCTCAGAAAGCCCAGTAGAAATCCAGAATCCATATTTACATGTGGAG
CCCGAAAAGGAGGTGGTCTCTCTGGTTCCTGAATCATTGTGCCCCAGAGGATGTGGGGAATGCC
测序图谱
第三军医学硕士学位文
23
讨
p53 ASPP 家族结构功
p53 基认识历肿瘤抗原 癌蛋白抑癌基三阶段[14] 年
研究证明起癌基作 p53 基突变体 正常 p53 基(野生型)参
细胞生长负性调控 抑制肿瘤发生 发展
类 p53 基定位 17 号染色体短臂(17p131) 长度约 20Kb 11 外显子
第三军医学硕士学位文
24
10 含子组成 第 1 外显子编码 外显子 2 4 5 7 8 分编码 5 进化
高度保守结构域 5 高度保守区 1319 117142 171192 236258 270286
编码区 p53 蛋白 393 氨基酸组成 级结构分三结构域 第结
构域 N端开始 包括 17~80 区含酸性氨基酸较 该区二级结构部分 螺
旋 第二结构域包括 75~150 肽 区含疏水脯氨基较 疏水区 二级
结构长短等片层结构 11 片层相互反回折成夹心结构 核心疏水
区 高度保守突变区 第三结构域包括 C 端 319~393 肽段区域 含碱性氨
基酸较 碱性区 三结构域功 N端(1~43 肽段)作转录子
促进基转录 102~292 肽段区域 DNA 特异序列结合 处结合需 Zn2+
C端(300~393 肽段) p53 四聚化 DNA 呈非特异结合等关 野生型 p53 蛋
白 DNA 受损高度相关性 通影响编码细胞周期相关蛋白质基表达
调控细胞周期 G1 停滞
ASPP(apoptosis stimulating protein of p53)[7] p53 凋亡刺激蛋白 2001 年英国帝
国癌症研究抑癌基研究室卢欣教授领导研究组发现新蛋白家族
包括 ASPP1 ASPP2 iASPP(inhibitory member of the ASPP family)[8]三成员 该家
族结构特点 SH3 结构域 量锚蛋白重复 丰富谷氨基结构
域 ASPP 命名 ankyrin repeat SH3 domain prolinerich domain
containing proteins 缩写
ASPP1 PPP1R13B 基编码 1090 氨基酸组成蛋白质 功性氨基
酸区域 pro ank SH3 组成 p53BP2Bbp 源性蛋白质 ASPP1 C末
端 948 氨基酸 KIAA0771 蛋白相 377氨基酸 p53BP2相 ASPP2
p53BP2 编码 1128 氨基酸组成蛋白质 功性氨基酸区域 pro
ank SH3 helical 组成 ASPP2 编码 1128 氨基酸蛋白延伸 1005 氨基酸
p53BP2 ASPP1 ASPP2 蛋白 N末端 C末端相似性
MMPM 序列开始 蛋氨酸开始转录 Chen YuZhi[[15]等研究发现 ASPP2
够抑制 APPBP1 拯救 ts41 细胞突变力 时阻止 APPBP1 诱导神细胞
凋亡 ASPP1 ASPP2 减弱 Ras Ras+E7 Ras+E1A 等原癌蛋白转化潜 ASPP1
ASPP2 促进 p53 细胞凋亡功特异 功增强 p53 DNA 结
合 促进 p53 凋亡基启动子活化 增强 p53 细胞凋亡功 细胞程序性死亡
(programmed cell death PCD) 清机体余细胞 ASPP1 ASPP2 野生型
p53 结合 突变型 p53 结合 突变型 53 结合力野生型 p53
第三军医学硕士学位文
25
结合力弱 肿瘤发生程中 p53 序列旦突变 ASPP1 ASPP2
结合 阻止 p53 诱导细胞凋亡
iASPP 类 PPP1R13L 基编码 线虫中 ape1(apoptotic enhancer
1)基编码[34] 315 氨基酸组成 p65 A结合蛋白 C末端 223
氨基酸 53BP2 C末端 52相 iASPP CeiASPP(Celegans iASPP)
C末端 ASPP1 ASPP2 C末端广泛相似性 iASPP Ras E1A E7
合作癌蛋白 iASPP 表达增强 Ras Ras+E7 Ras+E1A 转化活性
增强突变 Ras p53 Ras+p53H175 Ras+p53L173 转化活性 功
p53 p53H175 p53L173 突变 ASPP1 ASPP2 竞争性 p53 结合位点结
合 抑制 p53 抑癌功 野生型 p53 ASPP 表达水正常乳腺癌中
高表达 CeiASPP 通抑制 Cep53 促凋亡活性抑制 Cep53 凋亡功[1617]
二 p53 ASPP 家族细胞凋亡
年认 肿瘤发生仅细胞增生关 细胞凋亡关 细胞凋亡
受基严格调控 抑癌基 p53 迄发现类肿瘤相关性高基 野生
型 p53 基维持细胞正常生长 抑制恶性增殖程中起着重作[1819] 突变型
p53 基细胞凋亡抑制作 p53 基发生突变 细胞失身
监视机制 促进细胞癌变
P53 介导细胞凋亡身特点 首先 p53 介导凋亡凋亡细胞处细胞
周期中位置关 发生细胞周期阶段[20] 次 p53 诱发细胞凋亡
力受细胞 DNA 受损状况影响 受细胞环境影响[21] 次 p53 介导细
胞凋亡活性细胞类型密切相关[22] p53 介导细胞凋亡机制目前十分清楚
现三种推测解释细胞 p53 影响选择凋亡分裂停滞 第种
剂量反应模型 低水 p53 诱导产生细胞停滞 高水 p53 启动细胞凋亡[23]
第二种 细胞背景 (cellbackground)假设认细胞 p53 反应细胞周围环境决
定 细胞表达高水抗凋亡基更历生长停滞凋亡[24] 第
三种推测认 p53 作靶基启动子 p53 种修饰形式识[2526]
早 1994 年 Caelles 等[27]提出 p53 介导凋亡涉细胞生存相关基
p53 修复受损 DNA 相关基 直接凋亡相关基关 2001 年 ASPP
家族发现支持三种推测中第三种 时 Caelles 提出理相符合
ASPP 蛋白家族三功区 SH3 结构域 量锚蛋白重复 丰富谷氨
基结构域 SH3 结构域 ASPP 蛋白家族 p53 蛋白特异性结合部位 具体情况图 4
第三军医学硕士学位文
26
图 4 ASPP 蛋白家族 p53 特异性结合示意图
ASPP1 ASPP2 蛋白 p53 蛋白结合 刺激 p53 蛋白凋亡功 促进细胞凋亡 iASPP
蛋白 p53 蛋白结合 抑制 p53 蛋白凋亡功 抑制细胞凋亡
细胞 DNA 受损伤时 p53 蛋白面两种选择 促进细胞凋亡 二 促
细胞分裂停滞 修复损伤 DNA 果时 ASPP 蛋白家族 p53 蛋白特异性结合
ASPP 蛋白提高 p53 反应原凋亡基活力 促进 p53 蛋白赖细胞凋亡 ASPP
家族 p53 作总机制 ASPP p53 结合形成 ASPPp53 复合物作原凋亡基
启动子 ASPP 微变化引起 p53 结合 DNA 力发生改变 影响 p53
诱导凋亡力 细胞根 p53 蛋白停滞基结合凋亡基结合活力做
出细胞停滞细胞凋亡决定[8](见图 5)
图 5 p53 蛋白功示意图
第三军医学硕士学位文
27
细胞根 p53 蛋白停滞基结合凋亡基结合活力做出细胞分裂
停滞细胞凋亡决定 a 般情况 p53 识涉细胞停滞基启动子区域
诱导细胞分裂停滞 修复损伤细胞 DNA b ASPP 蛋白 p53 结合形成 ASPPp53
复合物时 整复合物便倾诱导凋亡基启动子相作 诱导细胞凋亡
三 ASPP 家族肿瘤细胞中表达分析
目前止 癌症然类头号敌 医学发展天 许种癌症
够早期诊断 患者生存期够延长 癌症然前床治疗难
题 死亡率极高疾病 2001 年 Lu[7]等发现 ASPP 蛋白家族 发现
ASPP 蛋白家族成员 p53 蛋白结合改变 p53 蛋白促凋亡功
类 p53 野生型乳腺癌细胞株研究中发现 ASPP1 ASPP2 蛋白 mRNA 表达呈
降 iASPP 蛋白 mRNA 表达呈升[8] 时通 p53 质粒转染实验研
究发现 转染细胞中 p53 表达细胞凋亡率约 17 p53 缺陷 ASPP1
ASPP2 表达正常细胞中 细胞凋亡较少 相反 转染细胞中 果 p53
ASPP1 ASPP2 表达 转染细胞凋亡率 50 表明 ASPP1 ASPP2 促
进 p53 细胞凋亡功 iASPP 肿瘤细胞中表达呈升 表明细胞凋
亡定相关性
类 p53 野生型乳腺癌细胞研究中发现 ASPP 家族肿瘤细胞凋亡较
相关性 该家族否肿瘤细胞凋亡作 目前清楚 特
p53 突变型肿瘤细胞株中 ASPP 家族细胞凋亡否关系尚明确 建
立检测 ASPP 家族 mRNA 表达水 RTPCR 方法 采该方法检测 ASPP 家
族 mRNA 成纤维细胞血液单核细胞肿瘤细胞株 HL60 K562 Jurkat HCT116
HT29 Hepg2 MCF7 A549 等十种细胞中表达情况 十种细胞中 成纤维
细胞 血液单核细胞 Hepg2 MCF7 A549 p53 野生型细胞[28] K562 Jurkat
HL60 p53 缺失型细胞[29] HT29 HCT116 p53 突变型细胞 HT29 细胞株
p53 基座突变发生密码子 273 处 单碱基突变(CGT
CAT)[30] HCT116 细胞株 p53 基座突变发生密码子 247248 处 碱基
突变胞嘧啶变鸟嘌呤(CCGG gCGG)[31]
次实验中 选择 ASPP2 基 RTPCR 产物做胶回收测序 测序结
果 建立 RTPCR 方法完全 时 次实验 RTPCR 产物
电泳图片均 GelPro 31 凝胶图扫描分析软件分析 结果显示 ASPP 家族试验
细胞中均程度表达 实验肿瘤细胞株中 ASPP1 表达量明显低
第三军医学硕士学位文
28
正常细胞表达量(P<001) ASPP2 表达量细胞株中表达差异较
正常细胞表达量相 表达量呈降(P<005) iASPP 表达量 A549
HT29 细胞株中正常细胞显著性差异(P>005) 肿瘤细胞株表达量均高
正常细胞表达量(P<001) 结果说明 ASPP 家族仅 p53 野生型肿瘤细胞
株中表达量改变 p53 突变型 p53 缺陷型肿瘤细胞株均改变
ASPP 蛋白家族改变 p53 细胞凋亡功 Lu[7]等研究结果次实验结
果 ASPP 家族表达量改变仅 p53 野生型细胞株发生恶变关
p53 突变型 p53 缺陷型细胞株发生恶变关 Izidore SLossos 等[32]荧光定量
RTPCR 免疫组化等方法弥漫性 B 淋巴细胞瘤(DLBCL)滤泡性淋巴瘤(FCL)
ASPP2 研究 发现 ASPP2 表达高患者存活时间长 ASPP2 表达低患者存活时
间短 提示 ASPP 家族表达量高低肿瘤预关
第三军医学硕士学位文
29
第二部分 ASPP 基启动子 CpG 甲基化状况研究
体细胞均携带构成身体需全部成分编码基 中
仅少部分处活跃表达状态 基外遗传学修饰作开关样 协
助控制基活性 保证特定类型细胞中确需基处开启状
态[33] 细胞中特定基活性状态信息储存细胞分裂时传递
代
DNA 甲基化熟知基外遗传信号 甲基基团构成遗
传密码四化学碱基胞嘧啶进行修饰 必须遵守规律
DNA 甲基化基表达沉默相关 处活跃表达中基通常处未甲
基化状态[ 34] DNA 甲基化状态改变致癌作关键素 肿瘤抑制基
失活方式 通基机制基外机制导致细胞增殖分化相关基表达异
常 造成细胞失正常程控制发生恶变形成肿瘤[35] ASPP[ 7] 基 2001
年新发现促细胞凋亡基 细胞凋亡程中起着非常重作 该基
否存甲基化现 国外尚未相关报道
DNA 甲基化检测方法样[36] 早期利甲基化位点敏感 II 型限制性
切酶测定 DNA 特异位点 现限制性标指性基组扫描(restriction landmark
genomic scanning RLGS)[37] 表差异分析法(Representational difference analysis
RDA) 甲基化敏感机引物 PCR(Methylationsensitive arbitrarily primed PCR
APPCR) 甲基化 CpG 岛扩增技术(Methylation CpG islands amplification MCA)[38]
甲基化特异性 PCR (methylation specific PCR MSP) [11]等方法技术 目前常成
熟方法 MSP 通网 CpG 岛分析软件 ASPP 基 CpG 岛进行分析
利 MSP34 软件设计 ASPP 甲基化引物 建立检测 ASPP 基甲基化状
况方法 MSP 3 株 p53 野生型肿瘤细胞株 ASPP 基甲基化状况进行检测
解 ASPP 基甲基化状况细胞发生肿瘤关系 现报告
实验材料
细胞株(见第部分细胞株)
二 仪器(见第部分仪器)
第三军医学硕士学位文
30
三 试剂
1 巯基乙醇 海化学试剂公司
2 PCR Core system Promega
3 CpGenome TM DNA Modification Kit Intergen
4 余见第部分试剂
四 试剂配制
1 DNA 修饰试剂 II 溶解
750 l l 巯基乙醇加入 20ml 离子水配制溶液加入 135gDNA 修
饰试剂 II(份样品量) 配制该溶液程中注意试剂呼吸道皮肤刺激作
充分混匀保证完全溶解 1525 避光保存 6 周
2 3M NaOH 原液配制(次前新鲜配制)
1gNaOH 溶 83ml 水中
3 20mM NaOH 90 乙醇(次前新鲜配制)
3M NaOH66 l 100 乙醇 900 l 水 934 l 配成 1ml 样溶液
4 DNA 修饰试剂 I 溶解(次前新鲜配制)
份样品量 227mg 试剂 I 溶 571 l 水中 配制该溶液程中
注意试剂呼吸道皮肤刺激作 约 40 l 3M NaOH 调节 PH 值 5 pH
试纸检测
实验方法
细胞培养 (见第部分实验方法)
二 DNA 提取 (见第部分实验方法)
三 DNA 亚硫酸氢盐修饰
第步 DNA 修饰程
1 70 l 3M NaOH 加入 100 l DNA(10ng l)溶液 充分混匀
2 37 孵育 10 分钟
3 加 550 l 新鲜配制 DNA 修饰试剂 I 旋转 振荡
4 50 孵育 16 20 时
第二步 化学修饰完成 DNA 清
1 力振荡 DNA 修饰试剂 III 悬浮
第三军医学硕士学位文
31
2 DNA 溶液中加入 5 l DNA 修饰试剂 III
3 加 750 l DNA 修饰试剂 II 混匀
4 室温孵育 5 10 分钟
5 5000 g 离心 1 min 弃层液
6 加 10ml 70 乙醇 5000 g 离心 1 min 弃层液 重复该步骤 3 次
7 通 3 次洗涤高速离心 2 3 分钟 吸吸残留悬浮液
8 加 50 l 20mM NaOH 90 乙醇溶解样品
9 旋转 混匀 室温孵育 5 分钟
10 5000 g 离心 1 min 加 10ml 90 乙醇 旋转洗涤 次离心 弃清液
重复该步骤次
11 高速离心 5 分钟
12 弃层液 加 25 50 l TE(10 mM Tris01 mM EDTA pH75) 简单旋
转保证 DNA 溶解 TE 量开初 DNA 量定
13 50 60 孵育 15 分钟
14 高速离心 2 3 分钟 清液转移 EP
15 进行 MSP 测序前 15 25 条件保存 2 月
四 基 CpG 岛分析引物设计
MSP 引物设计 普通 PCR 引物设计 考虑引物特异性包含
容易发生甲基化变化 CpG 序列 GeneBank获 ASPP1 ASPP2
基序列提交 httpitsaucsfedu~urolabmethprimerruleshtml网页 ASPP1 ASPP2
基 CpG 岛加分析 httpwwwchangbiosciencecomprimomhowtohtml 网页
MSP34 引物设计软件设计 ASPP1 ASPP2 基 MSP 引物
MSP 引物设计包括 3 组引物 野生型(W) 甲基化型(M) 非甲基化型(U)
中 W 没亚硫酸氢盐修饰 DNA 进行扩增 检验该基否存
发生改变 作阳性 M U 亚硫酸氢盐修饰 DNA 进行扩增
判断甲基化情况 种引物设计 M U 少出现阳性扩增带 W 相
利 MSP 结果判断 MSP 引物包含胞嘧啶 野生型
引物 3'末端附含 CpG 引物序列见表 7
第三军医学硕士学位文
32
Table 7 Summary of the MSP primer sets and Anealing for ASPP family
Primer Sequence Anealing
ASPP1Uf 5'TTTTGTATTTTGTTGTAGTTGTTGTT3' 46°C
ASPP1Ur 5'CACAAAAAAAATCCACAACACCC3’
ASPP1Mf 5'CGTATTTCGTCGTAGTTGTCGTT3' 51°C
ASPP1Mr 5'CGAAAAAAATCCGCGACGCCC3'
ASPP2Uf 5'GGTGTTTTAGTTTGTGTGGAGG3' 47°C
ASPP2Ur 5'CAAACTAAAATACCCCAAAAAATCA3'
ASPP2Mf 5'GTGTTTTAGTTCGCGCGGAGG3' 51°C
ASPP2Mr 5'ACCGAACTAAAATACCCCGAAAA3
引物海申友生物技术公司合成
五 MSP
1 MSP 反应液
Table8 冰水浴条件配制反应体系
Table 8 system of MSP reaction
Reagent Volume Final concentration
10 PCR Buffer 50 l 1 PCR Buffer
MgCl2 40 l 20mmolL
dNTP 10 l 02mmolL
Primer F 20 l 10mmolL
Primer R 20 l 10mmolL
DNA 50 l ~20ng l
Taq 1 l 5U
H2O 30 l
Total 500 l
述 MSP 反应液混匀 1000rpm 离心 10sec 加 300 l 液体石蜡进行扩增
2 MSP 反应条件
第三军医学硕士学位文
33
ASPP1 甲基化型反应条件
94 5 min 94 30 Sec 51 30 Sec 72 30 Sec 72 8min 4 保存
40 cycles
ASPP1 未甲基化型反应条件
94 5 min 94 30 Sec 51 30 Sec 72 30 Sec 72 8min 4 保存
40 cycles
ASPP2 甲基化型反应条件
94 5 min 94 30 Sec 505 30 Sec 72 30 Sec 72 8min 4 保存
40 cycles
ASPP2 未甲基化型反应条件
94 5 min 94 30 Sec 51 30 Sec 72 30 Sec 72 8min 4 保存
40 cycles
3 电泳结果判断
1 6 例取 15 l 溴酚兰 90 lPCR 产物混匀 点样 2琼脂糖
100V 电压电泳 1 hour 紫外灯观察结果 凝胶成分析仪处理结果
实验结果
ASPP1 ASPP2 基 CpG 岛分析结果
该软件分析 ASPP1 ASPP2 全序列出 ASPP1 基 CpG 序列集聚区 CpG
岛 10 ASPP2 基 CpG 序列集聚区 CpG 岛 3 ASPP1 基第 CpG
岛调控序列中均 34 碱基中 CpG 序列 ASPP2 基第 CpG 岛调
控序列中均 383 碱基中 CpG 序列 CpG 岛中 CG 序列出现
率低第 CpG 岛中 CG 序列出现率 说明 ASPP1 ASPP2 第 CpG
岛更易发生甲基化 ASPP1 ASPP2 基 CpG 岛分析具体结果
第三军医学硕士学位文
34
ASPP1 MethPrimer result
Sequence Name ASPP1
Sequence Length 3780
CpG island prediction results
Criteria used Island size > 100 GC Percent > 400 ObsExp > 060
10 CpG island(s) were found in your sequence
Size (Start End)
Island 1 161 bp (46 206)
Island 2 178 bp (328 505)
Island 3 168 bp (615 782)
Island 4 113 bp (898 1010)
Island 5 110 bp (1045 1154)
Island 6 134 bp (1947 2080)
Island 7 185 bp (2136 2320)
Island 8 107 bp (2741 2847)
Island 9 192 bp (2889 3080)
Island 10 227 bp (3229 3455)
第三军医学硕士学位文
35
1 GAGCCCCGCATCCCGCCGCAGCTGCCGCCTCGCCGCGGCCGGGCCGGAGAGCACGGCGGC
|||++||++++||||++|++++++|++||++||||||++|++|+
1 GAGTTTCGTATTTCGTCGTAGTTGTCGTTTCGTCGCGGTCGGGTCGGAGAGTACGGCGGC
61 GGGAGCGCGGCCTTAGGAGGCGGCCGGAGCGGTGGGCACAGCTCGGCGCGGAGCGTCCTG
+||||++++|||||||||++|++|||++|||||||||++|++++|||++|||
61 GGGAGCGCGGTTTTAGGAGGCGGTCGGAGCGGTGGGTATAGTTCGGCGCGGAGCGTTTTG
121 TCAGGCGGCGGCCGAGGGCGTCGCGGACTCTCCCCGCGATGATGCCGATGATATTAACTG
||||++|++|++||||++|++++||||++++||||||++||||||||||||
121 TTAGGCGGCGGTCGAGGGCGTCGCGGATTTTTTTCGCGATGATGTCGATGATATTAATTG
181 TTTTCTTGAGCAACAATGAACAGATTTTAACAGAAGTTCCTATAACACCGGAAACAACCT
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||++|||||||
181 TTTTTTTGAGTAATAATGAATAGATTTTAATAGAAGTTTTTATAATATCGGAAATAATTT
241 GTCGAGATGTTGTAGAATTTTGCAAGGAACCTGGAGAAGGCAGCTGCCATTTAGCTGAAG
||++||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
241 GTCGAGATGTTGTAGAATTTTGTAAGGAATTTGGAGAAGGTAGTTGTTATTTAGTTGAAG
301 TGTGGAGGGGAAATGAACGTCCCATACCCTTTGATCATATGATGTACGAACATCTTCAGA
|||||||||||||||||++||||||||||||||||||||++|||||||||
301 TGTGGAGGGGAAATGAACGTTTTATATTTTTTGATTATATGATGTACGAATATTTTTAGA
361 TATGGGGTCCACGGAGGGAAGAAGTGAAATTTTTCCTTCGACACGAGGACTCCCCAACTG
|||||||||++|||||||||||||||||||||||++||++|||||||||
361 TATGGGGTTTACGGAGGGAAGAAGTGAAATTTTTTTTTCGATACGAGGATTTTTTAATTG
421 AGAACAGTGAACAAGGTGGCCGTCAGACCCAAGAGCAACGAACTCAGAGAAATGTAATAA
|||||||||||||||||++|||||||||||++||||||||||||||||||
421 AGAATAGTGAATAAGGTGGTCGTTAGATTTAAGAGTAACGAATTTAGAGAAATGTAATAA
481 ATGTACCTGGAGATAAACGTACTGAATATGGGGTTGGGAATCCACGTGTTGAACTTACCC
|||||||||||||||++||||||||||||||||||||||++||||||||||
481 ATGTATTTGGAGATAAACGTATTGAATATGGGGTTGGGAATTTACGTGTTGAATTTATTT
541 TCTCAGAGCTCCAAGATATGGCAGCTAGGCAACAGCAGCAGATTGAAAATCAGCAGCAGA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
541 TTTTAGAGTTTTAAGATATGGTAGTTAGGTAATAGTAGTAGATTGAAAATTAGTAGTAGA
601 TGTTGGTTGCCAAGGAACAGCGTTTACATTTTCTAAAGCAACAGGAGCGCCGTCAGCAGC
|||||||||||||||||++|||||||||||||||||||||++++|||||
601 TGTTGGTTGTTAAGGAATAGCGTTTATATTTTTTAAAGTAATAGGAGCGTCGTTAGTAGT
第三军医学硕士学位文
36
661 AGTCTATTTCTGAAAATGAAAAGCTTCAGAAATTGAAAGAACGAGTTGAAGCCCAGGAGA
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||++||||||||||||||
661 AGTTTATTTTTGAAAATGAAAAGTTTTAGAAATTGAAAGAACGAGTTGAAGTTTAGGAGA
721 ACAAGCTGAAGAAAATTCGTGCAATGAGAGGACAAGTCGACTACAGCAAAATCATGAACG
|||||||||||||||++||||||||||||||||++|||||||||||||||++
721 ATAAGTTGAAGAAAATTCGTGTAATGAGAGGATAAGTCGATTATAGTAAAATTATGAACG
781 GCAATCTGTCTGCTGAAATAGAAAGGTTCAGTGCCATGTTCCAGGAAAAGAAGCAGGAAG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
781 GTAATTTGTTTGTTGAAATAGAAAGGTTTAGTGTTATGTTTTAGGAAAAGAAGTAGGAAG
841 TACAGACTGCAATTTTAAGGGTTGATCAGCTTAGTCAGCAATTGGAAGATTTAAAGAAAG
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
841 TATAGATTGTAATTTTAAGGGTTGATTAGTTTAGTTAGTAATTGGAAGATTTAAAGAAAG
901 GAAAACTGAATGGGTTCCAGTCTTACAATGGCAAATTGACGGGACCAGCGGCGGTGGAGT
|||||||||||||||||||||||||||||||||++|||||++|++|||||||
901 GAAAATTGAATGGGTTTTAGTTTTATAATGGTAAATTGACGGGATTAGCGGCGGTGGAGT
961 TAAAAAGACTGTACCAAGAACTACAGATTCGTAACCAACTTAACCAGGAACAAAATTCAA
||||||||||||||||||||||||++||||||||||||||||||||||
961 TAAAAAGATTGTATTAAGAATTATAGATTCGTAATTAATTTAATTAGGAATAAAATTTAA
1021 AACTTCAGCAGCAGAAGGAACTCTTAAATAAGCGCAACATGGAGGTGGCCATGATGGACA
||||||||||||||||||||||||||++|||||||||||||||||||||
1021 AATTTTAGTAGTAGAAGGAATTTTTAAATAAGCGTAATATGGAGGTGGTTATGATGGATA
1081 AGCGAATCAGTGAACTGCGTGAACGTCTCTATGGGAAAAAAATTCAGCTGAACCGTGTGA
||++|||||||||||++||||++|||||||||||||||||||||||++|||||
1081 AGCGAATTAGTGAATTGCGTGAACGTTTTTATGGGAAAAAAATTTAGTTGAATCGTGTGA
1141 ATGGCACGTCATCACCACAGTCCCCTCTGAGCACATCGGGCAGGGTCGCTGCTGTGGGGC
|||||++||||||||||||||||++|||||||++|||||||||
1141 ATGGTACGTTATTATTATAGTTTTTTTTGAGTATATCGGGTAGGGTCGTTGTTGTGGGGT
1201 CTTATATCCAGGTTCCCAGTGCCGGAAGCTTTCCTGTGCTGGGGGACCCTATAAAGCCCC
|||||||||||||||++|||||||||||||||||||||||||
1201 TTTATATTTAGGTTTTTAGTGTCGGAAGTTTTTTTGTGTTGGGGGATTTTATAAAGTTTT
1261 AGTCTCTCAGTATTGCCTCAAATGCTGCTCATGGAAGATCCAAATCCGCTAATGATGGAA
||||||||||||||||||||||||||||||||||++|||||||||||
1261 AGTTTTTTAGTATTGTTTTAAATGTTGTTTATGGAAGATTTAAATTCGTTAATGATGGAA
第三军医学硕士学位文
37
1321 ACTGGCCAACATTAAAACAGAATTCTAGCTCTTCCGTGAAACCAGTGCAGGTGGCCGGTG
|||||||||||||||||||||||||++|||||||||||||||++|||
1321 ATTGGTTAATATTAAAATAGAATTTTAGTTTTTTCGTGAAATTAGTGTAGGTGGTCGGTG
1381 CAGACTGGAAGGATCCGAGCGTGGAGGGGTCTGTCAAGCAGGGCACTGTCTCCAGCCAGC
||||||||||||++||++||||||||||||||||||||||||||||
1381 TAGATTGGAAGGATTCGAGCGTGGAGGGGTTTGTTAAGTAGGGTATTGTTTTTAGTTAGT
1441 CTGTGCCCTTCTCAGCACTGGGACCCACGGAGAAGCCGGGCATCGAGATTGGTAAAGTGC
||||||||||||||||++||||||++||||++||||||||||||||
1441 TTGTGTTTTTTTTAGTATTGGGATTTACGGAGAAGTCGGGTATCGAGATTGGTAAAGTGT
1501 CACCTCCCATCCCGGGTGTAGGCAAGCAGCTGCCTCCAAGCTATGGGACATACCCAAGTC
||||++|||||||||||||||||||||||||||||||||
1501 TATTTTTTATTTCGGGTGTAGGTAAGTAGTTGTTTTTAAGTTATGGGATATATTTAAGTT
1561 CTACACCTCTGGGTCCTGGGTCGACAAGCTCCCTGGAAAGGAGGAAGGAAGGCAGCTTGC
||||||||||||||++|||||||||||||||||||||||||||||
1561 TTATATTTTTGGGTTTTGGGTCGATAAGTTTTTTGGAAAGGAGGAAGGAAGGTAGTTTGT
1621 CCAGGCCCAGTGCAGGCCTGCCAAGTCGACAGAGGCCCACCCTGCTGCCCGCCACAGGCA
||||||||||||||||++|||||||||||++|||||
1621 TTAGGTTTAGTGTAGGTTTGTTAAGTCGATAGAGGTTTATTTTGTTGTTCGTTATAGGTA
1681 GCACCCCCCAGCCAGGCTCCTCACAACAGATTCAGCAGAGGATTTCCGTACCGCCAAGTC
||||||||||||||||||||||||||||++||++||||
1681 GTATTTTTTAGTTAGGTTTTTTATAATAGATTTAGTAGAGGATTTTCGTATCGTTAAGTT
1741 CCACGTACCCGCCAGCGGGACCACCTGCATTTCCAGCTGGGGACAGCAAGCCTGAACTCC
|++||++||++||||||||||||||||||||||||||||
1741 TTACGTATTCGTTAGCGGGATTATTTGTATTTTTAGTTGGGGATAGTAAGTTTGAATTTT
1801 CACTGACAGTGGCCATTAGGCCTTTCCTGGCTGATAAAGGGTCAAGGCCACAGTCTCCCA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1801 TATTGATAGTGGTTATTAGGTTTTTTTTGGTTGATAAAGGGTTAAGGTTATAGTTTTTTA
1861 GGAAAGGACCCCAGACAGTGAATTCAAGTTCCATATACTCCATGTACCTCCAGCAAGCCA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1861 GGAAAGGATTTTAGATAGTGAATTTAAGTTTTATATATTTTATGTATTTTTAGTAAGTTA
1921 CACCACCTAAGAATTACCAGCCGGCAGCACACAGCGCCTTAAATAAGTCAGTTAAAGCAG
|||||||||||||++|||||||++||||||||||||||||||||
1921 TATTATTTAAGAATTATTAGTCGGTAGTATATAGCGTTTTAAATAAGTTAGTTAAAGTAG
第三军医学硕士学位文
38
1981 TGTATGGTAAGCCCGTTTTACCTTCGGGTTCAACCTCTCCATCGCCGCTGCCGTTTCTTC
|||||||||||++|||||||++||||||||||++++||++|||||
1981 TGTATGGTAAGTTCGTTTTATTTTCGGGTTTAATTTTTTTATCGTCGTTGTCGTTTTTTT
2041 ACGGGTCACTGTCCACGGGCACACCACAGCCTCAGCCACCTTCAGAAAGTACTGAGAAAG
|++||||||||++|||||||||||||||||||||||||||||
2041 ACGGGTTATTGTTTACGGGTATATTATAGTTTTAGTTATTTTTAGAAAGTATTGAGAAAG
2101 AGCCTGAGCAGGATGGCCCCGCCGCCCCCGCAGATGGCAGCACCGTGGAGAGCCTGCCAC
|||||||||||||++++++|||||||||++||||||||||+
2101 AGTTTGAGTAGGATGGTTTCGTCGTTTTCGTAGATGGTAGTATCGTGGAGAGTTTGTTAC
2161 GGCCACTCAGCCCCACCAAGCTCACGCCCATCGTGCATTCGCCACTGCGCTACCAGAGTG
+|||||||||||++||++|||||++|||++||||||||
2161 GGTTATTTAGTTTTATTAAGTTTACGTTTATCGTGTATTCGTTATTGCGTTATTAGAGTG
2221 ATGCAGACCTGGAGGCCCTCCGCAGGAAGCTGGCCAACGCGCCCCGGCCCCTGAAAAAGC
|||||||||||||++|||||||||||++++++|||||||||+
2221 ATGTAGATTTGGAGGTTTTTCGTAGGAAGTTGGTTAACGCGTTTCGGTTTTTGAAAAAGC
2281 GCAGCTCCATCACAGAGCCCGAGGGCCCCGGCGGGCCCAACATCCAGAAGCTGCTGTACC
+||||||||||++||||++|++|||||||||||||||||
2281 GTAGTTTTATTATAGAGTTCGAGGGTTTCGGCGGGTTTAATATTTAGAAGTTGTTGTATT
2341 AGCGCTTCAACACCCTGGCCGGTGGCATGGAGGGCACCCCTTTCTACCAGCCCAGCCCCT
||++||||||||++|||||||||||||||||||||||
2341 AGCGTTTTAATATTTTGGTCGGTGGTATGGAGGGTATTTTTTTTTATTAGTTTAGTTTTT
2401 CCCAGGACTTCATGGGCACCTTGGCCGATGTGGACAATGGAAACACCAATGCCAATGGAA
||||||||||||||||++|||||||||||||||||||||||||||
2401 TTTAGGATTTTATGGGTATTTTGGTCGATGTGGATAATGGAAATATTAATGTTAATGGAA
2461 ACCTGGAAGAGCTCCCCCCTGCCCAGCCCACAGCCCCACTCCCCGCTGAGCCTGCCCCGT
|||||||||||||||||||++||||||++|
2461 ATTTGGAAGAGTTTTTTTTTGTTTAGTTTATAGTTTTATTTTTCGTTGAGTTTGTTTCGT
2521 CATCAGATGCCAATGATAATGAGTTACCTTCCCCCGAACCAGAGGAGCTCATCTGTCCCC
||||||||||||||||||||||||++|||||||||||||||
2521 TATTAGATGTTAATGATAATGAGTTATTTTTTTTCGAATTAGAGGAGTTTATTTGTTTTT
2581 AAACCACCCACCAAACTGCCGAGCCGGCAGAGGACAATAACAACAACGTGGCCACGGTCC
||||||||||++||++||||||||||||||||++||||++||
2581 AAATTATTTATTAAATTGTCGAGTCGGTAGAGGATAATAATAATAACGTGGTTACGGTTT
第三军医学硕士学位文
39
2641 CCACCACGGAGCAGATCCCGAGTCCTGTGGCTGAGGCCCCATCTCCAGGGGAAGAGCAGG
||++|||||||++|||||||||||||||||||||||||||||
2641 TTATTACGGAGTAGATTTCGAGTTTTGTGGTTGAGGTTTTATTTTTAGGGGAAGAGTAGG
2701 TCCCTCCAGCACCTCTTCCCCCTGCCAGCCACCCTCCTGCCACCTCCACGAACAAGCGGA
|||||||||||||||||||++|||||++||
2701 TTTTTTTAGTATTTTTTTTTTTTGTTAGTTATTTTTTTGTTATTTTTACGAATAAGCGGA
2761 CCAACTTGAAGAAGCCCAACTCGGAGCGGACGGGGCACGGGCTGAGAGTCCGGTTTAACC
||||||||||||||++|||++||++||||++|||||||||++||||||
2761 TTAATTTGAAGAAGTTTAATTCGGAGCGGACGGGGTACGGGTTGAGAGTTCGGTTTAATT
2821 CCCTGGCACTGCTCCTAGACGCGTCTCTGGAAGGAGAGTTCGATCTGGTGCAGAGGATCA
|||||||||||++++|||||||||||||||++|||||||||||||||
2821 TTTTGGTATTGTTTTTAGACGCGTTTTTGGAAGGAGAGTTCGATTTGGTGTAGAGGATTA
2881 TCTATGAGGTGGAAGATCCCAGCAAGCCCAACGATGAAGGGATCACCCCACTGCACAACG
|||||||||||||||||||||||++|||||||||||||||||++
2881 TTTATGAGGTGGAAGATTTTAGTAAGTTTAACGATGAAGGGATTATTTTATTGTATAACG
2941 CCGTCTGCGCCGGCCACCATCACATCGTGAAGTTCCTGCTGGATTTTGGTGTCAACGTGA
++|||++++|||||||++||||||||||||||||||||||||++|||
2941 TCGTTTGCGTCGGTTATTATTATATCGTGAAGTTTTTGTTGGATTTTGGTGTTAACGTGA
3001 ATGCTGCTGATAGTGATGGATGGACGCCGCTGCACTGCGCTGCCTCTTGTAACAGCGTTC
||||||||||||||||||||||++++|||||++|||||||||||++||
3001 ATGTTGTTGATAGTGATGGATGGACGTCGTTGTATTGCGTTGTTTTTTGTAATAGCGTTT
3061 ACCTCTGCAAACAGCTGGTGGAGAGTGGTGCCGCCATTTTTGCCTCAACCATAAGCGACA
||||||||||||||||||||||||++|||||||||||||||++||
3061 ATTTTTGTAAATAGTTGGTGGAGAGTGGTGTCGTTATTTTTGTTTTAATTATAAGCGATA
3121 TTGAAACTGCTGCAGACAAGTGTGAGGAGATGGAGGAAGGCTACATCCAGTGCTCCCAGT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3121 TTGAAATTGTTGTAGATAAGTGTGAGGAGATGGAGGAAGGTTATATTTAGTGTTTTTAGT
3181 TTCTATATGGGGTGCAGGAAAAGCTGGGTGTGATGAACAAAGGTGTGGCGTATGCTCTGT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||++||||||||
3181 TTTTATATGGGGTGTAGGAAAAGTTGGGTGTGATGAATAAAGGTGTGGCGTATGTTTTGT
3241 GGGACTACGAGGCCCAGAACAGTGACGAGCTGTCCTTCCACGAAGGGGACGCCCTCACCA
||||||++||||||||||||++||||||||++|||||||++|||
3241 GGGATTACGAGGTTTAGAATAGTGACGAGTTGTTTTTTTACGAAGGGGACGTTTTTATTA
第三军医学硕士学位文
40
3301 TCCTGAGGCGCAAGGACGAAAGCGAGACTGAGTGGTGGTGGGCTCGCCTTGGAGACCGGG
||||||++|||||++||||++||||||||||||||||||++|||||||++||
3301 TTTTGAGGCGTAAGGACGAAAGCGAGATTGAGTGGTGGTGGGTTCGTTTTGGAGATCGGG
3361 AGGGCTATGTGCCCAAAAACCTGCTGGGGCTGTATCCACGGATCAAACCCCGACAGCGAA
||||||||||||||||||||||||||||++||||||++|||++||
3361 AGGGTTATGTGTTTAAAAATTTGTTGGGGTTGTATTTACGGATTAAATTTCGATAGCGAA
3421 CACTCGCCTGAACTTCCTTTTGGAGCACCGCATGGTCTTGCCAGCTACCAGGAGCCACTT
||++|||||||||||||||++||||||||||||||||||||
3421 TATTCGTTTGAATTTTTTTTTGGAGTATCGTATGGTTTTGTTAGTTATTAGGAGTTATTT
3481 AAGAGATTATTGTGCTGTTTTCCAGGAAAGCTGCAGCTAGAAAATGGTCTTAATGGTGCT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3481 AAGAGATTATTGTGTTGTTTTTTAGGAAAGTTGTAGTTAGAAAATGGTTTTAATGGTGTT
3541 CACTTTAGCAGACAGCGTCCACAATGTGAATCCTACAGTTTCCAGGTGAGGCCCTTTCTC
|||||||||||++||||||||||||||||||||||||||||||
3541 TATTTTAGTAGATAGCGTTTATAATGTGAATTTTATAGTTTTTAGGTGAGGTTTTTTTTT
3601 CAGTTTGCCCATTAACTGGGAGAGGTACTTTCGCCTCCAAGGACTGAATTTTGCCAATTA
|||||||||||||||||||||||||++||||||||||||||||||||
3601 TAGTTTGTTTATTAATTGGGAGAGGTATTTTCGTTTTTAAGGATTGAATTTTGTTAATTA
3661 CTATAAATCCAAATAAATACCCACTTTCAAAACACCCACCCCTCTTGCCATTAAGAAGTC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3661 TTATAAATTTAAATAAATATTTATTTTTAAAATATTTATTTTTTTTGTTATTAAGAAGTT
3721 CCATAACCCCCGGTTGGTTGCCAGTGAAGACAGAAGCTCTTACTGACTTGGCCCCGAGGC
||||++||||||||||||||||||||||||||||||||++|||
3721 TTATAATTTTCGGTTGGTTGTTAGTGAAGATAGAAGTTTTTATTGATTTGGTTTCGAGGT
第三军医学硕士学位文
41
ASPP2 MethPrimer result
Sequence Name ASPP2
Sequence Length 3180
CpG island prediction results
Criteria used Island size > 100 GC Percent > 400 ObsExp > 060
3 CpG island(s) were found in your sequence
Size (Start End)
Island 1 260 bp (47 306)
Island 2 168 bp (358 525)
Island 3 138 bp (2329 2466)
第三军医学硕士学位文
42
1 GTCACGAGCGTCGAAGAGACAAAGCCGCGTCAGGGGGCCCGGCCGGGGCGGGGGAGCCCG
|||++||++|++||||||||||++++|||||||++|++|||++||||||++
1 GTTACGAGCGTCGAAGAGATAAAGTCGCGTTAGGGGGTTCGGTCGGGGCGGGGGAGTTCG
61 GGGCTTGTTGGTGCCCCAGCCCGCGCGGAGGGCCCTTCGGACCCGCGCGCCGCCGCTGCC
||||||||||||||++++++|||||||++||++++++++++||+
61 GGGTTTGTTGGTGTTTTAGTTCGCGCGGAGGGTTTTTCGGATTCGCGCGTCGTCGTTGTC
121 GCCGCCGCCGCCTCGCAACAGGTCCGGGCGGCCTCGCTCTCCGCTCCCCTCCCCCGCATC
+++++++|++||||||++||++||++||++||++||
121 GTCGTCGTCGTTTCGTAATAGGTTCGGGCGGTTTCGTTTTTCGTTTTTTTTTTTCGTATT
181 CGCGACCCTCCGGGGCACCTCAGCTCGGCCGGGGCCGCAGTCTGGCCACCCGCTTCCATG
++++||++||||||||++|++|||++|||||||++|||||
181 CGCGATTTTTCGGGGTATTTTAGTTCGGTCGGGGTCGTAGTTTGGTTATTCGTTTTTATG
241 CGGTTCGGGTCCAAGATGATGCCGATGTTTCTTACCGTGTATCTCAGTAACAATGAGCAG
++|||++||||||||||||++|||||||||++|||||||||||||||||||
241 CGGTTCGGGTTTAAGATGATGTCGATGTTTTTTATCGTGTATTTTAGTAATAATGAGTAG
301 CACTTCACAGAAGTTCCAGTTACTCCAGAAACAATATGCAGAGACGTGGTGGATCTGTGC
|||||||||||||||||||||||||||||||||++||||||||||||
301 TATTTTATAGAAGTTTTAGTTATTTTAGAAATAATATGTAGAGACGTGGTGGATTTGTGT
361 AAAGAACCCGGCGAGAGTGATTGCCATTTGGCTGAAGTGTGGTGTGGCTCTGAACGTCCA
||||||++|++||||||||||||||||||||||||||||||||||||++||
361 AAAGAATTCGGCGAGAGTGATTGTTATTTGGTTGAAGTGTGGTGTGGTTTTGAACGTTTA
421 GTTGCGGATAATGAGCGAATGTTTGATGTTCTTCAACGATTTGGAAGTCAGAGGAACGAA
||||++|||||||||++|||||||||||||||||++|||||||||||||||||++||
421 GTTGCGGATAATGAGCGAATGTTTGATGTTTTTTAACGATTTGGAAGTTAGAGGAACGAA
481 GTTCGCTTCTTCCTTCGTCATGAACGCCCCCCTGGCAGGGACATTGTGAGTGGACCAAGA
|||++||||||++||||||++||||||||||||||||||||||||
481 GTTCGTTTTTTTTTTCGTTATGAACGTTTTTTTGGTAGGGATATTGTGAGTGGATTAAGA
541 TCTCAGGATCCAAGTTTAAAAAGAAATGGTGTAAAAGTTCCTGGTGAATATCGAAGAAAG
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||++|||||||
541 TTTTAGGATTTAAGTTTAAAAAGAAATGGTGTAAAAGTTTTTGGTGAATATCGAAGAAAG
601 GAGAACGGTGTTAATAGTCCTAGGATGGATCTGACTCTTGCTGAACTTCAGGAAATGGCA
|||||++||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
601 GAGAACGGTGTTAATAGTTTTAGGATGGATTTGATTTTTGTTGAATTTTAGGAAATGGTA
第三军医学硕士学位文
43
661 TCTCGCCAGCAGCAACAGATTGAAGCCCAGCAACAATTGCTGGCAACTAAGGAACAGCGC
||++||||||||||||||||||||||||||||||||||||||++
661 TTTCGTTAGTAGTAATAGATTGAAGTTTAGTAATAATTGTTGGTAATTAAGGAATAGCGT
721 TTAAAGTTTTTGAAACAACAAGATCAGCGACAACAGCAACAAGTTGCTGAGCAGGAGAAA
||||||||||||||||||||||||++|||||||||||||||||||||||||
721 TTAAAGTTTTTGAAATAATAAGATTAGCGATAATAGTAATAAGTTGTTGAGTAGGAGAAA
781 CTTAAAAGGCTAAAAGAAATAGCTGAGAATCAGGAAGCTAAGCTAAAAAAAGTGAGAGCA
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
781 TTTAAAAGGTTAAAAGAAATAGTTGAGAATTAGGAAGTTAAGTTAAAAAAAGTGAGAGTA
841 CTTAAAGGCCACGTGGAACAGAAGAGACTAAGCAATGGGAAACTTGTGGAGGAAATTGAA
||||||||++|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
841 TTTAAAGGTTACGTGGAATAGAAGAGATTAAGTAATGGGAAATTTGTGGAGGAAATTGAA
901 CAGATGAATAATTTGTTCCAGCAAAAACAGAGGGAGCTCGTCCTGGCTGTGTCAAAAGTA
||||||||||||||||||||||||||||||||++||||||||||||||||
901 TAGATGAATAATTTGTTTTAGTAAAAATAGAGGGAGTTCGTTTTGGTTGTGTTAAAAGTA
961 GAAGAACTGACCAGGCAGCTAGAGATGCTCAAGAACGGCAGGATCGACAGCCACCATGAC
||||||||||||||||||||||||||||++||||||++||||||||
961 GAAGAATTGATTAGGTAGTTAGAGATGTTTAAGAACGGTAGGATCGATAGTTATTATGAT
1021 AATCAGTCTGCAGTGGCTGAGCTTGATCGCCTCTATAAGGAGCTGCAGCTAAGAAACAAA
||||||||||||||||||||||++||||||||||||||||||||||||
1021 AATTAGTTTGTAGTGGTTGAGTTTGATCGTTTTTATAAGGAGTTGTAGTTAAGAAATAAA
1081 TTGAATCAAGAGCAGAATGCCAAGCTACAACAACAGAGGGAGTGTTTGAATAAGCGTAAT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||++||||
1081 TTGAATTAAGAGTAGAATGTTAAGTTATAATAATAGAGGGAGTGTTTGAATAAGCGTAAT
1141 TCAGAAGTGGCAGTCATGGATAAGCGTGTTAATGAGCTGAGGGACCGGCTGTGGAAGAAG
|||||||||||||||||||||++|||||||||||||||||++||||||||||||
1141 TTAGAAGTGGTAGTTATGGATAAGCGTGTTAATGAGTTGAGGGATCGGTTGTGGAAGAAG
1201 AAGGCAGCTCTACAGCAAAAAGAAAATCTACCAGTTTCATCTGATGGAAATCTTCCCCAG
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1201 AAGGTAGTTTTATAGTAAAAAGAAAATTTATTAGTTTTATTTGATGGAAATTTTTTTTAG
1261 CAAGCCGCGTCAGCCCCAAGCCGTGTGGCTGCAGTAGGTCCCTATATCCAGTCGTCTACT
|||++++||||||++||||||||||||||||||||||++||||
1261 TAAGTCGCGTTAGTTTTAAGTCGTGTGGTTGTAGTAGGTTTTTATATTTAGTCGTTTATT
第三军医学硕士学位文
44
1321 ATGCCTCGGATGCCCTCAAGGCCTGAATTGCTGGTGAAGCCAGCCCTGCCGGATGGTTCC
||||++||||||||||||||||||||||||||||++|||||||
1321 ATGTTTCGGATGTTTTTAAGGTTTGAATTGTTGGTGAAGTTAGTTTTGTCGGATGGTTTT
1381 TTGGTCATTCAGGCTTCAGAGGGGCCGATGAAAATACAGACACTGCCCAACATGAGATCT
||||||||||||||||||||++|||||||||||||||||||||||||
1381 TTGGTTATTTAGGTTTTAGAGGGGTCGATGAAAATATAGATATTGTTTAATATGAGATTT
1441 GGGGCTGCTTCACAAACTAAAGGCTCTAAAATCCATCCAGTTGGCCCTGATTGGAGTCCT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1441 GGGGTTGTTTTATAAATTAAAGGTTTTAAAATTTATTTAGTTGGTTTTGATTGGAGTTTT
1501 TCAAATGCAGATCTTTTCCCAAGCCAAGGCTCTGCTTCTGTACCTCAAAGCACTGGGAAT
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1501 TTAAATGTAGATTTTTTTTTAAGTTAAGGTTTTGTTTTTGTATTTTAAAGTATTGGGAAT
1561 GCTCTGGATCAAGTTGATGATGGAGAGGTTCCGCTGAGGGAGAAAGAGAAGAAAGTGCGT
|||||||||||||||||||||||||||++|||||||||||||||||||||||++|
1561 GTTTTGGATTAAGTTGATGATGGAGAGGTTTCGTTGAGGGAGAAAGAGAAGAAAGTGCGT
1621 CCGTTCTCAATGTTTGATGCAGTAGACCAGTCCAATGCCCCACCTTCCTTTGGTACTCTG
++||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1621 TCGTTTTTAATGTTTGATGTAGTAGATTAGTTTAATGTTTTATTTTTTTTTGGTATTTTG
1681 AGGAAGAACCAGAGCAGTGAAGATATCTTGCGGGATGCTCAGGTTGCAAATAAAAATGTG
||||||||||||||||||||||||||++|||||||||||||||||||||||||
1681 AGGAAGAATTAGAGTAGTGAAGATATTTTGCGGGATGTTTAGGTTGTAAATAAAAATGTG
1741 GCTAAAGTACCACCTCCTGTTCCTACAAAACCAAAACAGATTAATTTGCCTTATTTTGGA
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1741 GTTAAAGTATTATTTTTTGTTTTTATAAAATTAAAATAGATTAATTTGTTTTATTTTGGA
1801 CAAACTAATCAGCCACCTTCAGACATTAAGCCAGACGGAAGTTCTCAGCAGTTGTCAACA
||||||||||||||||||||||||++||||||||||||||||||
1801 TAAATTAATTAGTTATTTTTAGATATTAAGTTAGACGGAAGTTTTTAGTAGTTGTTAATA
1861 GTTGTTCCGTCCATGGGAACTAAACCAAAACCAGCAGGGCAGCAGCCGAGAGTGCTGCTA
||||||++||||||||||||||||||||||||||++||||||||||
1861 GTTGTTTCGTTTATGGGAATTAAATTAAAATTAGTAGGGTAGTAGTCGAGAGTGTTGTTA
1921 TCTCCCAGCATACCTTCGGTTGGCCAAGACCAGACCCTTTCTCCAGGTTCTAAGCAAGAA
|||||||||++||||||||||||||||||||||||||||||
1921 TTTTTTAGTATATTTTCGGTTGGTTAAGATTAGATTTTTTTTTTAGGTTTTAAGTAAGAA
第三军医学硕士学位文
45
1981 AGTCCACCTGCTGCTGCCGTCCGGCCCTTTACTCCCCAGCCTTCCAAAGACACCTTACTT
||||||||||++|++|||||||||||||||||||||
1981 AGTTTATTTGTTGTTGTCGTTCGGTTTTTTATTTTTTAGTTTTTTAAAGATATTTTATTT
2041 CCACCCTTCAGAAAACCCCAGACCGTGGCAGCAAGTTCAATATATTCCATGTATACGCAA
||||||||||||++|||||||||||||||||||||||||++||
2041 TTATTTTTTAGAAAATTTTAGATCGTGGTAGTAAGTTTAATATATTTTATGTATACGTAA
2101 CAGCAGGCGCCAGGAAAAAACTTCCAGCAGGCTGTGCAGAGCGCGTTGACCAAGACTCAT
|||||++||||||||||||||||||||||||++++|||||||||||
2101 TAGTAGGCGTTAGGAAAAAATTTTTAGTAGGTTGTGTAGAGCGCGTTGATTAAGATTTAT
2161 ACCAGAGGGCCACACTTTTCAAGTGTATATGGTAAGCCTGTAATTGCTGCTGCCCAGAAT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2161 ATTAGAGGGTTATATTTTTTAAGTGTATATGGTAAGTTTGTAATTGTTGTTGTTTAGAAT
2221 CAACAGCAGCACCCAGAGAACATTTATTCCAATAGCCAGGGCAAGCCTGGCAGTCCAGAA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2221 TAATAGTAGTATTTAGAGAATATTTATTTTAATAGTTAGGGTAAGTTTGGTAGTTTAGAA
2281 CCTGAAACAGAGCCTGTTTCTTCAGTTCAGGAGAACCATGAAAACGAAAGAATTCCTCGG
||||||||||||||||||||||||||||||||||++|||||||||++|
2281 TTTGAAATAGAGTTTGTTTTTTTAGTTTAGGAGAATTATGAAAACGAAAGAATTTTTCGG
2341 CCACTCAGCCCAACTAAATTACTGCCTTTCTTATCTAATCCTTACCGAAACCAGAGTGAT
|||||||||||||||||||||||||||||++|||||||||||
2341 TTATTTAGTTTAATTAAATTATTGTTTTTTTTATTTAATTTTTATCGAAATTAGAGTGAT
2401 GCTGACCTAGAAGCCTTACGAAAGAAACTGTCTAACGCACCAAGGCCTCTAAAGAAACGT
|||||||||||||++|||||||||||||++||||||||||||||++|
2401 GTTGATTTAGAAGTTTTACGAAAGAAATTGTTTAACGTATTAAGGTTTTTAAAGAAACGT
2461 AGTTCTATTACAGAGCCAGAGGGTCCTAATGGGCCAAATATTCAGAAGCTTTTATATCAG
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2461 AGTTTTATTATAGAGTTAGAGGGTTTTAATGGGTTAAATATTTAGAAGTTTTTATATTAG
2521 AGGACCACCATAGCGGCCATGGAGACCATCTCTGTCCCATCATACCCATCCAAGTCAGCT
|||||||||++||||||||||||||||||||||||||||
2521 AGGATTATTATAGCGGTTATGGAGATTATTTTTGTTTTATTATATTTATTTAAGTTAGTT
2581 TCTGTGACTGCCAGCTCAGAAAGCCCAGTAGAAATCCAGAATCCATATTTACATGTGGAG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2581 TTTGTGATTGTTAGTTTAGAAAGTTTAGTAGAAATTTAGAATTTATATTTATATGTGGAG
第三军医学硕士学位文
46
2641 CCCGAAAAGGAGGTGGTCTCTCTGGTTCCTGAATCATTGTCCCCAGAGGATGTGGGGAAT
++||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2641 TTCGAAAAGGAGGTGGTTTTTTTGGTTTTTGAATTATTGTTTTTAGAGGATGTGGGGAAT
2701 GCCAGTACAGAGAACAGTGACATGCCAGCTCCTTCTCCAGGCCTTGATTATGAGCCTGAG
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2701 GTTAGTATAGAGAATAGTGATATGTTAGTTTTTTTTTTAGGTTTTGATTATGAGTTTGAG
2761 GGAGTCCCAGACAACAGCCCAAATCTCCAGAATAACCCAGAAGAACCAAATCCAGAGGCT
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2761 GGAGTTTTAGATAATAGTTTAAATTTTTAGAATAATTTAGAAGAATTAAATTTAGAGGTT
2821 CCACATGTGCTTGATGTGTACCTGGAGGAGTACCCTCCATACCCACCCCCACCATACCCA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2821 TTATATGTGTTTGATGTGTATTTGGAGGAGTATTTTTTATATTTATTTTTATTATATTTA
2881 TCTGGGGAGCCTGAAGGGCCCGGAGAAGACTCGGTGAGCATGCGCCCGCCTGAAATCACC
|||||||||||||||++||||||||++||||||||++++|||||||+
2881 TTTGGGGAGTTTGAAGGGTTCGGAGAAGATTCGGTGAGTATGCGTTCGTTTGAAATTATC
2941 GGGCAGGTCTCTCTGCCTCCTGGTAAAAGGACAAACTTGCGTAAAACTGGCTCAGAGCGT
+||||||||||||||||||||||||||||++|||||||||||||++|
2941 GGGTAGGTTTTTTTGTTTTTTGGTAAAAGGATAAATTTGCGTAAAATTGGTTTAGAGCGT
3001 ATCGCTCATGGAATGAGGGTGAAATTCAACCCCCTTGCTTTACTGCTAGATTCGTCTTTG
||++|||||||||||||||||||||||||||||||||||||++|||||
3001 ATCGTTTATGGAATGAGGGTGAAATTTAATTTTTTTGTTTTATTGTTAGATTCGTTTTTG
3061 GAGGGAGAATTTGACCTTGTACAGAGAATTATTTATGAGGTTGATGACCCAAGCCTCCCC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3061 GAGGGAGAATTTGATTTTGTATAGAGAATTATTTATGAGGTTGATGATTTAAGTTTTTTT
3121 AATGATGAAGGCATCACGGCTCTTCACAATGCTGTGTGTGCAGGCCACACAGAAATCGTT
||||||||||||||++||||||||||||||||||||||||||||++||
3121 AATGATGAAGGTATTACGGTTTTTTATAATGTTGTGTGTGTAGGTTATATAGAAATCGTT
第三军医学硕士学位文
47
二 MSP 引物设计结果
ASPP1 ASPP2 基线软件 MSP34 设计 MSP 引物处第
CpG 岛中 引物序列达实验求 具体结果见 table 7
三 A549 K562 HEPG2 成纤维细胞 MSP 扩增结果
p53 野生型肿瘤细胞株 A549 K562 HEPG2 中 ASPP1 ASPP2 基甲基
化引物扩增产物 非甲基化引物没甲基化扩增产物 成纤维细胞中 ASPP1
ASPP2 基甲基化引物没扩增产物 非甲基化引物甲基化扩增产物(见片 11 12
13 14)
讨
基外遗传调控
拥相 DNA 甚常常样成长环境 完全相卵双生子
时显示出巨差 直遗传学家感困惑问题 目前 研究者认
改变 DNA 序列 称基外遗传学改变某基组细微修饰
关 认样解释遗传学完全相孪生子间存差异
基调控水发生 DNA 折叠 DNA 转录成 RNA RNA 翻译成蛋
白翻译发生加工程 DNA 甲基化精确调控方法 种遗传中
获 DNA 发生化学变化生性调控程 体细胞均携带构成
身体需全部成分编码基 中仅少部分处活跃表达状态 基
外遗传学修饰作开关样 协助控制基活性 保证特定类型
细胞中确需基处开启状态 细胞中特定基活性状态
信息储存细胞分裂时传递代
DNA 甲基化中熟知基外遗传信号 甲基基团构
成遗传密码四化学碱基胞嘧啶进行修饰 必须遵守规律
DNA 甲基化基表达沉默相关 处活跃表达中基通常处
未甲基化状态 DNA 甲基化容易导致基突变 DNA 链中 5甲基胞嘧啶
氨基团欠稳定 易发生发性水解 脱氨基转换 T 形成 T G 错配 5甲基胞
嘧啶胞嘧啶相更欠稳定性 样容易造成基甲基化位点点突变[38] 5mC 脱
氨基作产生点突变原[39] 时 DNA 甲基化导致某区域
DNA 构变化 影响蛋白质 DNA 相互作 抑制转录子启动区 DNA
第三军医学硕士学位文
48
结合效率
启动子区 DNA 分子甲基密度抑制基转录关键素 5甲基胞
嘧啶 DNA 分布机 基 5’端 3’端般较丰富 弱启
动子说 稀少甲基化完全失转录活性 类启动子增强时(带
增强子) 甲基化恢复转录活性 甲基化转录抑制强度甲
基 CpG 结合蛋白 1(methylCpGbinding protein 1 MeCP1)结合 DNA 力成正相关
甲基化 CpG 密度启动子强度间衡决定该启动子否具转录活性
基表达调控程系列核酸蛋白质相互作结果 DNA 甲基化甲
基化改变核酸分子构 导致某基隐蔽外基暴露 增强削
弱 DNA 蛋白质子结合 终影响基表达调控
二 基外遗传疾病
年中 科研员发现 某突变基处罕见特殊环
境中 通影响基组部位基外遗传学修饰发挥作 例
名 MECP2 基影响染色质重塑 出生时便携带突变 MECP2 基
孩子会逐渐丧失语言行走力 携带种突变形式 DNA 甲基化酶基患
者饱受免疫系统缺陷面部畸形折磨 外 种称 ATRX 基
果发生突变会导致智力迟钝 泌尿生殖器发育异常种贫血 明显染色
质结构 DNA 甲基化双重改变造成
肿瘤学家中 基外遗传学改变导致某肿瘤性疾病发生问题早已
达成识 家普遍认 基外遗传学改变癌症病学中占相重
位 早二十年前 约翰·霍普金斯学遗传学家首先研究发现 癌细胞中
确实存独特 DNA 甲基化模式 类似癌细胞中存基外遗传学
异常报道数量日俱增 研究发现种肿瘤基组中 肿瘤细胞 DNA 存
广泛低甲基化局部区域高甲基化存现 总甲基化力增高 意义
细胞生长分化密切关系癌基抗癌基 肿瘤细胞非 CpG 岛普遍性低
甲基化 肿瘤细胞中染色体 11P 短臂 17PCpG 岛 3PCpG 岛出现区域高甲基化
抑癌基高甲基化 肿瘤早期出现症状前 肿瘤中基组甲基化程度普遍
降低 Cmyc raf Cfos CHras CKras 等基 时肿瘤中特异癌基低甲
基化 肠癌中 CKras 基 Cmyc 基第三外显子低度甲基化 正常
细胞中完全甲基化 肿瘤细胞中抑癌基启动子区高甲基化 抑制抑
癌基转录 抑癌基失活 癌基充分甲基化导致基重新开放异
第三军医学硕士学位文
49
常表达 抑癌基度甲基化形成基突变靶点 Maria S Seongas[40]等报
告 1 例利甲基化程关闭 Apaf1 基(正常情况该基会导致细胞凋亡)转移性
黑素瘤 该基关闭时 肿瘤细胞化疗起反应存活发生转移
基组学研究吸引力已医学遗传学家注意集中 DNA 序
列邻结构 类基组计划实施重成果绘制获百
万单核苷酸态性(SNP)图谱 存体间基序列遗传密码子中
单碱基改变基组中位置 通观测单核苷酸态性常见病症
疑难病症连锁遗传 确定导致某特定疾病易感基位置 然
迄止 通单核苷酸态性基础建立方法未预期研究结果
导致研究者开始怀疑序列突变否致病素
诸生活方式 饮食惯等素疑会影响疾病易感性
便推测述素肯定会基组遗留微量基外遗传学痕迹
助解释什许疾病总进入老年发病 年龄增长时 DNA
甲基化等化学修饰改变断积累
目前 种称 azacitidine 抑制 DNA 甲基化药物已癌症患者中进
行实验性治疗 种药物加选择作整基组 研究
确认精神病 糖尿病疾病相关修饰 需进行更特异治疗
疑挑战 非克服 相信久 相应特异性药物出现
患者带希
三 MSP 甲基化检测实验原理
DNA 甲基化常常发生启动子 CpG 岛 甲基转移酶介导甲基转移 CpG 岛
胞嘧啶 形成甲基化胞嘧啶(5’MC) 常规克隆 PCR 等方法检测甲基化
位点相困难 DNA 扩增程中 甲基化信号消失 利甲基化敏感性限制
性核酸切酶消化 DNA 形成核酸片段 Southern 斑点法检测甲基化位点
酶消化完全造成假阳性假阴性结果 现 常方法亚
硫酸氢盐法 亚硫酸氢盐修饰 DNA 作模板 甲基化非甲基化差异利 PCR
检测出 PCR 产物进行测序 知道发生甲基化位点 样产生种
PCR 例 MSP[12] 甲基化敏感性单核苷引物延伸发(methylationsensitive single
nucleotide primer extension MsSNuPE)[41] 限制性核酸切酶法[42]等方法 方
法分析少数发生甲基化位点 方法利熔化温度差异 利
DGGE[43] DHPLC[44]分析
第三军医学硕士学位文
50
Fig 6 Example of direct DNA sequencing results of methylated and unmethylated bands
Cytosine residues outside of the CpG sites were converted to thymine after bisulfite treatment and PCR
CpG dinucleotides are underlined (A) Original sequence Before bisulfite treatment (B) Unmethylated
allele All cytosine were deaminated and converted to thymine (C) Methylated allele All cytosine
residues at CpG sites remained unchanged although other cytosines were converted to thymine
现广泛甲基化检测方法 MSP[12] MSP 检测剂量 DNA 甲基化状态
种新技术 具高敏感性 检测原理 亚硫酸氢盐选择性胞嘧啶变
尿嘧啶 甲基化胞嘧啶发生变化 利种甲基化非甲基化变化差异
亚硫酸氢盐处理 DNA 作模板 利特异性引物作 PCR 扩增产物通琼脂
糖电泳 DNA 测序检测基否发生甲基化 MSP 扩增否成功 引物
设计坏起着关重作 MSP 引物设计 普通 PCR 引物设计
考虑引物特异性包含容易发生甲基化变化 CpG 序列 MSP 引物
设计包括 3 组引物 野生型(W) 甲基化型(M) 非甲基化型(U) 中 W
没亚硫酸氢盐修饰 DNA 进行扩增 检验该基否存发生改变
作阳性 M U 亚硫酸氢盐修饰 DNA 进行扩增 判断甲基化
情况 该方法特点 避免限制性酶消化完全带假性结果 灵敏
度高 微量分析源基分析 检测 CpG 仅仅局限限制性酶切位点
没假阳性结果 石蜡包埋样品分析[46]
DNA 完整性 MSP 分析重 亚硫酸氢盐修饰 DNA 程 NaOH
处理形成 DNA 单链进行修饰[41] 果修饰 DNA 完整 导致 MSP 失
第三军医学硕士学位文
51
败 实验程中出现 DNA 完整性较时候 DNA 电泳结果点样端出
现亮带 MSP 结果 相反 MSP 出现结果 提取 DNA 求纯度高
定量求准确 修饰 DNA 微量 果修饰前 DNA 纯定量准
修饰 DNA 极微量 导致 MSP 出现假阴性结果
四 p53 野生型肿瘤细胞株 ASPP 基启动子甲基化状态分析
肿瘤形成素 阶段 基异常累计程 年发现肿瘤
发生细胞凋亡相关性 认肿瘤细胞起源应该走凋亡
未发生正常凋亡细胞 细胞凋亡特性改变影响肿瘤发生 时会影响肿瘤
生长 肿瘤发生中两类基 癌基(oncogene)抑癌基(tumor suppressor
gene)抗癌基(oncogene)关 正常细胞增殖 分化凋亡中 原癌基起着
正调控作 促进细胞进入增殖周期 阻止细胞分化凋亡 抑癌基起着负调控作
抑制细胞进入增殖周期 诱导终末分化细胞凋亡 维持基稳定 具潜抑
制肿瘤生长功 功失活基缺失 突变导致细胞恶性转化发生肿
瘤 正常细胞 抑癌基抑制肿瘤生长发展
P53 家熟知抑癌基 野生型 p53 基细胞生长 监控器 细
胞受外引起基应激种信号刺激时 p53 蛋白修饰胞某蛋白
质结合 潜 p53 变活化 p53 DNA 受种素损伤时 活化 p53
诱导 Bax 基表达 抑制 Bcl2 癌基表达 促细胞生长停滞走细胞凋亡 ASPP
蛋白体 p53 关键调节蛋白 ASPP1 ASPP2 蛋白通提高原凋亡基活力
促进 p53 赖细胞凋亡 ASPP 蛋白家族 2001 年发现 ASPP1 ASPP2 基
否存甲基化 目前清楚
实验利 internet 网 CpG 岛分析软件 ASPP1 ASPP2 基启动子 CpG 岛
进行分析 发现 ASPP1 ASPP2 基 CpG 岛中 第 CpG 岛中 CG 含量
丰富 说明 ASPP1 ASPP2 基第 CpG 岛中更易发生甲基化
第 CpG 岛进行甲基化分析更易成功 利网免费引物设计软件
MSP34 设计 MSP 引物 引物落第 CpG 岛中 建立检测 ASPP1
ASPP2 基启动子 CpG 岛甲基化状况 MSP 方法
次试验中 利建立检测 ASPP1 ASPP2 基启动子 CpG 岛甲
基化状况 MSP 方法 检测三株 p53 野生型肿瘤细胞株(A549 MCF7 HEPG2)
株正常成纤维细胞株 检测结果发现 ASPP1 ASPP2 基三株 p53 野生
型肿瘤细胞株中处甲基化状态 成纤维细胞 ASPP1 ASPP2 基发生未甲基化
第三军医学硕士学位文
52
DNA 甲基化基表达调控种重方式 种表观性调节方式肿瘤形成程
中认基突变等遗传性改变样位 DNA 甲基化认肿
瘤诊断早期标志物[ 47 ] DNA 甲基化导致基表达失活 果发生抑癌基
肿瘤形成重性言喻 ASPP1 ASPP2 基促 p53 细胞调亡抑
癌基 甲基化状态表达定影响 推测 ASPP1 ASPP2
基否甲基化肿瘤发生关 ASPP1 ASPP2 基甲基化状态成功检测
进步研究细胞凋亡中生物学功探讨床应价值良基
础
第三军医学硕士学位文
53
全文结
1 国首次 RTPCR 扩增出 ASPP 基家族 cDNA 发现 ASPP 基家族
mRNA 肿瘤细胞株中均表达
2 通 GelPro31 凝胶图分析软件电泳图片半定量分析发现 肿瘤细胞株中
ASPP1 ASPP2 基 mRNA 表达量均低正常细胞 iASPP 基 mRNA 表达量
均高正常细胞 出结 促 p53 促细胞凋亡功中 ASPP1 ASPP2 基
正调节 iASPP 基反调节
3 首次应 internet ASPP1 ASPP2 基进行 CpG 岛分析 发现 ASPP1
ASPP2 基第 CpG 岛中 CG 序列含量丰富 表明第 CpG 岛
容易发生甲基化
4 首次应网免费引物设计软件 MSP34 设计 ASPP1 ASPP2 基 MSP 引物
建立检测 ASPP1 ASPP2 基 CpG 岛甲基化状况方法 MSP
5 首次 3 株 p53 野生型肿瘤细胞株(A549 HEPG2 MCF7)成纤维细胞中
ASPP1 ASPP2 基 CpG岛甲基化状况检测发现 3株 p53野生型肿瘤细胞株中 ASPP1
ASPP2 基 CpG 岛出现甲基化 成纤维细胞中 ASPP1 ASPP2 基 CpG 岛没出
现甲基化 结 ASPP1 ASPP2 基 CpG 岛甲基化状况肿瘤发生关
第三军医学硕士学位文
54
致 谢
课题导师刘泽军教授悉心指导支持 鼓励完成 三年导师谆谆
教诲广博学识 严谨作风 求实精神 予启发帮助 受益
非浅 导师学识渊博 执着敬业 易 永远学榜样 悉心指导
受益终生 导师学 工作生活微关心帮助 表示衷
心感谢
课题够利完成 检验科全体员力支持分开 特感谢检验科府
伟灵 薛强副 张雪老师热心指导力支持 感谢检验科全体仁予
力支持
感谢西南医院血液科陈龙硕士 乳腺中心唐波硕士 分泌科彭勇硕士提供细胞
株 感谢西南医院检验科张兵硕士 黄庆硕士 MSP 方法热心指教 感谢西南
医院检验科杨新硕士 公衍文硕士 李维博士分子生物学方法帮助
未提予帮助 支持关心事 学 亲友 表示感谢
衷心感谢私帮助朋友
第三军医学硕士学位文
55
片
第三军医学硕士学位文
56
Photo 1 leukemia cell
Photo 2 conglutination cell
第三军医学硕士学位文
57
Photo 3 Gel electrophoresis of RNA formaldehyde degeneration
Photo 4 DNA electrophoresis
28S
18S
5S
第三军医学硕士学位文
58
1 2 3 4 5 6
2000
1000
750
ASPP1 500
actin
250
100
1 HEPG2 2MCF7 3A549 4Fibroblast cell 5Blood monocyte 6Marker
Photo 5 Agarose gel analysis of ASPP1 gene RTPCR production
1 2 3 4 5 6
ASPP1
actin
1HL60 2K562 3Jurkat 4HT29 5HCT116 6Marker
Photo 6 Agarose gel analysis of ASPP1 gene RTPCR production
2000
1000
750
500
250
100
第三军医学硕士学位文
59
1 2 3 4 5
actin
ASPP2
1 Fibroblast cell 2Blood monocyte 3HL60 4K562 5Marker
Photo 7 Agarose gel analysis of ASPP2 gene RTPCR production
1 2 3 4 5 6 7 8
1Jurkat 2HEPG2 3MCF7 4HCT116 5HT29 6A549
7 actin 8Marker
Photo 8 Agarose gel analysis of ASPP2 gene RTPCR production
2000
1000
750
500
250
100
2000
1000
750
500
250
100
第三军医学硕士学位文
60
1 2 3 4 5
actin
iASPP
1Blood monocyte 2fibroblast cell 3HL60 4K562 5Marker
Photo 9 Agarose gel analysis of iASPP gene RTPCR production
1 2 3 4 5 6
actin
iASPP
1A549 2HT29 3HCT116 4MCF7 5HEPG2 6Marker
Photo 10 Agarose gel analysis of iASPP gene RTPCR production
2000
1000
750
500
250
100
2000
1000
750
500
250
100
第三军医学硕士学位文
61
M U M U M L
1 2 3 4 5 6
12HEPG2 34MCF7 5A549 6Marker
M methylated bands U unmethylated bands L Marker
Photo 11 Methylation status of ASPP1 in tumor cell
U M U M U M L
1 2 3 4 5 6 7
M methylated bands U unmethylated bands 7 Marker
Photo 12 Methylation status of ASPP1 in fibroblast cell
2000
1000
750
500
250
100
2000
1000
750
500
250
100
第三军医学硕士学位文
62
U M U M U M L
1 2 3 4 5 6 7
12HEPG2 34MCF7 56A549 7Marker
M methylated bands U unmethylated bands L Marker
Photo 13 Methylation status of ASPP2in tumor cell
U M U M U L
1 2 3 4 5 6
M methylated bands U unmethylated bands 6 Marker
Photo 14 Methylation status of ASPP2 in fibroblast cell
2000
1000
750
500
250
100
2000
1000
750
500
250
100
第三军医学硕士学位文
63
参考文献
1 Kerr JF Shrinkage necrosis a distinct form of cellular death J Dathol 1971 1051320
2 Kerr JF Willie AH and Currie AR Apoptosis a basic biological phenomenon with
widergrging implications in tissue kinetics Br J Cancer 1972 26 239257
3 Vaux DL et al The molecular biology of apoptosis Proc Natl Sci USA 1996
9322392244
4 Ameisen JC The origin of programmed cell death Science 1996 27212781279
5 Jamerson MH Johnson MD and Dickson RB Dual regulation of proliferation and
apoptosis cmyc in bitransgenic murine mammary tumor models Oncogene 2000
10651071
6 Bergamaschi D Samuels Y Jin B Duraisingham S Crook T Lu X ASPP1 and
ASPP2 common activators of p53 family members Mol Cell Biol 2004 Feb
24(3)134150
7 SamuelsLev Y Lu X et al ASPP proteins specificially stimulate the apoptotic function
of P53 Molecular Cell 2001 8 781794
8 Bergamaschi D Samuels Y Lu X et al iASPP oncoprotein is a key inhibitor of p53
conserved from worm to human Nature genetics 2003 33162167
9 Lane D Cancer How cells choose to die Nature 2001 414 2527
10 Rush LJ Plash CAlterations of methylation in hematologic malignancies Can Lett
2002 185112
11 Costello JF Fruhwald MC et al Aberrant CpGisland methylation has nonrandom and
tumourtypespecific patterns [J] Nat Genet 2000 24(2) 132138
12 Herman JG Graff JG Myohanen S et al Methylationspecific PCR a novel PCR assay
for methylation status of CpG islands Proc Natl Acad Sci U SA 1996 93 9821–9826
13 Levine A p53 The cellular gatekeeper for growth and division Cell 1997 88
323331
14 Fujimoto K Yamada Y Okajima E et al Frequent association of p53 gene mutation in
bladder cancer Cancer Res 1992 52 1393
15 Yuzhi Chen Wenyun Liu Louie Naumovski et al ASPP2 inhibits APPBP1mediated
NEDD8 conjugation to cullin1 and decrease APPBP1induced cell proliferation and
第三军医学硕士学位文
64
neuronal apoptosis Neurochem 2003 85 801809
16 Derry WB Putzke AP et al Caenorhabditis elegans p53 role in apoptosis meiosis and
stress resistance Science 2001 294 591595
17 Schumacher B Hofmann K et al The Celegans homolog of the p53 tumor suppressor
is required for DNA damageinduce apoptosis Curr Biol 2001 11 17221727
18 Levine AJ Momand J Finlay A The p53 tumor suppressor gene Nature 1991 351
453
19 Lamb P Crauford L Characterization of human p53 gene Mol Cell Biol 1986 61379
20 Johnson P Chung S Benchimol S Growth suppression of Friendvirustransformed
erythroleukemia cell by p53 protein is accompanied by hemoglobin production and is
sensitive to erythropoietin Mol Cell Biol 1993 13 1456
21 Vojtesek B Lane DP Regulation of p53 protein expression in human breast cancer cell
lines J Cell Sci 1993 105 607
22 Merol GR p53dependent and p53independent activation of apoptosis in mammary
epithelial cell reveals a survival function of EPG and insulin J Cell Biel 1995 128(6)
1185
23 Chen X Ko LJ Jayaraman L Prives C et al p53 levels functional domains and DNA
damage determine the extent of the apoptotic response of tumor cells Genes Dev1996
10(19) 24382451
24 Smart P Lane EB Lane DP et al Effects on normal fibroblasts and neuroblastoma cells
of the activation of the p53 response by the nuclear export inhibitor leptomycin B
Oncogene 199918(15) 73787386
25 Ludwig RL Bates S Vousden KH et al Differential activation of target cellular
promoters by p53 mutants with impaired apoptotic function Mol Cell Biol 1996
16(9) 49524960
26 Saller E Tom E Brunori M et al Increased apoptosis induction by 121F mutant p53
EMBO J 1999 18(16) 44244437
27 Caelles C Helmberg A Karin M p 53dependent apoptosis is in the absence of
trascriprional activator of p53target genes Nature (Lond) 1994 370 29016
28 Jia LQ Osada M Ishioka C Gamo M Ikawa S Suzuki T et al Screening the p53
status of human cell lines using a yeast functional assay Mol Carcinog 1997
第三军医学硕士学位文
65
Aug19(4)24353
29 饶进军 朱正光 E1B 缺陷性腺病毒 p53 缺失性白血病细胞作 第军医
学学报 200121(11)819821
30 Rodrigues NR Rowan A Smith ME Kerr IB et al p53 mutations in colorectal cancer
Proc Natl Acad Sci U S A 1990 87(19) 75557559
31 Mancuso T Aguilar F Pescarolo MP Clerico L Russo P Parodi S Mutation
frequencies at codon 248 of the p53 tumour suppressor gene are not increased in colon
cancer cell lines with the RER+ phenotype Nucleic Acids Res 1997 September 15 25
(18) 3643–3648
32 Lossos IS Natkunam Y et al Apoptosis stimulating protein of P53(ASPP2) expression
differs in diffuse large Bcell and follicular center lymphoma correlation with clinical
outcome Leukemia Lymphoma 2002 43(12) 23092317
33 Robertson KD DNA methylation methyltransferases and cancer Oncogene 2001 20
313955
34 Costello JF Fruhwald MC et al Aberrant CpGisland methylation has nonrandom and
tumourtypespecific patterns [J] Nat Genet 2000 24(2) 132138
35 Liu ZJMaekawa MPolymerase chain reactionbased methods of DNA methylation
analysis Analy Boch2003
36 Hatada I Hayashizaki Y Hirotsune S et al A genomic scanning method for higher
organisms using restriction sites as landmarks Proc Natl Acad Sci USA 1991
889523–9527
37 Jones PA Laird PW Cancer epigenetics comes of age Nat Genet 1999 21 1637
38 Wajed Shahjehan A Laird P et al DNA Methylation An Alternative Pathway to
Cancer Ann Surg 2001 234(1) 1020
39 Greenblat MS Bennett WP Hollstein M et al Mutation in the p53 tumor suppressor
genelocus to cancer etiology and molecular pathogenesis[J]Cancer
Res19945448554875
40 Soengas MS Capodieci PPolsky D et al Inactivation of the apoptosis effector Aapaf1
in malignant melanomaNature2001409(6817)207211
41 Gonzalgo ML Jones PA Rapid quantitation of methylation differences at specific sites
using methylationsensitive single nucleotide primer extension (MsSNuPE) Nucl
第三军医学硕士学位文
66
Acids Res 1997 25 252931
42 Xiong Z Laird PW COBRA a sensitive and quantitative DNA methylation assay Nucl
Acids Res 1997 25 25324
43 Aggerholm A Guldberg P Hokland M Hokland P Extensive intra and interindividual
heterogeneity of p15INK4B methylation in acute myeloid leukemia Cancer Res 1999 59
43641
44 Baumer A Wiedemann U Hergersberg M Schinzel A A novel MSPDHPLC method
for the investigation of the methylation status of imprinted genes enables the molecular
detection of low cell mosaicisms Hum Mutat 2001 17 42330
45 Bender CM Pao MM Jones PA Inhibition of DNA methylation by
5Aza2’deoxycytidine suppress the growth of human tumor cell line [J] Cancer Res
1998 5895
46 Liu ZJ Maekawa MPolymerase chain reactionbased methods of DNA methylation
analysis Analy Boch2003 317(2) 259265
47 Liu ZJ Maekawa M Horri T et al The multiple promoter methylation profile of PR
gene and ERalpha gene in tumor cell lines Life Sci 200373 196372
第三军医学硕士学位文
67
文献综述
ASPP 家族 p53 相互作细胞凋亡研究进展
摘 肿瘤形成原癌基抑癌基遗传性变化增加 丢失 突变 逐
步积累程 时 肿瘤遗传素天素作子疾病 p53
肿瘤抑制蛋白 首先通影响编码细胞周期相关蛋白质基表达调控细
胞周期 G1 停滞 时会 DNA 损伤增 诱导细胞发生细胞凋亡 p53
诱导细胞凋亡机制年直太清楚 发现 ASPP(apoptosis stimulating
protein of p53)蛋白家族 p53 诱导细胞凋亡机制研究新进展 ASPP 蛋白
家族 p53 作特异性增强 p53 细胞凋亡功 p53 细胞生长停滞
功没作 ASPP 蛋白家族增强 p53 细胞凋亡功通增强 p53 促凋亡
基启动子 DNA 结合促进细胞凋亡 文作综述
关键词 ASPP 细胞凋亡 p53
细胞凋亡前生命科学研究热门领域 根美国 ISI(Information Sciences
Institute) SCI 录引文关键词检索发现 全球然科学研究中文发表集
中三领域分细胞信号转导 细胞凋亡基组研究 年着细胞凋亡
领域深入研究 许机制正逐步阐明 发现许重信号分子信号事件
p53 Bcl2 家族 线粒体通透性改变[1] 细胞素 C 等
细胞凋亡程中 p53 蛋白起着关重作 p53 肿瘤抑制蛋白
质种核磷酸蛋白 首先通影响编码细胞周期相关蛋白质基表达调
控细胞周期 G1 停滞 时会 DNA 损伤增 诱导细胞发生细胞凋亡
细胞周期停滞(cell cycle arrest)指正常细胞受素影响时 动停止细胞周
期某阶段 消受利素 细胞调亡(apoptosis)[23]称程序性细胞
死亡(programmed cell death) 细胞机体保持身组织稳定 调控身细胞
增殖死亡间衡 基控制细胞动性死亡程[4] 质膜发泡 细
胞质固缩 核染色体裂解调亡体形成特征 病理情况细胞坏死
质区 p53 野生型产生肿瘤机制 目前清楚 ASPP
家族发现机制更深入研究 ASPP(apoptosis stimulating protein of p53)[5]
第三军医学硕士学位文
68
蛋白质家族 成员 ASPP1 ASPP2 iASPP 三 p53 形成复合物
p53 诱导细胞凋亡作
1 p53 结构功
类 p53 基定位 17p 131 长度约 20Kb 11 外显子 10 含子组成
第 1 外显子编码 外显子 2 4 5 7 8 分编码 5 进化高度保守结构域
5 高度保守区 1319 117142 171192 236258 270286 编码区 p53 蛋
白 393氨基酸组成 分子量53x103 P53蛋白分N末端酸性转录活化区(150
位氨基酸) 信号区(6094 位氨基酸) 中央核心 DNA 连接区(100290 位氨基酸) 源
寡聚(Oligomarization)区(323355 位氨基酸) C末端非专 DNA 结合区(100290 位
氨基酸) 结构区 p53 识转录活化靶基程中发挥着重作[6] p53
肿瘤抑制蛋白属蛋白质家族 相关蛋白质 p73 p51 P73 转
录活化区 核心 DNA 连接区寡聚区 p53 高度相似性[7] p53 p73 转录
活化区 29相 核心 DNA 连接区 63相 寡聚 38相 P51
染色体 3q278 区发现 p 53 基源体 发现者分命名
Ket(鼠) p40 p63 p73L[811] p53 较 p73 p51 蛋白结构更接
结构功关联 p51 p73 细胞正常发展凋亡中起重作
[12] p53 阻止肿瘤细胞生长 p53 激活恶性相关刺激信号
反映 结果抑制肿瘤细胞生长[13]
P53 蛋白家熟悉肿瘤抑制物 控制蠕虫 果蝇类等数动
物细胞数[1415] 组织中广泛表达 P53 稳定染色体 DNA 方面充 基组
卫士 (guardian of genome) 分子警察 (molecular policeman)角色 细胞 DNA 受
第三军医学硕士学位文
69
辐射等素损伤时 p53 N末端会磷酸化影响 DNA HDM2 结合
力[16] 激活 诱导细胞生长停滞 细胞衰老 分化 细胞凋亡介导 DNA 修复
[1719] 损伤细胞处 G1 期 p53 触发细胞周期限制点 果 DNA 损伤细胞已
进入 S 期 p53 触发细胞凋亡 果 DNA 损伤细胞已进入 S 期 p53 触
发细胞凋亡 P53 蛋白通靶基 p21WAF1CIP1 抑制周期赖性激酶诱导 G1S 阻滞
阻止细胞 G1 期进入 S 期 通 1433sigma[20]抑制 Cdc25c 参 G2M 关卡
调控[21] 说 p53 通诱导 WAF1CIP1 1433sigma 等抑癌基表达 抑
制细胞生长 细胞周期停滞 时 p53 诱导 mdm2 基表达 mdm2 蛋白 修补
损伤细胞 DNA 细胞新进入细胞周期正常生长 P53 蛋白通调靶基 bax
IGFBP3 抑制 bcl2 基 调控细胞凋亡 维持基组遗传学稳定性[22] 行
抑癌基功
2 p53 灭活机制
床许肿瘤发生 p53 蛋白功丧失 p53 蛋白功丧失机
制许种 包括 p53 基损伤 p53 基身突变 p53 游调节子突
变等 P53 正常功丧失方式基突变 迄已发现 10 000 种类肿瘤
2 500 种基突变 p53 蛋白 393 氨基酸 280 发现突变[23] 通肿瘤中
量突变体分析 证实部分突变位 4 突变热点错义突变 4 突变
热点氨基酸 129146 171179 234260 270287 正应 p53 基进化
第三军医学硕士学位文
70
保守区段 p53 肿瘤中相关突变区域性点突变 导致单氨基酸改变
p53 高突变密码子中 28突变仅影响 p53 175 245 248 249 273
282 六氨基酸残基 单氨基酸改变导致 p53 失效 引起异常 p53 蛋白表达
种异常 p53 蛋白野生型 p53 蛋白更稳定 肿瘤细胞中高水表达
推测异常 p53 蛋白相四聚体 作野生型 p53 蛋白区域阴性抑制子[24]
许肿瘤分析结果发现 半数肿瘤中 p53 突变 p53 突变 5发生
调节区 95发生中心区域 研究发现 p53 核心区域外突变 p53
丧失细胞凋亡功中起重作[2526] 表明 p53 基座突变研究解 p53
抑癌机制更意义
某情况 p53 抑癌功丧失 Rb p16 BRCA1 BRCA2 等抑癌基
异常引起 时 p53 抑制蛋白度表达 p53 刺激子缺乏等引
起 p53 抑癌功丧失 外 蛋白质 p53 蛋白作 导致正常生物学
第三军医学硕士学位文
71
功丧失 例癌蛋白 HPVE6 p53 结合启动细胞蛋白酶降解 p53
SV40LT Ag 阻断 p53 DNA 结合区 腺病毒 EIB55K 蛋白阻断 p53 转录活化
区 癌基产物 Mdm 2p300 复合物参 p53 蛋白稳定性调节 异常扩增
干扰 p53 正常功[2728] 时研究发现 p53 某癌基产生刺激反应
受 p 14ARF 蛋白影响 许癌基诱导 p14ARF p14ARF 拮抗
Mdm2(HDM2) p 53 作[2932]
3 ASPP 家族结构功
2001 年 英国帝国癌症研究抑癌基研究室卢欣教授领导研究组发现
新蛋白家族─ASPP(apoptosis stimulating protein of p53) 目前已鉴定家族成员
第三军医学硕士学位文
72
ASPP1 ASPP2 iASPP(inhibitory member of the ASPP family)[33] 该家族结构
特点 SH3 结构域 量锚蛋白重复 丰富谷氨基结构域
ASPP 命名 ankyrin repeat SH3 domain prolinerich domain containing proteins
缩写
ASPP1 PPP1R13B 基编码 1090 氨基酸组成蛋白质 功性氨
基酸区域 pro ank SH3 组成 p53BP2Bbp 源性蛋白质 ASPP1 C
末端 948 氨基酸 KIAA0771 蛋白相 377氨基酸 p53BP2 相
ASPP2 p53BP2 编码 1128 氨基酸组成蛋白质 功性氨基酸区域
pro ank SH3 helical 组成 ASPP2 编码 1128 氨基酸蛋白延伸 1005
氨基酸 p53BP2 ASPP1 ASPP2 蛋白 N末端 C末端相似性
MMPM 序列开始 蛋氨酸开始转录[5] Chen YuZhi[[33]等研究
发现 ASPP2 够抑制 APPBP1 拯救 ts41 细胞突变力 时阻止 APPBP1
诱导神细胞凋亡 ASPP1 ASPP2 减弱 Ras Ras+E7 Ras+E1A 等原癌蛋白
转化潜 ASPP1 ASPP2 促进 p53 细胞凋亡功特异 功
增强 p53 DNA 结合 促进 p53 凋亡基启动子活化 增强 p53 细胞凋亡功
细胞程序性死亡(programmed cell death PCD) 清机体余细胞 ASPP1
ASPP2 野生型 p53 结合 突变型 p53 结合 突变型 53 结
合力野生型 p53 结合力弱 肿瘤发生程中 p53 序列旦突变
ASPP1 ASPP2 结合 阻止 p53 诱导细胞凋亡
iASPP 类 PPP1R13L 基编码 线虫中 ape1(apoptotic enhancer
1)基编码[34] 315 氨基酸组成 p65 A结合蛋白 C末端 223
氨基酸 53BP2 C末端 52相 iASPP CeiASPP(Celegans iASPP)
C末端 ASPP1 ASPP2 C末端广泛相似性[34] iASPP Ras E1A
E7 合作癌蛋白 iASPP 表达增强 Ras Ras+E7 Ras+E1A 转化活性
增强突变 Ras p53 Ras+p53H175 Ras+p53L173 转化活性[34] 功
p53 p53H175 p53L173 突变 ASPP1 ASPP2 竞争性 p53 结合
位点结合 抑制 p53 抑癌功 野生型 p53 ASPP 表达水正常乳腺
癌中高表达 CeiASPP 通抑制 Cep53 促凋亡活性抑制 Cep53 凋亡功
[3536]
4 ASPP 家族 p53 结合细胞凋亡关系
p53 肿瘤抑制蛋白 功诱导细胞凋亡细胞生长停滞 目前止
第三军医学硕士学位文
73
已三种推测解释细胞 p53 影响选择凋亡分裂停滞 第种剂
量反应模型 低水 p53 诱导产生细胞停滞 高水 p53 启动细胞凋亡[37] 第
二种 细胞背景 (cellbackground)假设认细胞 p53 反应细胞周围环境决定
细胞表达高水抗凋亡基更历生长停滞凋亡[38] 第三
种推测认 p53 作靶基启动子 p53 种修饰形式识[3940]
ASPP 家族发现支持第三种推测 启动子特异模型 ASPP 蛋白家族 p53 作
特异性增强 p53 细胞凋亡功 p53 细胞生长停滞功没作
ASPP 蛋白家族增强 p53 细胞凋亡功通增强 p53 促凋亡基启动子 DNA
结合促进细胞凋亡 ASPP 蛋白家族发现解什突变 p53
DNA 结合 发挥功 突变 p53 ASPP 蛋白结合
发挥功 变异细胞死亡[41] 许肿瘤中发现 p53 突变残基 亮氨基酸
半胱氨基酸残基 够 ASPP1 ASPP2 作促进 Bax 启动子激活
诱导细胞凋亡
研究 ASPP 家族 p53 结合细胞凋亡影响 许肿瘤细胞株
床标做研究 Xin Lu 等[34]野生型 p53 乳腺癌 ASPP1 ASPP2 mRNA
表达研究发现 60肿瘤 ASPP1 表达水降 23肿瘤 ASPP2 表达水
降 23肿瘤中 90 ASPP1 表达水降 时细胞表面标
记物 CD20 流式细胞仪(FACS)等技术 293 JW2 Tero Saos2 等细胞株作研究
发现 ASPP1 ASPP2 P53 表达 转染肿瘤细胞株 50凋亡 ASPP1
ASPP2 E2F1 Bax 等抑癌基表达细胞凋亡增加 Izidore SLossos
等[42] RTPCR 免疫组化等方法弥漫性 B 淋巴细胞瘤(DLBCL)滤泡性淋巴瘤
(FCL)等研究 发现 ASPP2 表达高患者存活时间长 ASPP2 表达低患者存
活时间短 Daniele Bergamaschi 等[34]检测八例野生型 P53 ASPP 水正常乳腺
癌患者 iASPP 含量 结果七例患者 iASPP 含量较高
研究证明 ASPP 蛋白体 p53 关键调节蛋白 ASPP1 ASPP2 通
提高原凋亡基活力促进 p53 赖细胞死亡 ASPP 家族 p53 作总机制
ASPP p53 结合形成 ASPPp53 复合物作原凋亡基启动子 ASPP 微变化
引起 p53 结合 DNA 力发生改变 影响 p53 诱导凋亡力 细胞根
p53 蛋白停滞基结合凋亡基结合活力做出细胞停滞细胞凋亡
决定[43] iASPP ASPP1 ASPP2竞争 p53 结合位点 影响 ASPPp53
复合物 DNA 结合力 阻止 p53 细胞凋亡功
第三军医学硕士学位文
74
p53 蛋白功示意图
a 般情况 p53 识涉细胞停滞基启动子区域 诱导细胞分裂停滞
修复损伤细胞 DNA
b ASPP 蛋白 p53 结合形成 ASPPp53 复合物时 整复合物便倾诱
导凋亡基启动子相作 诱导细胞凋亡
5 结束语
p53 许肿瘤发生 发展起重作 ASPP 家族许研究中表
明 p53 作独立 特异 ASPP 家族基功进步研究
解调控机制 治疗肿瘤开辟广阔前景
第三军医学硕士学位文
75
参考文献
1 Lin QS Mitochondria and apoptosis Acta Biochimica et Biophyscia Sinica 199331(2)
116118
2 Kerr JF Shrinkage necrosis a distinct form of cellular death J Dathol 1971 1051320
3 Kerr JF Willie AH and Currie AR Apoptosis a basic biological phenomenon with
widergrging implications in tissue kinetics Br J Cancer 1972 26 239257
4 Vaux DL Toward and understanding of the molecular methanisma of physiological cell
death Proc Natl Acad Sci USA 1993 90786
5 SamuelsLev Y Lu X et al ASPP proteins specificially stimulate the apoptotic
function of P53 Molecular Cell 2001 8 781794
6 Kaghad M Bonnet H Yang A et al Monoallelically expressed gene related to p53 at
1p36 a region frequently deleted in neuroblastoma and other human cancers Cell
1997 90(40 809819
7 Jost CA Marin MC Kaelin WG et al p73 is a human p53related protein that can
induce apoptosis Nature 1997 389(6647)191194
8 Trink B Okami K Wu L et al A new human p53 homologue Nat Med 19984(7)
747748
9 Osada M Ohba M Kawahara C et al Cloning and functional analysis of human p53
which structurally and functionally resembles p53 Nat Med 1998 4(7) 839843
10 Senoo M Seki N Ohira M et al A second p53related protein p73L with high
homology to p73 Biochem Biophy Res Commun 1998 248(30 603607
11 Yang A Kaghad M Wang Y et al p63 a p53 homology at 3q2729 encodes multiple
products with transactivating death inducing and dominantnegative activities Mol
Cell 1998 2(3) 305316
12 Irwin MS Hueber A Baum W et al P53 family update p73 and p63 develop their own
identities Cell Growth Differ 2001 12 337349
13 Balint E Vousden KH Activation and activities of the p53 tumor suppressor protein
BrJCancer 2002 85 18131823
14 Vogelstein B Lane D Levine AJ et al Surfing the p53 network Nature 2000(6810)
第三军医学硕士学位文
76
408 307310
15 Derry WB Putzke AP Rothman JH et al Caenorhabditis elegans p53 role in apoptosis
meiosis and stress resistance Science 2001 294 591595
16 Woo RA Mclure KG LeesMiller SP et al DNA dependent protein kinase acts
upstream of p53 in response to DNA damage Nature 1998 394(6694) 700704
17 Ko L Prives C p53 Puzzle and paradigm Genes and Development 199610
10541072
18 Ford JM Hanawalt PC et al Role of DNA excision repair gene defects in the etiology
of cancer Current Topics Microbiology and Immunology 1997 221 4770
19 Hermeking H Lengauer C Polyak K et al 1433 sigma is a p53regulated inhibitor of
G2M progression Mol Cell 1997 1(1) 311
20 Peng CY Graves PR Thomas RS et al Mitotic and G2 checkpoint control regulation
of 1433 protein binging by phosphorylation of Cdc25c on serine216 Science 1997
277(5331) 15011505
21 Levine A p53 The cellular gatekeeper for growth and division Cell 1997 88
323331
22 Pfeifer GP Denissenko MF Formation and repair of DNA lesions in the p53 gene
relation to cancer mutations Environ Mol Mutagen 1998 31(3) 197205
23 Lomax ME et al Two functional assays employed to detect an unusual mutation in the
oligomerisation domain of p53 in a LIFraumenilike family Oncogene 1997 14
18691823
24 Digiammarino EL et al A novel mechanism of tumorigenesis involving pHdependent
destailization of a mutant p53 tetramer Nature StructBiol 2002 9 1216
25 de Vries A et al Targeted point mutations of P53 lead to dominant negative inhibition
of wildtype p53 function ProcNatlAcadSciUSA 2002 99 29482953
26 Storey A Thomas M Kalita A et al Role of a p53 polymorphism in the development
of human papillomaviruaassociated cancer Nature 1998 393(6682) 229234
27 Grossman SR Perez M Kung AL et al p300MDM2 complexes participate in
MDM2mediated p53 degradation Mol cell 1998 2(4) 405415
28 Zhang Y Xiong Y Yarbrough WG et al ARF promotes MDM2 degradation and
stabilizes p53 ARFINK4a locus deletion impairs both the Rb and p53 tumor
第三军医学硕士学位文
77
suppression pathways Cell 1998 92(6)725732
29 Pomerantz J Schreiber AN Liegeois N et al The Ink4a tumor suppressor gene product
p19 Arf interacts with MDM2 and neutralizes MDM2’s inhibition of p53 Cell 1998
92(6) 713723
30 Bates S Phillips AC Clark PA et al p14ARF links the tumor suppressors RB and p53
Nature 1998 395(6698) 124125
31 Palmero I Pntoja C Serrano M p19ARF links the tumor suppressor p53 to RAS
Nature 1998 395(6698) 125126
32 Yuzhi Chen Wenyun Liu Louie Naumovski et al ASPP2 inhibits APPBP1mediated
NEDD8 conjugation to cullin1 and decrease APPBP1induced cell proliferation and
neuronal apoptosis Neurochem 2003 85 801809
33 Bergamaschi D Samuels Y Lu X et al iASPP oncoprotein is a key inhibitor of p53
conserved from worm to human Nature genetics 2003 33162167
34 Derry WB Putzke AP et al Caenorhabditis elegans p53 role in apoptosis meiosis and
stress resistance Science 2001 294 591595
35 Schumacher B Hofmann K et al The Celegans homolog of the p53 tumor suppressor
is required for DNA damageinduce apoptosis Curr Biol 2001 11 17221727
36 Chen X Ko LJ Jayaraman L Prives C et al p53 levels functional domains and DNA
damage determine the extent of the apoptotic response of tumor cells Genes Dev1996
10(19) 24382451
37 Smart P Lane EB Lane DP et al Effects on normal fibroblasts and neuroblastoma cells
of the activation of the p53 response by the nuclear export inhibitor leptomycin B
Oncogene 199918(15) 73787386
38 Ludwig RL Bates S Vousden KH et al Differential activation of target cellular
promoters by p53 mutants with impaired apoptotic function Mol Cell Biol 1996 16(9)
49524960
39 Saller E Tom E Brunori M et al Increased apoptosis induction by 121F mutant p53
EMBO J 1999 18(16) 44244437
40 Slee EA Lu X The ASPP family deciding between life and death after DNA damage
Toxicology Letters 2003 139 8187
41 Lossos IS Natkunam Y et al Apoptosis stimulating protein of p53(ASPP2) expression
第三军医学硕士学位文
78
differs in diffuse large Bcell and follicular center lymphoma correlation with clinical
outcome Leukemia Lymphoma 2002 43 23092317
42 Lane D Cancer How cells choose to die Nature 2001 414 2527
第三军医学硕士学位文
79
文献综述二
DNA 甲基化肿瘤研究进展
摘 细胞癌变阶段复杂程 包括原癌基激活抑癌基
失活 涉基基外种改变 时 细胞癌变遗传素天素
作子疾病 现发现表观性(epigenetic)机制肿瘤形成程中重作
DNA 甲基化表观性机制 发现肿瘤细胞总体甲基化水
低正常细胞 某 CpG 岛甲基化程度增高 DNA 启动子甲基化肿瘤相关
基转录失活重机制 X 染色体 基表达基组印迹中[ 1 ]起着重作
时 年研究发现 DNA 甲基化异常影响肿瘤发生 发展预
关键词 DNA 甲基化 肿瘤 基表达
1 DNA 甲基化基表达
11 DNA 甲基化甲基化
DNA 甲基化指生物体 DNA 甲基转移酶(DNA methyltransferase DMT)催化
s腺苷甲硫氨酸(SAM)甲基供体 甲基转移特定碱基程 DNA
甲基化时期短 通 DNA 甲基转移酶维持 目前知 维持 DNA 甲
基化酶两种 甲基转移酶 二重新甲基化转移酶 甲基化 CpG 点
重新甲基化 甲基化双链 DNA 复制生成双链中 母链携带甲基 子链非甲基
化 DNA 甲基转移酶识母链 5甲基胞嘧啶(5mC)
哺乳动物体存甲基化酶 种酶种糖基化酶 核酸切酶
甲基化酶 非特异甲基化特异基甲基化 DNA 甲基化
造成细胞基稳定原
12 DAN 甲基化基改变
DNA 甲基化助 5mC T 突变[ 2 ] DNA 甲基化引起基突变机制
DMT 催化反应形成 DMT 加快 C(胞嘧啶) 5mC 脱氨 封闭 U(尿嘧啶)修
复 U T 改变 DMT 促 CpG 序列 C T 突变[ 3 ] DNA 合成程中
DMT1 复制叉起作 半甲基化 DNA 变成全甲基化状态 保持基甲基化
外 DMT3a DMT3b 作催化甲基转移 裸露 DNA 获甲基化
第三军医学硕士学位文
80
肿瘤细胞中 DNMT1 DNMT3b 起作建立维持甲基化衡[4] 肿瘤
细胞 DNA 甲基化异常现表现 DNA 广泛低甲基化区域性高甲基化存
种组织 总甲基化力增强 DNA 甲基化改变直接间接影响基转录
通 5甲基胞嘧啶 NH3 诱发 C T(胸腺嘧啶)突变 5胞嘧啶甲基化改变
引起基表达异常 DNA 序基产物变
13 DNA 甲基化基错配修复
DNA 错配修复系统(DNA mismatch repair system MMR)指存类细胞中
种修复 DNA 碱基错配安全保障体系 系列特异修复 DNA 碱基错配酶分
子组成 Ahujia 等[ 5 ]研究发现 MMR 缺陷时 CpG 岛甲基化增强 认 MMR
DNA 甲基化关 基错配修复程中甲基化具导识作 错配修复基
表达缺陷原中基突变基启动子区高甲基化原[ 6 ]
14 DNA 甲基化基表达影响
基表达异常通基机制(genetic mechanism)表基机制(epigenetic
mechanism) 基机制包括基点突变 染色体重排 产生结构异常基产物 染
色体重组非 联结( nondisconjunction)导致隐性等位基表达 基放引起
度表达等 表基机制指 DNA5胞嘧啶甲基化改变 引起基表达异常
DNA 序基产物变 DNA 甲基化导致基突变 影响基表达 现
三种理解释 DNA 甲基化导致基突变 1 正常时保护鸟嘌呤突变
DNA 修复蛋白 MGMT(O(6)methylguanine DNA methyltransferase)甲基化缺乏
导致 GtoA 突变发生[ 7 ] 2 肿瘤形成程中氧基 DNA 损伤腺
嘌呤突变原 谷胱甘肽 S转移酶 1(Glutathione Stransferase P1 GTSP1)保
护作避免 GTSP1 启动子高甲基化 种保护作丧失 乳腺癌前
列腺癌中报道[ 8 ] 3 肿瘤基组低甲基化 染色体稳定性导致突
变率增加[ 9]
DNA 甲基化发育分化中调控基表达 时 DNA 甲基化基表达呈负
相关 启动子区低甲基化转录活性正相关(非启动子区甲基化例外) 基身
甲基化基表达弱负相关 基 CpG 岛甲基化干扰转录子基
调控区结合 DNA 甲基化直接抑制 RNA 聚合酶活性抑制基表达
时 甲基化 DNA 特异结合蛋白结合 DNA 甲基化改变染色质结构等
间接阻碍转录子 DNA 结合抑制转录 目前已证实 DNA 甲基化组蛋白乙
酰化呈正相关[ 10 ] 乙酰化调控基表达种重方式
第三军医学硕士学位文
81
2 甲基化肿瘤
DNA 甲基化种影响基表达机制 肿瘤发生着密切联系 DNA
甲基化状态改变致癌作关键素 肿瘤抑制基失活方式 通
基机制基外机制导致细胞增殖分化相关基表达异常 造成细胞失
正常程控制发生恶变形成肿瘤[11 ] 肿瘤细胞正常细胞较 DNA 甲基化模
式显著 基组低甲基化某特异性位点启动子 CpG 岛高甲基化存
[12] 肿瘤形成基遗传性模式原癌基度扩增抑癌基 沉寂 细胞
增殖衡受破坏导致细胞恶性状态 原癌基扩增低甲基化关 抑
癌基 沉寂 [13]高甲基化关
21 肿瘤细胞中 DNA 甲基化异常现
研究发现种肿瘤基组中 肿瘤细胞 DNA 存广泛低甲基化局部
区域高甲基化存现 总甲基化力增高 意义细胞生长分化
密切关系癌基抗癌基 肿瘤细胞非 CpG 岛普遍性低甲基化 肿瘤细胞中染
色体 11P 短臂 17P CpG 岛 3PCpG 岛出现区域高甲基化抑癌基高甲
基化 肿瘤早期出现症状前 肿瘤中基组甲基化程度普遍降低 Cmyc
raf Cfos CHras CKras 等基 时肿瘤中特异癌基低甲基化 肠癌
中 CKras 基 Cmyc 基第三外显子低度甲基化 正常细胞中完
全甲基化 肿瘤细胞中抑癌基启动子区高甲基化 抑制抑癌基转录
抑癌基失活 癌基充分甲基化导致基重新开放异常表达 抑癌基
度甲基化形成基突变靶点
22 DNA 甲基化改变癌变关系
肿瘤细胞中 DNA 甲基化衡 引起基表达遗传性改变 形成基
组稳定性分子基础 许肿瘤发现 DNA 低甲基化导致转甲基作程序
改变致癌基表达提高 细胞群体中 低甲基化细胞具形成肿瘤生长优势
DNA 甲基化促进低甲基化细胞克隆扩 启动子 CpG 岛甲基化基转录
失活定关系 果肿瘤抑制基细胞生长调节 分化 凋亡相关基发
生甲基化 甲基化肿瘤形成程中扮演重 角色 [ 1415]
类肿瘤中 P16 P15 基 5ˊCpG 岛重新甲基化基失活研究取重
进展 P16 等位基未发生点突变纯合性缺失类肿瘤细胞株中 出现
高例 P16 基 5ˊCpG 岛重新甲基化失转录活性 P16 基异常甲基化发
生类原发性肿瘤组织中 膀胱癌 头颈部鳞状细胞癌等[16] 时 P16 基
第三军医学硕士学位文
82
垂体肿瘤甲基化发生率高达 7080 P15 基 5ˊCpG 岛原发神胶质瘤白
血病中等易发生重新甲基化
白晓川[17 ]等研究发现 恶性肿瘤细胞中普遍存细胞降钙素基高甲基化
DNA 甲基转移活性增高 力[ 18 ] 等研究发现巴胺受体基 D4(DRD4)甲基化白血病
患者发生率明显高正常(P<005) 复发难治患者发生率高初治化疗
敏感患者 认 DRD4 基甲基化白血病发生 发展关 LiuM 等[19]
61 例急性淋巴细胞白血病(ALL) 7 例正常淋巴细胞 P75 基甲基化状态基
表达逆转录 PCR(RTPCR)方法检测发现 ALL 中 19 例 mRNA 未表达 正常淋
巴细胞中 P73mRNA 全表达 未表达 P73mRNA 基全高甲基化 正常细胞
P73 基没高甲基化 表明 T B 急性淋巴细胞白血病中 P73 失活白
血病发病机制 高甲基化 P73 失活机制 文格波[20]等发现 P53 基高甲基
化状态甲状腺癌 P53 基点突变关 Toyooka K O[ 21]等检测乳腺癌肺癌
启动子甲基化状态发现 原发性乳腺癌中 33(18 of 55)CDH13 启动子发生异常甲
基化 肺癌中 43(18 of 42)发生异常甲基化 表明 CDH13 异常甲基化乳腺癌肺
癌发生机制 研究表明 DNA 甲基化肿瘤基产生点突变原
DNA 甲基化癌变关系方面 组织通机制导致癌变
抑癌基某细胞生长调控甲基化状态深入研究 助进步认识肿瘤形
成机制
3 展
肖文华[22]等肝癌细胞研究中发现 Cmyc 基低甲基化状态反映肝癌恶
性程度 助判断病预 房静远等胃癌细胞 DNA 甲基化组织病理变化
研究中发现 DNA 甲基化水降幅度肿瘤细胞浸润深度组织学类型关
肿瘤体形态 胃周淋巴结受浸情况肿瘤细胞分化程度关 肿瘤 DNA
作甲基化状态分析作肿瘤预兆 例 编码 DNA 修复基 MGMT 启动子
高甲基化作肿瘤烷化药物治疗预测标记物[ 23 ] 血清中出现游离肿
瘤 DNA 作肿瘤治疗监测种手段 游离 DNA 甲基化检测作肿瘤形成
程药物治疗监测手段
表明 DNA 异常甲基化发生频率高分子作床监控病程评估疗效较
指标 时 DNA 异常甲基化发生频率高分子成肿瘤早期诊断肿瘤标志
物 癌症防治 防止癌变早期基组稳定性发生 减少肿瘤易感性突
变 达癌症早期预防
第三军医学硕士学位文
83
参考文献
1 Lyon MF Imprinting and Xchromosome inactivation Result Probl Cell Differ 1999
25(8)7390
2 Laird PW Jaenish R The role of DNA methylation in cancer genetics and epigenetics
Aunn Res Genet 1996(9) 30441464
3 Bender CM Zingg JM Jones PA DNA methylation as a target for drug design[J]
Pharm aceutical Res 1998 15(2) 175187
4 Bestor TH Hum Mol Genet 2000 9 2395402
5 Ahujia N et al Aging and DNA methylation in colorectal mucosa and cancer Cancer
Res 1998 58(23) 548994
6 Wheeler JM Beck NE Kim HC et al Mechanisms of inactivation of mismatch repair
genes in human colorectal cancer cell lines the predominant role of Hmlh1
ProcNatlAcadSciUSA 1999 96(18)1029610301
7 Esteller M Toyota M SanchezCespedes M et al Inactivation of the DNA repair gene
O6methylguanineDNA methyltransferase by promoter hypermethylation is associated
with G to A mutations in Kras in colorectal tumorigenesis Cancer Res 2000 60
23682371
8 Esteller M Corn PG Urena JM et al Inactivation of glutathione Stransferase P1 gene
by promoter hypermethylation in human neoplasia Cancer Res 1998 58 45154518
9 Chen RZ Pettersson U Beard C et al DNA hypomethylation leads to elevated
mutation rates Nature 1998 395 8993
10 Ng H H Bird A DNA methylation and chromatin modification[J] Curr Opin Genet
Dev 1999 9 (2) 158163
11 Costello JF Fruhwald MC et al Aberrant CpGisland methylation has nonrandom and
tumourtypespecific patterns[J] Nat Genet 2000 24(2) 132138
12 Robertson KD DNA methylation methyltransferases and cancer Oncogene 2001 20
313955
13 Wade PA Methyl CpG binding proteins coupling chromatin architecture to gene
regulation Oncogene 2001 20 316673
第三军医学硕士学位文
84
14 Costello JF and Plass C Methylation matters J Med Genet 2001 38285–303
15 Baylin SB and Herman JG DNA hypermethylation in tumorigenesis epigenetics joins
genetics Trends Genet 2000 16168–174
16 Cody DT Huang Y et al Differential DNA methylation of the P16 INK4ACDKA2A
promoter in human oral cancer cells and normal human oral kerarinocytes Oral Oncol
1999 35(5)516522
17 白晓川 白志勇 武淑兰等 8 种肿瘤细胞系降钙素甲基化模式甲基转移酶
活性关系 癌症 2001 20(2) 156159
18 力 王全 顾 群等 白血病细胞巴胺受体基甲基化研究 军医进修学
院学报 2000 21(1) 6264
19 Liu M Taketani T Li R et al Loss of P73 gene expression in lymphoid cell lines is
associated with hypermethylation[J] Leuk Res 2001 25 (6) 441447
20 文格波 曹仁贤 前 甲状腺癌P53 基甲基化研究[J]中国癌症杂志 1998
8(4) 280282
21 Toyooka KO Toyooka S Virmani AK et al Loss of expression and methylation of the
CDH13 (Hcadherin) gene in breast and lung carcinomas[J] Cancer Res 2001 61(11)
45564560
22 肖文华 刘文缢 肝细胞癌 17p133 位占 CpG 岛甲基化状态分析意义 中
华医学遗传学杂志 1997 14(5) 297299
23 Esteller M GarciaFoncillas J Andion E et al Inactivation of the DNArepair gene
MGMT and the clinical response of gliomas to alkylating agents N Engl J Med 2000
343 13504
第三军医学硕士学位文
85
读硕士期间发表文章
1 张云 刘泽军 DNA 甲基化肿瘤研究进展 医学综述 2003 9(7) 423424
2 张云 刘泽军 李维 杨丽华 等 肿瘤细胞中 ASPP2 mRNA 表达意义 第三
军医学学报 2003 25(23) 21032105
3 张云 刘泽军 卢欣 P53 促凋亡蛋白家族 p53 相互作细胞凋亡研究进
展 中国新医药杂志 2004 3(1) 15
4 张云 刘泽军 DNA 甲基化 PCR 扩增失败原分析体会 中国新医药杂志
2004 3(2) 45
5 张 云 张晓兵 杨 新 张 雪 刘泽军等 ASPP1 基启动子 CpG 岛甲基化检测
方法实验初探 中华医学 (刊)
6 张 云 刘泽军 李 维 杨丽华 ASPP1 基 mRNA 肿瘤细胞株中表达初
探 重庆医学 (刊)
7 张 云 刘泽军 MSP 网线免费引物设计介绍 中华检验杂志 (刊)
8 刘泽军 张 云 张晓兵 杨 新 Abnormal mRNA expression of ASPP members in
leukemia cell lines Leukemia 2004 18(2)880
9 张云 刘泽军 Advance in tumor diagnosis of telomerase research Chinese
Joural of Medicine and Clinical Science 2002 3(5) 293295
《香当网》用户分享的内容，不代表《香当网》观点或立场，请自行判断内容的真实性和可靠性！
该内容是文档的文本内容，更好的格式请下载文档